微生物学实验二培养基配制相关器皿的包扎及

1、 实验二实验二培养基配制、相关器皿培养基配制、相关器皿的包扎及消毒灭菌的包扎及消毒灭菌本次实验的目的和要求明确培养基制备原理通过对培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤了解消毒、灭菌的原理及方法，掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌学习并练习相关器皿的包扎方法内 容 一培养基及无菌水的制备一、培养基的相关知识介绍1 1、培养基的定义和组成培养基：指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养基质（反映培养基的2个作用？）。包括六大营养要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、能源、水。2、培养基制备原则和方法四个原则：目的明确；营养协调；物理化学条件适宜；经济节约。C/N：指在微生物培养基

2、中所含的碳源中碳原子摩尔数与氮源中的氮原子摩尔数之比。四种方法：生态模拟；参阅文献；精心设计；试验比较。3、物理化学条件适宜的说明pH值：渗透压和水活度（aw）： 在同温同压下，某溶液的蒸气压（P）与纯水蒸气压（P0）之比。氧化还原电位： 针对厌氧菌分离特别需要注意（半胱氨酸、巯基乙醇酸钠等）4、培养基的分类 （1 1）按成分分对成分种类、量是否清楚 天然培养基 合成培养基（组合培养基） 半合成培养基（也称半组合培养基） （2 2）按物理状态分 固体培养基（凝固剂的使用1.5%-2.5%)；固体基质的使用） 半固体培养基（凝固剂使用量较低0.2-0.7%） 液体培养基（工业生产中的重要性） 脱

3、水培养基（也称预制干燥培养基）（3 3）按培养基对微生物的功能分 基础培养基：含有一般微生物生长繁殖需要的基本营养物质。 选择性培养基：根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于菌种筛选等领域。“投其所好、取其所抗”。高通量筛选的建立。 鉴别性培养基：在培养基中加入有能与目的菌的无色代产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。直观、专一性（伊红美兰培养基，EMB）大肠杆菌在EMB培养基上的形态二、培养基的配方 一个实验班共配置3种固体培养基：牛肉膏蛋白胨培养基

4、高氏1号培养基马丁氏培养基 按照老师的划分进行，每个实验小组都要准备，几个实验小组配1种培养基，供全班使用1 1、牛肉膏蛋白胨培养基 （分离、培养细菌用）500ml/500ml/组牛肉膏 3.0g蛋白胨 10.0gNaCl 5.0g水 1000ml琼脂 1520gpH 7.47.6 可溶性淀粉 20g NaCl 0.5g KNO3 1.0g K2HPO43H2O 0.5g MgSO47H2O 0.5g FeSO47H2O 0.01g 琼脂 1525g 水 1000ml pH 7.47.6 临用时无菌操作在800ml培养基中加入3%的K2Cr2O7溶液1ml2 2、高氏1 1号培养基 （分离、培

5、养放线菌用）500ml/500ml/组 KH2PO4 1 g MgSO47H2O 0.5 g 蛋白胨 5 g 葡萄糖 10 g 琼脂 20 g 水 1000ml pH 6.0 配好后在此培养基中，按1000ml加入1%孟加拉红水溶液3.3 ml。 临用时以无菌操作在100ml培养基中加入1%的链霉素0.3ml，使其终浓度为30ug/ml。 3 3、马丁氏培养基 （分离、培养真菌用）500ml/500ml/组三、培养基配制的步骤1、计算 按照配方要求（一般为1000ml的量）和实际配制培养基的量，计算出不同组分需要的量。2、称量、溶解 按培养基配方在三角瓶中先加水（如无加入后大幅度改变原体积的物

6、质，可以把水加足），然后依次准确称取各药品并分别逐一溶解于其中（琼脂需加热溶解），最后补充水到所需体积。（注意：各成分之间发生化学反应产生不溶的沉淀；培养基成分中有影响pH试纸的显色的物质，调pH值后再加入）3、调pH 用510%NaOH、15%HCl溶液将培养基的pH调到所需范围，根据需要用精密pH试纸或pH计来确定。4、包扎（有一定规范要求） 5、灭菌（高压蒸汽灭菌：121.3,1530min） 四、培养基配制过程中需注意的事项先加水易产生沉淀逐一溶解易产生沉淀调节pH容易忘记加塞灭菌（或过滤除菌）即时灭菌煮过或加热过培养基，注意水的蒸发补足五、培养基配制中的2点说明 1、量微的药品（天平

7、无法称量），以溶液形式加入（先配制成一定浓度的溶液）； 2、粘稠的药品和物品，称好后与称量纸一起放入溶液中，待药品溶解后取出称量纸；或利用减称量法完成（从总药品量中以减量称出所需要的量）。六、无菌水的准备经灭菌处理后的蒸馏水或自来水。1、量取90mL蒸馏水在250mL三角瓶，内加玻珠 1瓶2、吸取9mL蒸馏水在18*180试管中 6支包扎后灭菌。注意！标记（记号笔）写在器皿壁或外包装纸上（如还需要高压蒸汽灭菌，只能写在外包装纸上）；不要直接写在瓶（管）塞或包装棉布上。内 容 二消 毒 与 灭 菌一、消毒、灭菌的定义和常见方法 消毒：指消灭病原菌和有害微生物的营养体。 灭菌：指杀灭一切微生物的营

8、养体、芽孢和孢子。 常见方法： 加热法：包括干热灭菌和湿热灭菌 过滤除菌 辐射灭菌 化学药品灭菌高温灭菌或消毒的方法 过滤除菌技术（正压和负压之分） 滤膜过滤器微孔滤膜（醋酸纤维、硝酸纤维、火棉胶、有机大分子物质），孔径0.22和0.45um。 玻璃滤器玻璃粉烧结板（G1G6） 蔡氏（Seitz）滤器多层石棉纤维板（整体为金属制成） 其它（不常见）陶瓷、硅藻土制滤烛形： 张伯伦（Chamberland）滤器 伯克菲尔德（Berkefeld）滤器 曼德勒尔（Mandler）滤器膜过滤装置不耐热的液体培养基的除（灭）菌膜过滤装置细菌截留于膜过滤器滤膜表面二、加热灭菌的方法1、干热灭菌法： 火焰灼烧

9、法 烘箱内热空气灭菌法2、湿热灭菌（消毒）法： 常压下：巴氏消毒法；煮沸消毒法；间 歇灭菌法。 加压下：常规加压灭法；连续加压灭菌 法。三、干热灭菌火焰灼烧灭菌和热空气灭菌两种方法。通常所说的干热灭菌是在电热干燥箱内利用高温干燥空气（160170）进行灭菌，此法适用于玻璃器皿（吸管、培养皿等）的灭菌。干热灭菌需要注意的事项不能对塑料器皿和培养基灭菌；控制好温度和时间（160180，2小时），防止包扎的报纸焦糊；灭菌过程（未完全冷下来，60 以下 ）不要打开烘箱门，防止报纸着火或玻璃器皿遇冷爆裂。四、高压蒸汽灭菌锅的结构及使用高压蒸汽灭菌的原理 高压蒸汽灭菌器是利用加压的饱和蒸汽（潜热）对物品、

10、器械、药液等灭菌的设备，适用于科学研究、医疗卫生、食品等实验室或工厂使用造成蛋白质等变性失活。 潜热是指当1g100的水蒸汽变成1g100水时，释放出2255.2J（1卡=4.184焦耳）的热量。 各种高压蒸汽灭菌器之间的区别只在于自动化程度的高低（水位控制、温度恒定控制、时间控制、自动排放冷空气、程序化显示） 饱和蒸汽压压力指示温度 直接利用温度探测器指示温度典型的高压蒸汽灭菌锅纵剖面结构压力调节器安全阀排气口控制柄记录仪门垫圈放电器蒸汽阀蒸汽夹层阻板蒸汽供给蒸汽供应阀温度感应器蒸汽凝汽瓣废汽冷凝器蒸汽通入夹层蒸汽由夹层到灭菌室夹层冷凝水收集口蒸汽由夹层进入灭菌室和蒸汽排出口卧式灭菌锅示意图

11、（简图）蒸汽进口灭菌过程出气口（冷空气和蒸汽）灭菌时间到排汽口压力表蒸汽排气阀温度计阀蒸汽供应阀门消毒室夹套（层） 立式压力灭菌器手提式灭菌锅卧式矩型和圆型压力蒸汽消毒器高压蒸汽灭菌过程：1、取出内筒，检查水位；2、加水至淹过电发热管和内筒支架；3、放入内筒，并在其中放入需灭菌物品（要求松散）；4、加盖（对称旋紧），打开放汽阀；5、加热（有内外两种），升温；6、排除冷空气由放汽阀冒汽35分钟；7、关闭放汽阀（有些灭菌锅灭菌过程中一直保持较小排气或到一定温度自动关闭） ，加压升温至所需温度或压力；8、保温定时至所需时间；9、不再加热，降温至压力表为“0”，打开放汽阀；10、开盖取物（注意蒸汽烫伤

12、）。空气排除度对灭菌温度的影响一些细菌芽孢湿热灭菌所需时间消毒、灭菌的生物指示菌 嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus） 结核分枝杆菌致病菌指示菌（Mycobacterium tuberculosis 沙门氏菌致病菌指示菌（通用检测）（Salmonella spp） 高压蒸汽灭菌效果的监测方法（3种） 1、工艺（程序）监测压力表、温度计等，最常见，每次都使用； 2、化学指示监测 特定化合物熔点（熔化前后晶体形态不同，硫磺熔点115、乙酰替苯胺116、脱水琥珀酸120、苯甲酸122.4等结晶 ）、灭菌指示胶带（变色反应）； 3、生物指示剂监测 特定微生物（需经

13、培养）。五、实验室常用灭菌方法 1、高压蒸汽灭菌常用121.3，20min和115，10min两种条件进行；适用于耐热性溶液、培养基和水的灭菌； 2、热空气干热灭菌160170，2hr；适用于玻璃器皿和金属工具的灭菌； 3、灼烧灭菌酒精灯和电加热，适用于接种工具的灭菌； 4、过滤除菌现在一般使用微孔滤膜（0.22m或0.45m），适用于非耐热性溶液和培养基的过滤除菌。内 容 三相关器皿的包扎方法一、器皿包扎的作用 1、湿热灭菌时防止冷凝水的污染； 2、灭菌后可以长期放置，保持器皿等的无菌状态和防止灰尘的污染。二、相关器皿的包扎要求 利用报纸、牛皮纸或专用器械包扎，重点练习报纸包扎。 1、培养皿的包扎 双层大报纸、12套包扎成1包 2、吸管的的包扎 吸管先塞棉花（松紧适度），利用宽5cm左右的长条形报纸裹扎 3、试管和三角瓶的包扎 4、涂布器 （刮子）的包扎三、包扎中的几点说明 包扎纸大小适中，器皿或器材不外露，塞子、纱（棉）布、瓶口、管口等不外露。 包扎试管和三角瓶时，包扎线向下一点，不要扎在塞子上。 装有培养基等液体的容器，包扎过程或包扎好后不要倒置（包括水平放置），以免造成污染（塞子）和内装液体不准。四、利用吸管筒（铜制或不锈钢制）包扎吸管灭菌不锈钢吸管筒、培养皿筒本次实验完成的内容1、90mL无菌水1瓶（250mL三角瓶，内