激光扫描共聚焦显微镜

1、LSCMLaser Scanning Confocal Microscope 在荧光显微镜基础上配置激光扫描装置，共扼聚焦光路系统和计算机图像采集分析系统而形成的新型显微镜。 利用共聚焦光路和激光扫描获得生物样品的荧光图像、显微断层图象、动态扫描记录、三维立体构建。激光器显微镜图象处理激光器扩光器样品滤光片针孔检测器入射光发射光长通滤光片入射光发射光长通滤光片激光器扩光器样品滤光片针孔检测器入射光发射光长通滤光片激光器扩光器样品滤光片针孔检测器 激光做光源，光色纯，波长固定，成像效果好，分辨率高，图象清晰，荧光检测信噪比高 可实现分层扫描 可实现连续扫描，可动态记录变化 可多根激光管同时扫描，

2、多色荧光同时成像 扫描速度快，对样品损伤小荧光观测动态测量三维成像高清晰成像荧光强度测量多荧光标记成像荧光与透射光同时成像 激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制，减少了成像的干扰，以及使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可达普通光学显微镜的1.4倍。 可以清晰的表现某些细微结构。牛肺动脉内皮细胞 ，微管牛肺动脉内皮细胞 ，微管鼠成纤维细胞单克隆anti-tubulin标记 检测人类癌细胞表皮生长因子BPAEC cells loaded with Alexa Fluor 488麦芽精凝集素涡虫纲扁虫肌动蛋白丝鬼笔环肽培养的293细胞绿色荧光蛋白培养的人肝癌细胞哑叮橙染色成纤维细胞微

3、丝微管荧光信号通过光电倍增管转化为电信号，经过电脑分析可对荧光信号进行相对定量测定。随机圈取细胞可得到所圈细胞的相对荧光强度值普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多通道同时探测。绿色：SYBR 14染色，活精子红色：PI染色，死精子牛精子绿色：MitoTracker Green 紫色：Hoechst 33342 Mouse 3T3 cells 红色：ethidium homodimer1 ，染核绿色：BODIPY FL phallacidin，染肌丝蛋白牛肺动脉内皮细胞蓝色：Hoechst 33342

4、 染DNA红色：PI，染核仁RNA绿色：Alexa Fluor 488染肌丝蛋白藤黄微球菌绿色：活菌红色：死菌染色：LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit 猴胚肾细胞内弓形虫繁殖吖叮橙染色绿色为DNA红色为RNA大鼠脑切片(海马)利用激光透射扫描成像，用特殊滤光片达到相差显微镜的效果，可获得清晰的具有立体感的图片 利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。 激光共聚焦显微镜的一大特点就是可以对活细胞进行连续扫描，实现实时动态观测。这样可记录细胞在外界某种条件的刺激下瞬时发生的变化。 常用的有检测细胞内游离Ca 离子变化

5、、细胞内PH值变化，等等。 荧光染料：Fluo-3AM。 此染料可特异性标记细胞内游离Ca离子，胞外不标记。加药加药峰值峰值所选细胞所选细胞胞浆胞浆胞核胞核胞浆胞核同时测量胞浆胞核同时测量 构成细胞膜的脂质和蛋白质分子具有一定的流动性。采用荧光漂白漂白恢复技术可以无创性分析活细胞膜成分和细胞质结构的动态变化。 其原理是利用高强度的激光束照射活细胞表面的某一区域，使该区域荧光淬灭或漂白，然后再利用较弱的激光束照射该区域，检测荧光强度的恢复情况（细胞膜上其他地方的荧光探针流动到漂白区域），从而来推断细胞膜的流动性初始状态 荧光漂白后 荧光恢复后细胞荧光恢复曲线0204060801001201401

6、60Time (s)013.55833.89454.23174.56794.903115.24135.576155.913176.249196.586216.922237.259257.595277.932298.268318.605338.941359.277379.614399.95420.287440.623时间（秒）荧光强度 按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，可控制样品扫描层面的厚度。即样品中相当薄的一层被探测到，而其他层面不影响成像。 当观测较厚样品时，普通透射光不能透过样品，则可以通过切片扫描检测荧光的方法来观测。入射光被检测层面整个样品白光（不能透过）发射光 较厚层面 较薄层

7、面人血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。 较厚层面 （平滑肌损伤可见） 较薄层面兔动脉血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。 连续分层扫描，可得到CT片类似的效果，对样品Z轴的结构进行分析。经计算机数据重组，可观测空间结构，空间定位，三维重组。 利用专用图象处理软件，还可以实现其他许多数据分析。GFP与PE双色标记3D扫描周长面积长度l细胞活性探针l细胞器探针l细胞骨架探针l核酸探针l细胞内离子探针 活细胞探针：吖叮橙（AO）是一种离子泵活性指示剂，弱碱性，在动物细胞溶酶体、植物液泡和含胰岛素的分泌小粒等酸性细胞器中浓集。 死细胞探针：碘化丙锭（PI）膜不透性DNA探

8、针，细胞膜破损后与DNA结合l线粒体探针：罗丹明123（Rhodamine123），能渗入细胞，带阳离子的荧光探针，不染色内质网。l溶酶体探针：中性红（Neutral Red）l内质网探针：DiOC6（3）属于短链碳酸花青苷染料。可标记活细胞内质网，也可用于甲醛固定的细胞内质网。（但现在尚无一种理想的内质网特异性探针，因此类染料内质网和其他细胞器同样着色，必要时可用内质网特异蛋白抗体。） F-肌动蛋白荧光探针：鬼笔环肽：特异性与F-肌动蛋白荧光探针结合，纳摩尔浓度下也可标记l 吖叮橙（AO） 与DNA结合，发射波长525nm，显绿色与RNA结合，发射波长650nm，显红色l Hoechst：专一性与DNA结合，分辨率高lDAPI：与双链DNA结合荧光增强20倍，与单链DNA结合无荧光增强。荧光强度比Hoechst低，光稳定性强于Hoechst。