第4章-中药制剂的含量测定

1、 第四章第四章 中药制剂的含量测定中药制剂的含量测定本章重点：本章重点：1 1、掌握中药制剂含量测定的样品前处理方法及测定方、掌握中药制剂含量测定的样品前处理方法及测定方法的效能指标。法的效能指标。2 2、掌握可见、掌握可见- -紫外分光光度法、薄层扫描法、高效液紫外分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法和气相色谱法在中药制剂分析中的应用。相色谱法和气相色谱法在中药制剂分析中的应用。3 3、了解荧光分析法和原子吸收分光光度法在中药制剂、了解荧光分析法和原子吸收分光光度法在中药制剂分析中的应用。分析中的应用。含量测定：含量测定：是中药制剂质量控制的重要指标。是中药制剂质量控制的重要指标。含量测定

2、目的：含量测定目的：通过研究制剂中某种成分的通过研究制剂中某种成分的含量高低来判定药物的优劣，保证临床用药含量高低来判定药物的优劣，保证临床用药的安全、有效。的安全、有效。 含量测定对象：含量测定对象：有效成分、指标成分、毒性有效成分、指标成分、毒性成分成分、贵重药材成分、贵重药材成分。中药制剂中药制剂与化学药品含量测定的区别：与化学药品含量测定的区别：1 1、对象不同：、对象不同：化学药品化学药品成分明确组成单一；成分明确组成单一；中药制剂中药制剂组成及成分复杂。组成及成分复杂。2 2、供试品溶液制备不同：、供试品溶液制备不同：化学药品化学药品方法简单；方法简单；中药制剂中药制剂方法繁琐，大

3、多需要净化分离。方法繁琐，大多需要净化分离。3 3、待测成分确定不同：、待测成分确定不同：化学药品化学药品待测成分明待测成分明确，多为主要成分；确，多为主要成分；中药制剂中药制剂需先根据中医药需先根据中医药理论选定药味，再综合考虑各方面因素选定待理论选定药味，再综合考虑各方面因素选定待测成分。测成分。含量测定的步骤：含量测定的步骤：药味的选定、测定成分的选药味的选定、测定成分的选定、测定方法及条件的选定、方法学考察。定、测定方法及条件的选定、方法学考察。 第一节第一节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理样品处理的作用：样品处理的作用：充分释放被测成分充分释放被测成分除杂纯化除杂纯化富集浓缩或

4、衍生化，以测定低含量被测成分富集浓缩或衍生化，以测定低含量被测成分所用溶剂符合测定要求所用溶剂符合测定要求一、样品的粉碎一、样品的粉碎: :样品粉碎的目的：样品粉碎的目的：保证所取样品均匀且有代表性保证所取样品均匀且有代表性较快且完全地提取被测成分较快且完全地提取被测成分粉碎设备：粉碎设备：粉碎机、研钵、食品处理机等粉碎机、研钵、食品处理机等生物组织样品用高速匀浆机或玻璃匀浆器。生物组织样品用高速匀浆机或玻璃匀浆器。粉碎的注意事项：粉碎的注意事项：粉碎度按实际情况进行，不可太粗或太细。太粗影响粉碎度按实际情况进行，不可太粗或太细。太粗影响提取效果，太细一方面造成粘性成分附着，妨碍进一步提取效果

5、，太细一方面造成粘性成分附着，妨碍进一步提取，另一方面造成过滤困难。提取，另一方面造成过滤困难。避免由于设备的磨损或不干净等原因而污染样品。避免由于设备的磨损或不干净等原因而污染样品。防止粉尘飞散或挥发性成分损失。防止粉尘飞散或挥发性成分损失。不能丢弃不宜粉碎的大颗粒物质，要反复粉碎后使其不能丢弃不宜粉碎的大颗粒物质，要反复粉碎后使其全部过筛网。全部过筛网。二、样品的提取：二、样品的提取：常见提取方法：冷浸法、回流提取法、连续回流提取常见提取方法：冷浸法、回流提取法、连续回流提取法、超声波提取法、超临界流体萃取法。法、超声波提取法、超临界流体萃取法。冷浸法：冷浸法：浸泡后溶液的两种测定方法。浸

6、泡后溶液的两种测定方法。部分测定法（等量法）：浸泡后的溶液过滤，精密部分测定法（等量法）：浸泡后的溶液过滤，精密量取与一定重量的样品相当的滤液进行测定。量取与一定重量的样品相当的滤液进行测定。（此法（此法不适合挥发性较大的提取溶剂）不适合挥发性较大的提取溶剂）全部测定法（总量测定法）：浸泡后的溶液过滤，全部测定法（总量测定法）：浸泡后的溶液过滤，滤渣充分用溶剂洗涤至提取完全，合并滤液及洗液，滤渣充分用溶剂洗涤至提取完全，合并滤液及洗液，浓缩或蒸干，残留物用另一溶剂溶解，定量转入量瓶浓缩或蒸干，残留物用另一溶剂溶解，定量转入量瓶中，稀释至刻度，摇匀，进行测定。中，稀释至刻度，摇匀，进行测定。（此

7、法克服了部（此法克服了部分测定法的缺陷，且提取溶剂不必精密加入）分测定法的缺陷，且提取溶剂不必精密加入）三、样品的分离净化：三、样品的分离净化：常见净化方法：沉淀法、蒸馏法、液常见净化方法：沉淀法、蒸馏法、液- -液萃取法、色液萃取法、色谱法、固相微萃取法、消化法。谱法、固相微萃取法、消化法。沉淀法：沉淀法：利用某些试剂与被测成分或杂质生成沉淀，利用某些试剂与被测成分或杂质生成沉淀，分离沉淀或保留溶液的精制方法。分离沉淀或保留溶液的精制方法。注意事项：注意事项：过量试剂若干扰被测组分的测定，应设法除去。过量试剂若干扰被测组分的测定，应设法除去。大量杂质以沉淀形式除去时，被测成分应不能产大量杂质

8、以沉淀形式除去时，被测成分应不能产生共沉淀而损失。生共沉淀而损失。被测成分生成沉淀时，其沉淀经分离后可重新溶被测成分生成沉淀时，其沉淀经分离后可重新溶解或直接用重量法测定。解或直接用重量法测定。蒸馏法：蒸馏法：利用某些被测成分具有挥发性，采用蒸馏利用某些被测成分具有挥发性，采用蒸馏法，收集馏出液进行含量测定；或某些成分经蒸馏法，收集馏出液进行含量测定；或某些成分经蒸馏分解成挥发性成分，利用分解产物（要求结构明确）分解成挥发性成分，利用分解产物（要求结构明确）进行测定。进行测定。注意事项：注意事项：最常用水蒸气蒸馏法。最常用水蒸气蒸馏法。适用于挥发油，小分子生物碱的分离。适用于挥发油，小分子生物

9、碱的分离。优化：蒸馏液中加入一定量无机盐（盐析作用），优化：蒸馏液中加入一定量无机盐（盐析作用），使挥发性成分更完全地蒸馏出来。使挥发性成分更完全地蒸馏出来。 液一液萃取法：液一液萃取法：1 1、直接萃取法：利用被测成分与干扰成分在有机溶剂、直接萃取法：利用被测成分与干扰成分在有机溶剂（萃取剂）中的溶解度不同，通过多次萃取达到分离净（萃取剂）中的溶解度不同，通过多次萃取达到分离净化的目的。化的目的。萃取次数：萃取次数：实验考察（符合样品回收率的要求）实验考察（符合样品回收率的要求）溶剂的选择：溶剂的选择：根据被测组分疏水性的相对强弱选择极性根据被测组分疏水性的相对强弱选择极性适当的溶剂。适当的

10、溶剂。 水相水相pHpH的控制：的控制：对弱酸性成分对弱酸性成分 pHpKa-2pHpKa-2对弱碱性成分对弱碱性成分 pHpKa+2(pHpKa+2(此处为其共轭酸的此处为其共轭酸的pKa) pKa) 盐析作用：盐析作用：水相用水相用NaClNaCl饱和，提高提取率。饱和，提高提取率。2 2、离子对萃取法：在适当、离子对萃取法：在适当pHpH介质中，某些有机酸、有机介质中，某些有机酸、有机碱形成的离子与带相反电荷的离子定量的结合成为弱极碱形成的离子与带相反电荷的离子定量的结合成为弱极性的离子对，而易溶于有机溶剂，使之萃取分离。性的离子对，而易溶于有机溶剂，使之萃取分离。适用于高度离解的有机酸

11、、有机碱的萃取（不能用直接适用于高度离解的有机酸、有机碱的萃取（不能用直接萃取法）。萃取法）。中药制剂分析主要用于生物碱（中药制剂分析主要用于生物碱（B B）的分离。）的分离。离子对试剂：离子对试剂：常为酸性染料（常为酸性染料（In-In-） 如：溴百里酚蓝（如：溴百里酚蓝（BTBBTB）和溴甲酚绿（）和溴甲酚绿（BCGBCG）注意：注意：水相水相pHpH值的控制值的控制 离子对试剂的选择离子对试剂的选择色谱法：色谱法：分类：分类：1 1、按分离原理分类：吸附色谱、分配色谱、离子交换、按分离原理分类：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱色谱、凝胶色谱2 2、按操作方式分类：柱色谱、薄层色

12、谱、纸色谱、按操作方式分类：柱色谱、薄层色谱、纸色谱 3 3、按装柱方法分类：湿法装柱、干法装柱、按装柱方法分类：湿法装柱、干法装柱方法：方法：分离时常用柱色谱法。将样品溶液加到装有合适分离时常用柱色谱法。将样品溶液加到装有合适固定相的色谱柱中固定相的色谱柱中. .或者或者将被测成分保留于柱上，洗去将被测成分保留于柱上，洗去杂质后，再洗脱被测成分进行测定杂质后，再洗脱被测成分进行测定; ;或者使杂质强烈保或者使杂质强烈保留于柱上，直接洗脱被测成分进行测定。留于柱上，直接洗脱被测成分进行测定。适用于：适用于：最适合总类成分的含量测定。最适合总类成分的含量测定。 1 1、氧化铝：用于、氧化铝：用于

13、生物碱、苷类等碱性、中性成分生物碱、苷类等碱性、中性成分的的测定，吸附酸性成分测定，吸附酸性成分. .硅胶：适合于分离硅胶：适合于分离中性或酸性化合物，中性或酸性化合物，强烈保留碱性强烈保留碱性化合物。化合物。 2 2、键合相硅胶：、键合相硅胶：十八烷基键合相硅胶（十八烷基键合相硅胶（C C1818，ODSODS）、）、 C C8 8（反向色谱）（反向色谱） 分离脂溶性成分分离脂溶性成分苯基、氰基键合相硅胶苯基、氰基键合相硅胶（正向色谱）（正向色谱） 分离水溶性成分分离水溶性成分 3 3、大孔树脂：分为极性和非极性型、大孔树脂：分为极性和非极性型 ，D D101101最常用。最常用。 4 4、

14、聚酰胺：与溶质形成氢键而产生吸附作用，常用、聚酰胺：与溶质形成氢键而产生吸附作用，常用于含酚、酸、醌类于含酚、酸、醌类、黄酮类、黄酮类药物样品液的净化分离。药物样品液的净化分离。5 5、硅藻土、纤维素：亲水型填料，原理为分配作用、硅藻土、纤维素：亲水型填料，原理为分配作用 流动相：与水不混溶的有机溶剂流动相：与水不混溶的有机溶剂 洗脱：亲脂性的成分洗脱：亲脂性的成分6 6、离子交换树脂：用于除去样品中的离子或萃取可、离子交换树脂：用于除去样品中的离子或萃取可离解化合物离解化合物( (弱酸、弱碱药物弱酸、弱碱药物) )。 第二节第二节 含量测定方法的验证含量测定方法的验证方法验证：方法验证：又称

15、效能指标，是方法学论证的重要指标，又称效能指标，是方法学论证的重要指标，也是药品质量标准中方法学考察的主要内容。也是药品质量标准中方法学考察的主要内容。含量测定方法学考察的目的：含量测定方法学考察的目的：是证明采用的分析方法是是证明采用的分析方法是否适合于相应的检测要求。在建立中药质量标准时，方否适合于相应的检测要求。在建立中药质量标准时，方法验证的过程和结果均应记载在药品质量标准起草说明法验证的过程和结果均应记载在药品质量标准起草说明中。中。验证的内容：验证的内容：准确度、精密度（包括重复性、中间精密准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、专属性、线性、范围和耐用性。度和重现性）、

16、专属性、线性、范围和耐用性。一、准确度：系指用该方法测定的结果与真实值或参考一、准确度：系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以回收率（值接近的程度，一般以回收率（% %）表示。中药制剂分）表示。中药制剂分析常用加样回收率来考查。准确度应在规定范围内测试。析常用加样回收率来考查。准确度应在规定范围内测试。（一）含量测定的准确度：（一）含量测定的准确度： 用已知纯度的对照品做加样回收测定，即已知被测用已知纯度的对照品做加样回收测定，即已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被测成分对照品进行测定，得总量（测成分对照品进

17、行测定，得总量（C C）。）。 加样回收率加样回收率(%)=(%)=（C CA A）B B100%100%， n5n5A A为供试品加样前被测成分含量，为供试品加样前被测成分含量，C C加样后实测总量，加样后实测总量，B B为加入对照品量为加入对照品量,n,n为实验次数。为实验次数。（二）数据要求：（二）数据要求： 加样回收率试验中，加入对照品后，亦应在规定的加样回收率试验中，加入对照品后，亦应在规定的 标准曲线线性范围内。加样回收率试验至少做五次。常标准曲线线性范围内。加样回收率试验至少做五次。常用测定方法有两个：用测定方法有两个：取同一浓度的供试品取同一浓度的供试品6 6份，分别加份，分别

18、加入等量的对照品，做六次平行试验，用入等量的对照品，做六次平行试验，用6 6个测定结果进行个测定结果进行评价，对照品加入量与所取的供试品被测成分含量控制评价，对照品加入量与所取的供试品被测成分含量控制在在1 1：1 1左右。左右。取同一浓度的供试品取同一浓度的供试品9 9份，每三份加入等份，每三份加入等量的对照品一定量，制成有量的对照品一定量，制成有3 3个不同浓度，每个浓度有个不同浓度，每个浓度有3 3份的供试品溶液进行测定，用份的供试品溶液进行测定，用9 9个测定结果进行评价。一个测定结果进行评价。一般中间浓度溶液的对照品加入量与所取的供试品被测成般中间浓度溶液的对照品加入量与所取的供试品

19、被测成分含量控制在分含量控制在1 1：1 1左右为宜。左右为宜。中药制剂含量测定所得的中药制剂含量测定所得的单份供试品回收率及所有供试单份供试品回收率及所有供试品平均回收率均在品平均回收率均在95%95%105%105%之间，特殊操作繁复的可略之间，特殊操作繁复的可略低（但不可小于低（但不可小于90%90%或大于或大于110%110% ）。回收率的）。回收率的RSDRSD不大于不大于3% 3% （RSD=S/XRSD=S/X平均平均100%100%）。）。加样回收率试验举例：加样回收率试验举例： 取已知含量的样品取已知含量的样品6 6份，每份约份，每份约0.05g0.05g，每份含有效，每份含

20、有效成分黄芩苷成分黄芩苷4.79%4.79%，精密称定，置，精密称定，置25mL25mL量瓶中，分别精密量瓶中，分别精密加入加入黄芩苷黄芩苷标准品贮备溶液标准品贮备溶液5.0mL5.0mL（0.3884mg/ml0.3884mg/ml），按），按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，用高效液相色谱供试品溶液制备方法制备供试品溶液，用高效液相色谱仪检测，进样仪检测，进样10L10L，测定并计算回收率，测定并计算回收率，结果表明该方结果表明该方法准确度好。法准确度好。黄芩苷黄芩苷加样回收试验结果加样回收试验结果 取样取样量量(g)(g)原有量原有量(mg)(mg)加入量加入量(mg)(mg)测得量测得

21、量(mg)(mg)回收率回收率(%)(%)平均平均值值(%)(%)RSDRSD(%)(%)0.04430.04432.1262.1261.9421.9423.9963.99696.2896.2895.8095.800.840.840.04440.04442.1282.1281.9421.9423.9733.97395.0195.010.05300.05302.5432.5431.9421.9424.3934.39395.2595.250.04700.04702.2552.2551.9421.9424.1094.10995.4695.460.04430.04432.1232.1231.9421.

22、9424.0064.00696.9796.970.04450.04452.1262.1261.9421.9423.8763.87695.8095.80二、精密度：系指在规定的测定条件下，同一个均匀样二、精密度：系指在规定的测定条件下，同一个均匀样品，经过多次取样测定所得的结果之间的接近程度。品，经过多次取样测定所得的结果之间的接近程度。( (一一) )精密度表示方法：精密度表示方法：1 1、偏差（、偏差（d d）: :单项测定单项测定值值与平均值的差值与平均值的差值 2 2、标准偏差：、标准偏差：S=S=3 3、相对标准偏差：相对标准偏差： RSDRSD（% %）=S/X=S/X平均平均100

23、%100%（最常用）（最常用）(二二) 重复性、中间精密度及重现性重复性、中间精密度及重现性S=（XiX）2n1( (二二) )重复性、中间精密度及重现性：重复性、中间精密度及重现性：1. 1. 重复性：在相同的条件下，由一个分析人员测定所得结重复性：在相同的条件下，由一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。果的精密度称为重复性。测定方法为测定方法为在规定的范围内，在规定的范围内，取同一浓度的供试品，取同一浓度的供试品，用用6 6个测定结果进行评价个测定结果进行评价（六点测（六点测定）定）；或设计；或设计3 3个不同浓度，每个浓度各分别制备个不同浓度，每个浓度各分别制备3 3份供试份供试品

24、溶液进行测定，用品溶液进行测定，用9 9个测定结果进行评价个测定结果进行评价（九点测定）（九点测定）。毕业论文水平的实验只做到毕业论文水平的实验只做到重复性即可。重复性即可。2 2中间精密度：同一个实验室，不同时间由不同分析人员中间精密度：同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度，称为中间精密度。用不同设备测定结果的精密度，称为中间精密度。测定方测定方法同前重复性实验，为考察随机变动因素对精密度的影响，法同前重复性实验，为考察随机变动因素对精密度的影响，申报新药做到中间精密度。申报新药做到中间精密度。3 3重现性：在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密重现性：在不同实验

25、室由不同分析人员测定结果的精密度，称为重现性。度，称为重现性。测定方法同前重复性实验，当分析方法测定方法同前重复性实验，当分析方法将被法定标准采用时（如建立药典分析方法），应进行将被法定标准采用时（如建立药典分析方法），应进行重现性实验。重现性实验。( (三三) )数据要求：常用数据要求：常用RSDRSD表示，应不大于表示，应不大于3%3%。重复性试验举例：重复性试验举例： 精取六份五味子浸膏，每份精取六份五味子浸膏，每份168mg168mg，按供试品溶，按供试品溶液的制备方法制备六份液相供试品溶液液的制备方法制备六份液相供试品溶液, ,按高效液相按高效液相色谱条件进样测定色谱条件进样测定,

26、,每份进每份进10l,10l,记录峰面积，计算记录峰面积，计算五味子五味子醇甲含量醇甲含量(mg/g)(mg/g)，结果见下表，结果见下表，表明该方法表明该方法重复性良好。重复性良好。重复性测定数据表重复性测定数据表 进样序号进样序号 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 取样量取样量(mg) 167.3 169.7 165.1 165.3 168.1 169.3(mg) 167.3 169.7 165.1 165.3 168.1 169.3 峰面积峰面积 8165427 8269117 7793747 7891571 8245381 8225956 8165427 8269117

27、7793747 7891571 8245381 8225956 醇甲含量醇甲含量 203.00 202.64 196.45 198.65 203.99 202.07 203.00 202.64 196.45 198.65 203.99 202.07 平均值平均值 201.33 201.33 标准偏差标准偏差S 2.93 S 2.93 RSD% 1.46 RSD% 1.46 三、专属性：又叫选择性，系指在其他成分（如杂质、三、专属性：又叫选择性，系指在其他成分（如杂质、辅料等）可能存在下，采用的方法能正确测定出被测辅料等）可能存在下，采用的方法能正确测定出被测成分的特性。成分的特性。考察的是分析

28、方法对被测成分是否有准考察的是分析方法对被测成分是否有准确而专属的测定能力。确而专属的测定能力。考察方法常用阴性对照法，即考察方法常用阴性对照法，即以被测成分与除去该成分或除去该药材的成药进行对以被测成分与除去该成分或除去该药材的成药进行对照，考察被测成分的测定是否受到干扰组分的影响。照，考察被测成分的测定是否受到干扰组分的影响。 如用色谱法、光谱法等应附代表性谱图，例子见如用色谱法、光谱法等应附代表性谱图，例子见书书P P7272. .四、线性：系指在设计的范围内，测试结果与试样中被四、线性：系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度或质量直接呈正比关系的程度。测物浓度或质量直接呈正比关

29、系的程度。（一）测定方法：为在规定的范围内制备至少（一）测定方法：为在规定的范围内制备至少6 6个浓度个浓度的样品，以测得的响应信号作为被测物浓度或质量的函的样品，以测得的响应信号作为被测物浓度或质量的函数作图，观察是否呈线性。必要时，响应信号可经数学数作图，观察是否呈线性。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。转换，再进行线性回归计算。（二）数据要求：应列出回归方程，相关系数（二）数据要求：应列出回归方程，相关系数（r r）和）和线性图。相关系数一般要求线性图。相关系数一般要求r0.999r0.999，在，在TLCSTLCS定量中要定量中要求求r0.995r0.995。线性关系举

30、例：线性关系举例：标准曲线的制备：标准曲线的制备： 精密量取精密量取五味子乙素五味子乙素对照品溶液（对照品溶液（0.208mg/ml 0.208mg/ml ）0.20.2、0.40.4、0.60.6、0.80.8、1.01.0、1.21.2、1.4ml1.4ml，分别置具塞试，分别置具塞试管中，蒸干，各精密加管中，蒸干，各精密加1010变色酸溶液变色酸溶液1ml1ml，加硫酸溶液，加硫酸溶液( (水水1 1份，浓硫酸份，浓硫酸2 2份份) 9ml) 9ml，摇匀，置水浴上加热，摇匀，置水浴上加热3030分钟，分钟，放冷，用分光光度仪在放冷，用分光光度仪在570nm570nm波长处测定吸收度，绘

31、制标波长处测定吸收度，绘制标准曲线，结果如下表（结果表明，在绘制标准曲线的浓准曲线，结果如下表（结果表明，在绘制标准曲线的浓度范围内度范围内4.164.1629.12 g/ml 29.12 g/ml 线性关系良好）。线性关系良好）。 五味子乙素标准曲线数据表五味子乙素标准曲线数据表序号序号 1 2 3 4 5 6 71 2 3 4 5 6 7浓度浓度 g/mlg/ml 吸光度吸光度 4.16 8.32 12.48 16.64 20.8 24.96 29.12 4.16 8.32 12.48 16.64 20.8 24.96 29.12 0.137 0.272 0.405 0.545 0.687

32、 0.822 0.9580.137 0.272 0.405 0.545 0.687 0.822 0.958 五、范围：范围是指能到达一定精密度、准确度和线性，五、范围：范围是指能到达一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。如上例，线性范测试方法适用的高低限浓度或量的区间。如上例，线性范围为：围为： 4.164.1629.12 g/ml29.12 g/ml 六、耐用性：六、耐用性：系指在测定条件有小的变动时，测定结果不系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法用于常规检验提供依据。典受影响的承受程度，为使方法用于常规检验提供依据。典型的变动因素有：被测

33、溶液的稳定性，样品提取次数、时型的变动因素有：被测溶液的稳定性，样品提取次数、时间等。间等。耐用性试验举例（变动的为时间）：耐用性试验举例（变动的为时间）： 精取五味子浸膏精取五味子浸膏175.3g175.3g，按供试品溶液的制备方法制，按供试品溶液的制备方法制备一份液相供试品溶液备一份液相供试品溶液, ,室温放置室温放置2424小时小时, ,分别在分别在0 0、2 2、4 4、8 8、1212、2424小时按小时按HPLCHPLC色谱条件进样测定色谱条件进样测定, ,每次每次10l,10l,记录峰记录峰面积，计算五味子醇甲含量面积，计算五味子醇甲含量(mg/g)(mg/g)，结果见下表。，结

34、果见下表。 耐用性测定数据表耐用性测定数据表进样时间（进样时间（h h）0 2 4 8 12 240 2 4 8 12 24 峰面积峰面积 8201938 8538544 8653974 8607893 8370618 8560207 8201938 8538544 8653974 8607893 8370618 8560207 醇甲含量醇甲含量 198.55 203.00 205.20 204.12 202.49 194.59198.55 203.00 205.20 204.12 202.49 194.59 平均值平均值 201.33 201.33 标准偏差标准偏差S S 4.00 4.00

35、 RSD%RSD% 1.991.99从上表可见，六个样相对标准偏差从上表可见，六个样相对标准偏差1.99%1.99%，小于，小于3%3%。说明用。说明用此测定方法测定样品中被测成分含量此测定方法测定样品中被测成分含量, ,在在2424小时内稳定，因小时内稳定，因此本测定方法对时间有一定耐用性。此本测定方法对时间有一定耐用性。1 1、评价中药制剂含量测定方法的回收试验结果时，一般要、评价中药制剂含量测定方法的回收试验结果时，一般要求（求（ ） A.A.回收率在回收率在8585115115、RSD5RSD5 （n5n5）B.B.回收率在回收率在9595105105、RSD3RSD3 （n5n5）

36、C.C.回收率在回收率在8080100100、RSD10RSD10 （n9n9） D.D.回收率回收率8080、RSD5RSD5 （n5n5）E.E.回收率在回收率在9999101101、RSD0.2RSD0.2 （n3n3）2 2、下列关于分析方法效能指标的概念描述正确的有、下列关于分析方法效能指标的概念描述正确的有( ( ) )( (多选多选) )A.A.在大多数情况下我们研究分析方法的精密度是指重现性在大多数情况下我们研究分析方法的精密度是指重现性. .B.B.被法定标准采用的分析方法是进行过重现性试验的被法定标准采用的分析方法是进行过重现性试验的. .C.C.选择性是指在样品中有其他组

37、分共存时，该分析方法对被选择性是指在样品中有其他组分共存时，该分析方法对被测物准确而专属的测定能力测物准确而专属的测定能力. .D.D.耐用性是指在测定条件有小的变动时，测定结果耐用性是指在测定条件有小的变动时，测定结果不不受影响受影响的承受能力的承受能力. .E.E.准确度实验常用准确度实验常用9 9点测定法点测定法. . 第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法常用测定方法：化学分析法常用测定方法：化学分析法 光谱法（光谱法（UV-VisUV-Vis等）等） 色色谱谱法（法（HPLCHPLC、GC GC 、TLCSTLCS等）等） 一、化学分析法：一、化学分析法：1 1、包括重量分析

38、、包括重量分析法法和滴定分析和滴定分析法法. .2 2、适用范围：主要用于测定制剂中、适用范围：主要用于测定制剂中含量较高的含量较高的一些有一些有机机成分成分及含及含矿物药制剂中的无机成分。矿物药制剂中的无机成分。 如：总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药成分如：总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药成分3 3、特点：所用仪器简单。、特点：所用仪器简单。 但有一定的局限性，灵敏度低，操作繁琐、耗时长，但有一定的局限性，灵敏度低，操作繁琐、耗时长，专属性不高，不适宜微量成分测定。专属性不高，不适宜微量成分测定。4 4、仪器：仪器：重量分析常用仪器：分析天平、称瓶、干燥器、滤器重量分析常用仪器：分析天平

39、、称瓶、干燥器、滤器（滤纸、垂熔玻璃漏斗）；（滤纸、垂熔玻璃漏斗）；滴定分析常用仪器：滴定管、容量瓶、移液管。滴定分析常用仪器：滴定管、容量瓶、移液管。 （一）重量分析法：包括挥发法、萃取法、沉淀法。（一）重量分析法：包括挥发法、萃取法、沉淀法。挥发法：挥发法：测定具有挥发性或能定量转化为挥发性物质的测定具有挥发性或能定量转化为挥发性物质的组分含量。组分含量。 如：干燥失重、水分测定如：干燥失重、水分测定 总灰分及炽灼残渣的测定总灰分及炽灼残渣的测定萃取法：萃取法：根据被测组分在互不相溶的两相中溶解度的不根据被测组分在互不相溶的两相中溶解度的不同，达到分离的目的。同，达到分离的目的。适用：适用

40、：总皂苷、总有机酸、总生物碱总皂苷、总有机酸、总生物碱如：冰硼散中冰片的含量测定、地奥心血康胶囊中甾体如：冰硼散中冰片的含量测定、地奥心血康胶囊中甾体总皂苷含量测定、昆明山海棠片中总生物碱的含量测定、总皂苷含量测定、昆明山海棠片中总生物碱的含量测定、甘草浸膏中甘草酸的含量测定。甘草浸膏中甘草酸的含量测定。沉淀法：沉淀法：将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其含将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其含量。适用于：量。适用于：制剂中纯度较高的成分。制剂中纯度较高的成分。如：西瓜霜润喉片中西瓜霜的含量测定如：西瓜霜润喉片中西瓜霜的含量测定 苦参片中苦参总碱的含量测定苦参片中苦参总碱的含量测定 复方元

41、胡注射液总碱的测定复方元胡注射液总碱的测定（二）滴定分析法：是容量分析法。（二）滴定分析法：是容量分析法。适用：适用：常量组分的分析常量组分的分析. .特点：特点：操作简便、快速，结果准确操作简便、快速，结果准确, ,一般相对误差一般相对误差0.2%, TCD TCD），死体积小，线性范围宽，但易破坏），死体积小，线性范围宽，但易破坏样品。载气多用样品。载气多用N N2 2。（3 3）氮）氮- -磷检测器（磷检测器（NPD):NPD):专属性检测器，可用于中药专属性检测器，可用于中药及其制剂中农药残留量的检测。及其制剂中农药残留量的检测。（4 4）电子捕捉检测器（）电子捕捉检测器（ECDECD

42、）：专属性检测器，适用于）：专属性检测器，适用于痕量电负性有机物，如含卤素、硫、氧等化合物的分析。痕量电负性有机物，如含卤素、硫、氧等化合物的分析。电负性越强电负性越强, ,检测器灵敏度越高检测器灵敏度越高. .（七）定量分析方法：常用的定量方法有内标法、外标法、（七）定量分析方法：常用的定量方法有内标法、外标法、归一化法和标准溶液加入法，以峰高或峰面积定量归一化法和标准溶液加入法，以峰高或峰面积定量( (常用常用).).首先讲两个概念首先讲两个概念: :峰面积的测量：峰面积的测量：目前常用气相色谱仪均有色谱工作站，可直接给出目前常用气相色谱仪均有色谱工作站，可直接给出A A，h h，W W1

43、/21/2。iiiACm)(或定量依据校正因子的测定：校正因子的测定：前提是同一物质用同一检测器检测前提是同一物质用同一检测器检测, ,物质的物质的m m或或CA.CA.(1)(1)绝对校正因子的测定绝对校正因子的测定: :iiiiiiAmfAfm关）分性质、仪器灵敏度有绝对校正因子（与组if的量或质量进入检测器中的物质im(2)(2)相对校正因子的测定相对校正因子的测定: :siAAsi和测混匀进样基准物纯品过程：精称保留时间接近与前提：sisiisssiisimimAmAAmAmffff fmimi为相对校正因子为相对校正因子, ,其与待测物、基准物和检测器其与待测物、基准物和检测器类型有

44、关，与操作条件变化（如进样量）无关类型有关，与操作条件变化（如进样量）无关. .基准物：基准物：热导检测器（热导检测器（TCDTCD）苯；苯； 氢焰离子化检测器（氢焰离子化检测器（FIDFID）丁庚烷。丁庚烷。1 1、内标法：、内标法：气相色谱最常用的定量方法气相色谱最常用的定量方法. . 以一定量的纯物质（内标物），加入到准确称定的以一定量的纯物质（内标物），加入到准确称定的试样中，根据试样和内标物的重量及其峰面积比，求出试样中，根据试样和内标物的重量及其峰面积比，求出某组分的含量。某组分的含量。 siisAAmmm和测混匀进样）（含过程：ssiisifAfAmm%100%100%mmfAf

45、AmmCsssiiii对内标物要求：对内标物要求：a a内标物须为原样品中不含组分内标物须为原样品中不含组分. .b b内标物能单独出峰且与待测物保留时间应接近，但内标物能单独出峰且与待测物保留时间应接近，但与待测组分可完全分开与待测组分可完全分开,R,R1.5.1.5.c c内标物为高纯度标准物质，或含量已知物质内标物为高纯度标准物质，或含量已知物质, ,加入的加入的重量接近于组分的含量重量接近于组分的含量. .内标法优点：内标法优点：只需内标物及待测组分出峰。只需内标物及待测组分出峰。无需准确进样，适合微量组分的含量测定无需准确进样，适合微量组分的含量测定. .缺点：缺点：找合适内标物困难

46、找合适内标物困难( (选择合适内标物选择合适内标物是内标法的关键是内标法的关键););需已知校正因子需已知校正因子; ;样品的样品的配制较复杂配制较复杂. .内标法加校正因子内标法加校正因子: :精密称取待测物质的对照品精密称取待测物质的对照品R,R,加入加入适量内标物适量内标物S S进样进样, ,记录色谱图记录色谱图, ,测量对照品和内标物的峰测量对照品和内标物的峰面积面积, ,则其相对校正因子为则其相对校正因子为: :再取加入内标物的供再取加入内标物的供试液试液, ,进样进样, ,记录色谱图记录色谱图, ,测量供试测量供试液中待测组分和内标物的峰面积液中待测组分和内标物的峰面积, ,计算含

47、量计算含量: :内标对比法（内标对比法（内标一点法内标一点法）把等量内标物分别把等量内标物分别加入等体积已知浓度对照品溶液加入等体积已知浓度对照品溶液和和待测样品溶液中，待测样品溶液中，样品溶液浓度最好与对照品溶液相样品溶液浓度最好与对照品溶液相当。当。前提前提:C:Ci i/C/Cs sA Ai i/A/As s的截距为零的截距为零. .对样对样）（）（sisiiiAAAACC)(%)(对对样样）（）（）（）（%isisiiCAAAAC内标对比法特点：不需要校正因子内标对比法特点：不需要校正因子 内标工作曲线法：内标工作曲线法：a a、配制一系列不同浓度的等体积对照液，并加入相、配制一系列不

48、同浓度的等体积对照液，并加入相同量的内标物，进样，测标准品和内标物的峰面积同量的内标物，进样，测标准品和内标物的峰面积A Ai i和和A As s，以，以A Ai/i/A As s对对照溶液中对照品浓度与对对照溶液中对照品浓度与内标物浓内标物浓度之比度之比Ci/CsCi/Cs作图。计算回归方程式作图。计算回归方程式Ai/AsAi/As= a = a Ci/CsCi/Cs+b+b 及相关系数（及相关系数（ a a：斜率；：斜率；b b：截：截距距 ），求出斜率、截距后确定标准曲线。），求出斜率、截距后确定标准曲线。b b、与、与对照液对照液等体积待测试样溶液中也加入与对照液等体积待测试样溶液中也

49、加入与对照液相同量的内标物，测得相同量的内标物，测得A Ai/i/A As s。c c、把、把b b中测得比值代入标准曲线计算试样的含量。中测得比值代入标准曲线计算试样的含量。 特点：不需要校正因子且比内标一点法精确。特点：不需要校正因子且比内标一点法精确。2 2、外标法：以待测组分纯品为对照物，与试、外标法：以待测组分纯品为对照物，与试样中待测组分的响应信号（峰面积）相比较进样中待测组分的响应信号（峰面积）相比较进行定量的方法。行定量的方法。外标法关键：进样量准确，实验条件恒定。外标法关键：进样量准确，实验条件恒定。优点：优点：操作简便，不用校正因子，不必加内标操作简便，不用校正因子，不必加

50、内标物，只需待测组分出峰。物，只需待测组分出峰。缺点：缺点：结果的准确度与进样量和操作条件的稳结果的准确度与进样量和操作条件的稳定性有关定性有关, ,易易产生误差。产生误差。外标一点法：一种浓度对照物对比样品中待测组分外标一点法：一种浓度对照物对比样品中待测组分含量，含量，中国药典中国药典用气相测水分用此法。用气相测水分用此法。前提：截距为前提：截距为0 0，对照品浓度与待测组分浓度接近。，对照品浓度与待测组分浓度接近。C C标标=FA=FA标标， 求出求出F F， C C样样=FA=FA样样C C为组分的浓度，为组分的浓度，A A为测得该组分的峰面积，为测得该组分的峰面积，F F为比例为比例

51、常数。常数。外标两点法：用两种浓度对照物求算样品中待测组外标两点法：用两种浓度对照物求算样品中待测组分含量。分含量。前提：选取两点对照品的浓度，需涵盖待测浓度。前提：选取两点对照品的浓度，需涵盖待测浓度。 C=FC=F1 1A+FA+F2 2C C、A A同前，同前，F F1 1是比例常数，是比例常数，F F2 2是纵坐标截距。较先进是纵坐标截距。较先进仪器可自动给出，否则也可自己求算。根据两种浓度仪器可自动给出，否则也可自己求算。根据两种浓度对照品溶液对照品溶液C C1 1、C C2 2可测出其相应峰面积可测出其相应峰面积A A1 1、A A2 2代入上代入上式解二元一次方程，求出式解二元一

52、次方程，求出F F1 1与与F F2 2，确定直线方程后再，确定直线方程后再测出供试品的峰面积，即可计算出供试品浓度。测出供试品的峰面积，即可计算出供试品浓度。工作曲线法：用对照品配成不同浓度的对照工作曲线法：用对照品配成不同浓度的对照液，定量进样，用峰面积对对照品的量（或浓液，定量进样，用峰面积对对照品的量（或浓度）作线性回归，求出斜率、截距，确定度）作线性回归，求出斜率、截距，确定标准标准曲线曲线而后计算样品的含量。而后计算样品的含量。 前提：进入检测器样品中被测成分含量与峰面前提：进入检测器样品中被测成分含量与峰面积成正比且待测物峰面积在标准曲线范围内。积成正比且待测物峰面积在标准曲线范

53、围内。3 3、归一化法：、归一化法：前提：试样中所有组分都产生信号并能检出色前提：试样中所有组分都产生信号并能检出色谱峰。谱峰。依据：组分含量与峰面积成正比。依据：组分含量与峰面积成正比。适用范围：只能粗略考察供试品中被测物的含适用范围：只能粗略考察供试品中被测物的含量，量，不适合微量组分的测定。不适合微量组分的测定。质量归一化法公式：质量归一化法公式：%100%100%11nniiiiiiiiifAfAfAfAfAfAC各组分为同系物或性质相近，校正因子相近时可直接采各组分为同系物或性质相近，校正因子相近时可直接采用用面积归一化法计算：面积归一化法计算：%100%100%1niiiiiAAA

54、AAAC同系物或结构异构体优点：优点：定量结果与进样量、重复性无关，色谱条件略有变定量结果与进样量、重复性无关，色谱条件略有变化对结果几乎无影响。化对结果几乎无影响。缺点：缺点：所有组分必须在一定时间内都出峰，必须已知所有所有组分必须在一定时间内都出峰，必须已知所有组分的校正因子，不适合微量组分的测定。组分的校正因子，不适合微量组分的测定。4 4、标准溶液加入法：近年来出现新方法。为精密量取待、标准溶液加入法：近年来出现新方法。为精密量取待测成分对照品适量配制成对照品溶液，取一定量精密加入测成分对照品适量配制成对照品溶液，取一定量精密加入供试品溶液中，根据外标法或内标法测定含量，再扣除加供试品

55、溶液中，根据外标法或内标法测定含量，再扣除加入对照品入对照品的量的量，即得，即得供试品中待测成分的含量。供试品中待测成分的含量。目的：因气相色谱供试品中被测成分多含量较低，测量时目的：因气相色谱供试品中被测成分多含量较低，测量时误差较大。此方法就是要加大检测样品量，减小误差，其误差较大。此方法就是要加大检测样品量，减小误差，其基本定量方法同前三个。基本定量方法同前三个。（八）注意事项：（八）注意事项：1 1、手工进样时，因进样体积不宜控制，最好用内标法、手工进样时，因进样体积不宜控制，最好用内标法定量。自动定量。自动进样时，可采用外标法定量。进样时，可采用外标法定量。2 2、当、当标准溶液加入

56、法与其他定量方法结果不一致时，标准溶液加入法与其他定量方法结果不一致时，以标准溶液加入法为准。以标准溶液加入法为准。五、高效液相色谱法五、高效液相色谱法（HPLCHPLC）：）：（一）定义：是在经典的液相柱色谱法的基础上引入了气相（一）定义：是在经典的液相柱色谱法的基础上引入了气相色谱的理论和技术，采用高压泵，高效固定相以及高灵敏度色谱的理论和技术，采用高压泵，高效固定相以及高灵敏度在线检测器发展而成的分离分析方法。在线检测器发展而成的分离分析方法。适用于测定挥发性低、适用于测定挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物及离子型化合物，如热稳定性差、分子量大的高分子化合物及离子型化合物，如蛋

57、白质、生物碱、甾体等。蛋白质、生物碱、甾体等。HPLCHPLC与经典液相色谱比较：与经典液相色谱比较：1 1、采用、采用高压泵和高压泵和高效固定相；高效固定相；2 2、采用高灵敏度检测器；、采用高灵敏度检测器； 3 3、分析速度快。、分析速度快。HPLCHPLC与气相色谱比较：与气相色谱比较： 1 1、应用范围广；、应用范围广； 2 2、流动相选择范、流动相选择范围宽；围宽； 3 3、室温下分离。、室温下分离。（二）特点：（二）特点： “ “三高三高” “” “一快一快” “” “一广一广” ” 高柱效高柱效nn10104 4/ /米，柱效高（远高于一般米，柱效高（远高于一般LCLC）高灵敏度

58、高灵敏度高选择性高选择性分析速度快分析速度快应用范围广泛（可分析应用范围广泛（可分析80%80%有机化合物）有机化合物）（三）高效液相色谱仪与工作流程：（三）高效液相色谱仪与工作流程：1 1贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2 2高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）3 3进样装置进样装置4 4色谱柱色谱柱分离分离5 5检测器检测器分析分析6 6废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器 7 7记录装置记录装置（四）基本原理：（四）基本原理：1 1、塔板理论：、塔板理论：理理nLH/22212)(16)(54. 5)(WtWttnRRR理effeffnLH/2212)(5

59、4. 5)(16WtWtnRReff2 2、速率理论：、速率理论：（填充柱）：uCuBAHGC/（毛细管柱）或uCuBH/uCAHHPLC：因在因在HPLCHPLC中流动相为液体，扩散系数很小，纵向中流动相为液体，扩散系数很小，纵向扩散项扩散项B/uB/u可忽略不计可忽略不计. .流动相流速对流动相流速对HPLCHPLC板高的影响：板高的影响：min/1mlu 选择兼顾柱效和分析时间，（五）（五）HPLCHPLC法实验条件的选择：法实验条件的选择：1 1、色谱柱的选择：、色谱柱的选择：反相色谱反相色谱：应用最为广泛，适于分析：应用最为广泛，适于分析非极性和中等极非极性和中等极性的化合物。性的化

60、合物。最常用的固定相是十八烷基键合固定相。最常用的固定相是十八烷基键合固定相。正相色谱正相色谱：主要用于：主要用于分离极性化合物分离极性化合物，常用氨基、氰，常用氨基、氰基键合固定相。基键合固定相。样品为样品为酸、碱化合物酸、碱化合物，则采用，则采用离子交换色谱离子交换色谱。样品为样品为脂肪族或芳香族脂肪族或芳香族异构体异构体则采用则采用液液- -固（硅胶）固（硅胶）吸附色谱吸附色谱。2 2、流动相的选择：、流动相的选择：根据不同类型的色谱法选择流动相。根据不同类型的色谱法选择流动相。反相分配色谱反相分配色谱部分含水溶剂：流动相是以水为主，再加入能与水混部分含水溶剂：流动相是以水为主，再加入能