深低温保存血小板制备与质量控制

1、会计学1深低温保存血小板制备与质量控制深低温保存血小板制备与质量控制离心机冰箱血小板全血ACD200ml采血袋全血全血血小板DMSO-80冰冻血小板血小板5%DMSO血小板37循环式水浴箱冰冻血小板血小板DMSO超滤DMSO装置G6漏斗、电动吸引器全自动血细胞计数仪德国Heraeus离心机Cryofuge 8000或6000I超净工作台血细胞分离机-80低温冰箱38循环式水浴箱分浆夹、热合机24G头皮针一次性10ml无菌注射器称量仪、自动加样器G6漏斗、收集瓶、分装瓶的准备将G6漏斗、收集瓶、分装瓶先用长水冲洗，硫酸-高锰酸钾液浸泡24小时，流水冲洗后用双蒸水冲洗、浸泡，然后包装，通过高压蒸汽

2、消毒（136，6-8分钟）。超滤后500ml/瓶分装好避免光，置于洁净环境室温保存。DMSO的超滤和保存在无菌间，超净工作台中，将购置的DMSO用G6漏斗负压抽滤。 从全血采集到制备血小板的全过程，均要求在222环境中6小时内完成（包括离心温度）。即使不立即制备，也不要将全血放入冰箱4保存，以免影响血小板质量。 离心是制备冰冻富含血小板血浆最重要的环节之一。选择最佳离心条件的目的，是为了使获得的富含血小板血浆中血小板浓度较高，而红细胞、白细胞污染少。选择最佳离心条件的方法需要根据各单位的具体条件来确定。 我科采用析因设计确定最佳离心条件。测定ACD全血、FPRP内血小板计数和FPRP体积，计算

3、所得血小板数和血小板得率，确定最佳离心条件。 室温(18-22左右)条件下，用三联采血袋采集健康献血者ACD-B抗凝全血200ml。要求采血流畅，采血时间3min。预实验表明采用德国Heraeus Cryofuge 8000和6000I离心机，加速度为9档，减速度为4档的条件下，在400-650g离心5-11min 血小板得率较高。二因素离心力离心时间400g480g560g650g5min7min9min11min四水平组合成16种离心条件 通过计算各条件下血小板得率，同时参考白细胞和红细胞污染率，选取最佳离心条件。 222条件下，采用德国Heraeus Cryofuge 8000离心机，加

4、速度为9档，减速度为4档，480g，离心7min条件下，平均得率为70%。红细胞污染1109/单位；白细胞污染5107/单位。 从ACD全血离心制备的FPRP质量，不仅与离心机的离心速度有关，而且与血液体积、血球压积、离心机启动加速度和减速度密切相关。其中离心机性能非常重要。 由于离心后ACD全血中的红细胞压得不紧，容易因为振摇和非匀速运动而泛起，混入FPRP中。共振明显的离心机不适于制备富含血小板血浆。合适的离心机减速度档选择低档较好。 离心时要采取措施如仔细系绑等，防止血袋在离心杯内出现皱折或塌伏，减少分离时红细胞污染。 离心完毕，要轻拿轻放，尽量减少搬动次数。最好将离心好的血液直接从离心

5、杯中轻轻转移到分浆夹中。分离上层FPRP应该用止血钳控制速度。速度以慢为好，至少要先快后慢。否则将会减少血小板得率，增加红细胞和白细胞污染。 二甲基亚砜（DMSO）:化学试剂、分析纯、分子式：C2H6OS、分子量：78.13，凝点约18.3-18.5、沸点：1 8 9 - 1 9 2 ， 比 重 ： 1 . 0 9 9 -1.109g/ml,为无色稀薄液体、略带苦味，易吸潮、具特殊臭味（大蒜样味）。 本药品口服及皮肤给药均易吸收，皮下注射4-8小时，一部分以原形从尿中排泄、还有少部分经肺排出。 DMSO在冰冻血小板中主要作为一种防冻剂，保护血小板膜。在缓慢加入DMSO时，DMSO将血小板包围起

6、来，既起到保护作用又可抑制血小板的凝集、聚合作用。 DMSO有抑菌作用，DMSO浓度为8%时，能抑制92%的绿脓杆菌生长、浓度为15%时，能抑制的大肠杆菌和巨大芽胞杆菌生长、但高浓度使用本品不能代替灭菌。 DMSO使用前要经G6漏斗滤除杂物、细菌、热原质等。装放在洁净无菌的玻璃瓶中，室温保存。 离心后轻轻分离上层新鲜PRP（FPRP），经过称量，在洁净的环境中采用无菌技术，用一次性10ml注射器和24G头皮针缓慢（5min）加入超滤DMSO，终浓度为5% 。需要添加DMSO量的简单计算方法：DMSO（ml）=富含血小板血浆（ml）0.05在加入DMSO过程中，要用一定强度充分混匀，避免局部产热

7、。盒装后直接放入-85冰箱保存。 5%DMSO在室温下2-3小时内对血小板通常无明显毒性作用。加入5%DMSO后，血小板激活标志物CD62p（P选择素）和磷脂酰丝氨酸阳性率稍微增加，这与DMSO加入方式有关。 将高浓度的DMSO加入FPRP中会有局部产热现象，如果加入过快，可使局部温度过高，引起血小板激活。 CD62p阳性率升高幅度与DMSO添加的速度和混合方式密切相关。过快的添加速度和剧烈振荡可以使CD62p阳性率明显升高。在DMSO加入的过程中，人工添加要求采取正确的振荡方式和合适的添加速度。最好采用机械自动加入和自动摇床，有利于操作标准化和质量控制。 检测献血者外周血血小板计数 要求献血

8、者PLT150109/L 要 求 分 离 后 血 小 板 个 数 2.01010个/袋 红细胞污染1109/U 白细胞污染5107/U 每月抽样5袋，做血小板，白细胞 红细胞计数，细菌培养，及五项实验 （ALT，HBsAg，HCV，HIV，USR） 取机采新鲜浓缩血小板，在洁净的环境中采用无菌技术，用一次性10ml注射器和24G头皮针往血小板收集袋中，缓慢（10分钟）加入超滤DMSO，终浓度为5%。需要添加DMSO量的简单计算方法同上。折叠好，盒装后直接放入-80冰箱保存。 根据患者需要的治疗剂量，取出相应数量的冰冻PRP，置于38-42循环式水浴箱快速解冻。 输注方法同液体保存血小板。用输血

9、器尽快输注。谢 谢！二因素离心力离心时间400g480g560g650g5min7min9min11min四水平组合成16种离心条件 222条件下，采用德国Heraeus Cryofuge 8000离心机，加速度为9档，减速度为4档，480g，离心7min条件下，平均得率为70%。红细胞污染1109/单位；白细胞污染5107/单位。 从ACD全血离心制备的FPRP质量，不仅与离心机的离心速度有关，而且与血液体积、血球压积、离心机启动加速度和减速度密切相关。其中离心机性能非常重要。 DMSO有抑菌作用，DMSO浓度为8%时，能抑制92%的绿脓杆菌生长、浓度为15%时，能抑制的大肠杆菌和巨大芽胞杆菌生长、但高浓度使用本品不能代替灭菌。 检测献血者外周血血小板计数 要求献血者PLT150109/L 要 求 分 离 后 血 小 板 个 数 2.01010个/袋 红细胞污染1109/U 白细胞污染5107/U 每月抽样5袋，做血小板，白细胞 红细胞计数，细