第五章分子生物学研究法(上)2

1、分子生物学基本研究法（上）分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术及蛋白质操作技术第五章 扉页：扉页： 当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的的时候，你又必须尽可能展开想象的“翅膀翅膀”，否，否则，你就不可能走在别人的前面。则，你就不可能走在别人的前面。RNA基本操作技术基本操作技术真核生物基因组真核生物基因组DNA庞大，有大量

2、重复序列，很难直庞大，有大量重复序列，很难直接分离得到靶基因片段。而接分离得到靶基因片段。而cDNA来自反转录的来自反转录的mRNA，无冗余序列，通过筛选，无冗余序列，通过筛选cDNA文库，可较快文库，可较快地分离到相关基因。地分离到相关基因。Trizol总总RNA提取试剂提取试剂 TIANGEN rRNA电泳后的三条特征性条带电泳后的三条特征性条带28S、18S、5S (特别是特别是28S和和18S特征性条带特征性条带) 是鉴定总是鉴定总RNA纯度纯度和完整性的重要参数。和完整性的重要参数。RNA的抽提方法RNA Extraction by TRIzol使用BioSpcetrometer分光

3、光度计进行快速检测核酸mRNA Extraction from Cell CulturemRNA Extraction from Tissue5.32. mRNA的纯化 寡聚（寡聚（dT）纤维素柱色谱法：）纤维素柱色谱法： 利用利用mRNA3端含有端含有PolyA+的特点，当的特点，当RNA流经寡聚流经寡聚dT纤维素柱时，在高盐缓冲液的作纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，用下，mRNA被特异性地结合在柱上，再用被特异性地结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。经过两次此。经过两次此柱可得到较高纯度的柱可得到较高纯度的mRNA.图图5-14PolyATtractmRNA

4、的分离的分离纯化过程简图。纯化过程简图。每个Oligotex Kit 包括用于结合poly A+ mRNA的Oligotex 树脂，和用于洗涤、洗脱结合的mRNA的离心柱。Oligotex mRNA Kits可从总RNA中纯化mRNA，回收poly A+体外转录子。Oligotex Direct mRNA Kits 可从细胞和组织中纯化mRNA。mRNA Extraction from Total RNA5.3.3 cDNA的合成 cDNA（complementary DNA）：在体外以mRNA为模板，利用反转录酶和DNA聚合酶合成的一段双链DNA。cDNA 的合成5.3.4 cDNA文库的构

5、建 cDNA文库：文库：是指将某种生物体基因组转是指将某种生物体基因组转录的全部录的全部mRNAmRNA经反转录产生的经反转录产生的cDNAcDNA片段片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的菌中，该群体就称该生物基因组的cDNAcDNA文库。文库。基因文库的建立基因组基因组DNADNA文库文库cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较基因组文库与基因组文库与cDNA文库的差别文库的差别 基因组文库中包含了所有基因，而基因组文库中包含了所有基因，而cDNA文库只包含表达的文库只包

6、含表达的基因，缺乏内含子和调控序列，在研究基因结构时用处不大基因，缺乏内含子和调控序列，在研究基因结构时用处不大 cDNA文库代表了文库代表了mRNA的来源，转录本在丰度上有差别，的来源，转录本在丰度上有差别，而基因组文库在理论上均等地代表了所有基因序列而基因组文库在理论上均等地代表了所有基因序列 不同细胞类型制备的不同细胞类型制备的cDNA文库包含一些共同序列和独特序文库包含一些共同序列和独特序列，可用于分离差别表达的基因，基因组文库中不能列，可用于分离差别表达的基因，基因组文库中不能 基因组文库由于含有不表达序列，比基因组文库由于含有不表达序列，比cDNA文库大文库大 mRNA在不同组织之

7、间存在丰度差异，因此在不同组织之间存在丰度差异，因此cDNA文库在构文库在构建时对于建时对于mRNA含量较少的就比较困难，而基因组文库不存含量较少的就比较困难，而基因组文库不存在这样的问题在这样的问题5.3.5 基因文库的筛选基因文库的筛选5.3.5.1 核酸杂交法5.3.5.2 PCR筛选法5.4 SNP的理论与应用 SNP的定义定义：单核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphism，SNP) 主要是指在基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。 是第三代遗传标记。5.4.1 SNP概述 单倍型：是指位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点

8、。 SNP分类： cSNP 同义cSNP 非同义cSNP pSNP rSNP5.4.2 SNP的检测技术传统的传统的SNP检测方法使用的技术主要有：检测方法使用的技术主要有： 限制性酶切片段长度多态性（限制性酶切片段长度多态性（RFLP）；）； PCR单链构象多态性（单链构象多态性（PCRSSCP）；）； 毛细管电泳；毛细管电泳； 变性高效液相色谱（变性高效液相色谱（DHPLC）等。）等。目前获得新的目前获得新的SNP最常见的方法是：最常见的方法是： 通过通过DNA测序法测序法2.5.2.1 基因芯片技术 是在固相支持介质上进行分子杂交和原位荧光检测的一种高通量SNP分析方法。 通过激光扫描，

9、可根据荧光强弱或荧光的种类检测出被检序列的碱基类别。 优点：高通量优点：高通量 一次可对多个一次可对多个SNP进行规模性筛选进行规模性筛选 被检起始材料少被检起始材料少 操作步骤简单操作步骤简单 缺点：芯片设计成本高缺点：芯片设计成本高 若样品复杂，有些若样品复杂，有些SNP不能被检出不能被检出5.4.2.2 Taqman 技术5.4.2.3 分子信标技术 分子信标：是一种呈茎环结构分子信标：是一种呈茎环结构的荧光标记的寡核苷酸，环状的荧光标记的寡核苷酸，环状区与靶序列特异性结合，茎干区与靶序列特异性结合，茎干区由区由58个碱基组成，个碱基组成，5带有带有荧光发生基团，荧光发生基团，3带有荧光

10、猝带有荧光猝灭基团。自由状态时，发生荧灭基团。自由状态时，发生荧光共振能量转移，无荧光；当光共振能量转移，无荧光；当分子信标与靶分子结合时可检分子信标与靶分子结合时可检测到荧光。测到荧光。5.4.2.4 焦磷酸测序法(Pyrosequencing ) 四种酶催化的酶级联反应四种酶催化的酶级联反应:DNA :DNA 聚合酶、硫聚合酶、硫酸化酶酸化酶( (ATP sulfurylaseATP sulfurylase) ) 、荧光素酶荧光素酶( (luciferaseluciferase) ) 和和双磷酸酶双磷酸酶( ( apyrase) apyrase) 。 反应底物：反应底物：APSAPS和荧光素和荧光素（luciferinluciferin） 原理：原理：DNA DNA 聚合酶在一种聚合酶在一种dNTPdNTP的存在下进的存在下进行引物延