第14章_核酸的物理化学性质

1、一、核酸的水解一、核酸的水解 核酸嘌呤碱的核酸嘌呤碱的N9和嘧啶碱的和嘧啶碱的N1与戊与戊糖的糖的C1形成形成N糖苷键糖苷键。磷酸基与。磷酸基与2种戊种戊糖分别形成核糖磷酸酯和脱氧核糖磷酸糖分别形成核糖磷酸酯和脱氧核糖磷酸酯。所有这些酯。所有这些糖苷键糖苷键与与磷酸酯键磷酸酯键都能被都能被酸，碱和酶水解。酸，碱和酶水解。N-糖苷键（一）酸或碱水解（一）酸或碱水解 核酸中的核酸中的磷酸二酯键磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断，但可在酸或碱性条件下水解切断，但DNADNA和和RNARNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。对酸或碱的耐受程度有很大差别。 如：在如：在0.10.1mol/L NaOHmo

2、l/L NaOH溶液中，溶液中，RNARNA几乎可以完全水解，几乎可以完全水解，生成生成2 2 或或33磷酸核苷，磷酸核苷，DNADNA在同样条件则不受影响。在同样条件则不受影响。这种水解性能上的差别与这种水解性能上的差别与RNARNA核糖基上核糖基上22OHOH的邻基参与作的邻基参与作用有很大的关系，在用有很大的关系，在RNARNA水解时，水解时，22OHOH首先进攻磷酸基，首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯环状磷酸二酯，再在碱的作用下形，再在碱的作用下形成水解产物。成水解产物。 但在酸性条件下，但在酸性条件下，DNADNA的糖苷键比的糖苷键比RNARN

3、A的糖苷键易水解的糖苷键易水解，嘌呤碱基比嘧啶碱基易水解嘌呤碱基比嘧啶碱基易水解，如，如DNADNA的嘌呤碱在的嘌呤碱在 pH2 pH2 以下即以下即可脱落而使可脱落而使DNADNA成为无嘌呤酸。成为无嘌呤酸。 （二）酶水解（二）酶水解 生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。核苷酸链中的磷酸二酯键。1 1、按作用底物分类、按作用底物分类 以以DNADNA为底物的为底物的DNADNA水解酶（水解酶（DNasesDNases）和以和以RNARNA为底物的为底物的RNARNA水解酶（水解酶（RNasesRNases

4、）。 2 2、按磷酸二酯键断裂方式分：作用于、按磷酸二酯键断裂方式分：作用于33磷酸酯键磷酸酯键（降解（降解核苷酸带核苷酸带55磷酸）；磷酸）；b b、作用于作用于55磷酸酯键磷酸酯键（降解核苷（降解核苷酸带酸带33磷酸）。磷酸）。 3、根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和、根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶核酸内切酶 1 1）核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端）核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3-3-端或端或5-5-端）开始，逐个水解切除核苷酸；端）开始，逐个水解切除核苷酸； 2 2）核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从）核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶

5、相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。4、常用核酸酶、常用核酸酶1 1）核糖核酸酶核糖核酸酶 牛胰核糖核酸酶（简称牛胰核糖核酸酶（简称RNaseRNase，其作用点为其作用点为33嘧嘧啶核苷酸啶核苷酸与其它核苷酸之间的连键，产物为与其它核苷酸之间的连键，产物为33嘧啶嘧啶核苷酸或以核苷酸或以33嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸）；嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸）； 核糖核酸酶核糖核酸酶T T1 1（其有比其有比RNaseRNase更高的专一性，它的更高的专一性，它的作用点为作用点为33鸟苷酸与其相邻核苷酸的鸟苷酸与其相邻核苷酸的55OHOH

6、之间的之间的连键，产物为连键，产物为33鸟苷酸鸟苷酸或以或以33鸟苷酸为结尾的寡鸟苷酸为结尾的寡核苷酸）；核苷酸）； 核糖核酸酶核糖核酸酶T T2 2（其作用位点为其作用位点为ApAp残基，可以将残基，可以将tRNAtRNA完完全降解为全降解为33腺苷酸腺苷酸结尾的寡核苷酸结尾的寡核苷酸) )。RNaseRNase2 2）脱氧核糖核酸酶）脱氧核糖核酸酶 （1 1）牛胰脱氧核糖核酸酶（）牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseDNase），此酶断开双此酶断开双链链DNADNA或单链或单链DNADNA成为成为55磷酸磷酸为末端的寡核苷酸，平为末端的寡核苷酸，平均长度为均长度为4 4个核苷酸；个核苷酸； （2

7、 2）牛脾脱氧核糖核酸酶（）牛脾脱氧核糖核酸酶（ DNaseDNase ），此酶只降），此酶只降解解DNADNA成为成为33磷酸磷酸末端的寡核苷酸，平均长度为末端的寡核苷酸，平均长度为6 6核核苷酸苷酸; ; （3 3）链球菌脱氧核糖核酸酶，其只作用于）链球菌脱氧核糖核酸酶，其只作用于DNADNA，产物产物为为55磷酸为末端的碎片，其长度不一，需磷酸为末端的碎片，其长度不一，需MgMg2+2+。3 3）内切酶）内切酶二、核酸的酸碱性质二、核酸的酸碱性质 核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解离，因此核酸是两核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解离，因此核酸是两性电解质。性电解质。 与蛋白质相似，核酸分

8、子中既含有酸性基团（磷酸基）也与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质。含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质。 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如DNADNA的等电点的等电点为为4 44.54.5，RNARNA的等电点为的等电点为2 22.52.5。 RNA RNA的等电点比的等电点比DNADNA低的原因，是低的原因，是RNARNA分子中核糖基分子中核糖基2-2-OHOH通过氢键促进了

9、磷酸基上质子的解离，通过氢键促进了磷酸基上质子的解离，DNADNA没有这种作用。没有这种作用。三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收1 1、原理：、原理： 嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240240290290nmnm的紫外波段有一强烈的吸收的紫外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在峰，最大吸收值在260260nmnm附近。附近。DNA2、应用、应用 1 1）不同核苷酸有不同吸收特性，可用紫外分光光度计进行）不同核苷酸有不同吸收特性，可用紫外分光光度计进行定性、定量测定。定性、定量测定。 A A值为值为1 1相当于：

10、相当于：5050g/ml DNAg/ml DNA 40g/ml RNA 40g/ml RNA 20g/ml Nt( 20g/ml Nt(寡核苷酸）寡核苷酸） 对于不纯的核酸可用琼脂糖凝胶电泳分离出区带之后，对于不纯的核酸可用琼脂糖凝胶电泳分离出区带之后，经经EBEB染色后在紫外灯下粗略的估计其含量。染色后在紫外灯下粗略的估计其含量。2）确定所提取的核酸是否纯品。）确定所提取的核酸是否纯品。 1）DNA： 1.8 纯品 OD260/OD280 1.8 RNA 污染 1.8 protein污染 2）RNA： OD260/OD280 2.0 纯品3）判断）判断DNA制剂是否发生变形或降解制剂是否发生

11、变形或降解 核酸的溶液的紫外吸收又可以用摩尔磷的吸光度核酸的溶液的紫外吸收又可以用摩尔磷的吸光度 （ P ）表示：表示： 其中其中A为吸光值，为吸光值，c为每升溶液中磷的摩尔数，为每升溶液中磷的摩尔数，L为比色杯内径。摩尔为比色杯内径。摩尔磷即相当于摩尔核苷酸磷即相当于摩尔核苷酸.（ P ）AcL 研究发现，研究发现，DNADNA双螺旋结构可使双螺旋结构可使碱基对堆积，造成碱基对堆积，造成电子云重叠，电子云重叠，产生低吸收效应，如产生低吸收效应，如变性破坏变性破坏DNADNA的碱基对，则可使紫外线吸收增加的碱基对，则可使紫外线吸收增加大约大约2525，此现象称，此现象称增色效应增色效应。据。据

12、此我们可判断此我们可判断 DNA DNA 制剂是否发生制剂是否发生变化。变化。 如如 D N AD N A 的 摩 尔 磷 紫 外 吸 收的 摩 尔 磷 紫 外 吸 收 （ P P ）约为约为60006000， 变性后变为变性后变为1000010000。四、核酸的变性、复性及杂交四、核酸的变性、复性及杂交 （一）（一）DNADNA变性变性 1 1、概念：它是指、概念：它是指 DNA DNA 双螺旋区的双螺旋区的氢键氢键断裂，变成单链，并断裂，变成单链，并不涉及不涉及共价键共价键的断裂的断裂。 如多核苷酸骨架上共价键断裂则称为如多核苷酸骨架上共价键断裂则称为核酸的降解核酸的降解，降解，降解可使核

13、酸相对分子量降低。可使核酸相对分子量降低。 1）核酸变性后形态的改变）核酸变性后形态的改变 双螺旋双螺旋DNADNA和具双螺旋区的和具双螺旋区的RNARNA氢键断裂，空间结构被氢键断裂，空间结构被破坏，形成单链无规则线团状的过程破坏，形成单链无规则线团状的过程。2 2）结果：）结果： A A、增色效应：增色效应：260260nmnm紫外吸收增加；紫外吸收增加； B B、粘度下降、浮力密度上升；粘度下降、浮力密度上升； C C、生物学性能部分或全部丧失。生物学性能部分或全部丧失。3 3）引起变性的因素：）引起变性的因素： 温度、温度、pHpH、尿素尿素（测定（测定DNADNA序列时常用的变序列时

14、常用的变性剂）、性剂）、甲醛甲醛（测定（测定RNARNA分子大小时常用的变分子大小时常用的变性剂）等。性剂）等。 1 1）TmTm定义：当定义：当DNADNA的的稀盐溶液加热到稀盐溶液加热到8080100100度时，双螺旋结构解体，度时，双螺旋结构解体，形成无规则线团，研究发形成无规则线团，研究发现，现，DNADNA的变性是的变性是爆发式爆发式的，变性作用发生在一个的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内，有一很窄的温度范围内，有一个相变的过程，通常把加个相变的过程，通常把加热变性使热变性使DNADNA的双螺旋结的双螺旋结构失去构失去一半一半时的温度称为时的温度称为该该DNADNA的熔点或熔解温

15、度的熔点或熔解温度（melting temperature), melting temperature), 用用TmTm表示。表示。DNADNA的的TmTm一般一般在在82829595C C之间。之间。2、核酸变性示例、核酸变性示例热变性与热变性与Tm2 2）DNA TmDNA Tm值的影响因素值的影响因素 （1 1）DNADNA的均一性的均一性 均质均质DNADNA如一些病毒的如一些病毒的DNADNA，人工合成的多聚腺嘌呤胸腺人工合成的多聚腺嘌呤胸腺嘧啶脱氧核苷酸熔解过程发生嘧啶脱氧核苷酸熔解过程发生在一个较小的温度范围之内，在一个较小的温度范围之内，异质异质DNADNA熔解的过程发生在一熔

16、解的过程发生在一个较宽的温度范围之内，所以个较宽的温度范围之内，所以T Tm m值可作为衡量值可作为衡量DNADNA样品样品均一均一性性的标准。的标准。（2 2）G-CG-C的含量的含量 在在pH7.0,0.165mol/L NaClpH7.0,0.165mol/L NaCl中中DNADNA的的T Tm m值与值与G GC C含量之间有正比含量之间有正比关系，关系，G GC C对含量越多，对含量越多，T Tm m值越高，这是因为值越高，这是因为G GC C对之间有对之间有3 3个氢个氢键，所以含键，所以含G GC C对多的对多的DNADNA分子更为稳定，因此，测定分子更为稳定，因此，测定T T

17、m m 值，可值，可以推算出以推算出DNADNA的碱基的百分组成，经验公式为：的碱基的百分组成，经验公式为： x xG GC C=(Tm=(Tm69.369.3）2.442.44，同样也可从同样也可从DNADNA的的G GC C含量来计算含量来计算出出T Tm m的值。的值。（3 3）介质中的离子强度）介质中的离子强度 一般说离子强度较低的介质中，一般说离子强度较低的介质中，DNADNA的熔解温度较低，而且熔解的熔解温度较低，而且熔解温度的范围较宽，而在较高的离子强度时，温度的范围较宽，而在较高的离子强度时，DNADNA的的T Tm m较高，而且熔解较高，而且熔解过程发生在一个较小的温度范围之

18、内，所以过程发生在一个较小的温度范围之内，所以DNADNA制品不应保存在极制品不应保存在极稀的电解质溶液之中，一般在稀的电解质溶液之中，一般在含盐含盐缓冲溶液中保存较为稳定。缓冲溶液中保存较为稳定。（二）（二）RNARNA的变性的变性 RNARNA具有螺旋线团具有螺旋线团之间的转变，但是由于之间的转变，但是由于RNARNA只有局部的双螺旋只有局部的双螺旋区，所以这种转变不如区，所以这种转变不如DNADNA那样明显。变性曲那样明显。变性曲线不那么陡，线不那么陡，T Tm m值较低。值较低。但但tRNAtRNA具有较多的双螺具有较多的双螺旋区，故也具有较高的旋区，故也具有较高的T Tm m值，变性

19、曲线也较陡。值，变性曲线也较陡。双链双链RNARNA的变性几乎与的变性几乎与DNADNA的相同。的相同。 rRNA和双链和双链RNA热变性曲线热变性曲线1：一种浮萍的：一种浮萍的18SrRNA；2：酵母的杀伤酵母的杀伤RNA在在0.017M Na和和67甲酰胺中变性；甲酰胺中变性；3：同：同2，但无甲酰胺（变性剂），但无甲酰胺（变性剂）（二）复性（二）复性1、概念：、概念： 变性变性DNADNA在适当条件下（缓慢降温），可使两条彼此分在适当条件下（缓慢降温），可使两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构的过程。复性后，开的链重新缔合成双螺旋结构的过程。复性后，许多物化许多物化性质可得到恢复，生物学

20、活性性质可得到恢复，生物学活性部分部分恢复恢复。 1 1）温度（将热变性）温度（将热变性DNADNA骤然冷却时，骤然冷却时，DNADNA不可复性，而不可复性，而DNADNA缓慢冷却时，可以复性，此过程称为缓慢冷却时，可以复性，此过程称为退火退火 annealingannealing）；）； 2 2）DNADNA片段大小（片段大小（DNADNA片段越大，复性越慢）；片段越大，复性越慢）； 3 3）DNADNA浓度（浓度（DNADNA浓度越大，复性越快）；浓度越大，复性越快）； 4 4）碱基重复序列多少（重复序列越多复性越快）。）碱基重复序列多少（重复序列越多复性越快）。 2、复性影响因素、复性影

21、响因素 在一定的条件下，复性反应的速度可以用在一定的条件下，复性反应的速度可以用Cot 1/2Cot 1/2来衡量。来衡量。其中其中CoCo为变性为变性DNADNA复性时的初始浓度，以核苷酸的摩尔浓度表复性时的初始浓度，以核苷酸的摩尔浓度表示，示，t t为时间，以秒表示，为时间，以秒表示，Cot Cot 表示复性一半的表示复性一半的CotCot值值。3 3、Cot Cot 1/21/2浓度相同但浓度相同但来源不同的来源不同的DNA,DNA,复性时复性时间的长短与间的长短与基因组大小基因组大小有关。有关。1 1、概念：将不同来源、概念：将不同来源的的DNADNA放在试管里，放在试管里，经热变性后，慢慢冷经热变性后，慢慢冷却，让其复性。若这却，让其复性。若这些异源些异源DNADNA之间在某之间在某些区域有相同的序列，些区域有相同的序列，则复性时，会形成杂则复性时，会形成杂交交DNADNA。DNADNA与互补的与互补的RNARNA之间也可以发生之间也可以发生杂交。杂交。（三）核酸的杂交（三）核酸的杂交（hybridization）2 、应用、应用1 1、制备探针（、制备探针（probe)probe)，用于疾病诊断用于疾病诊断 1 1）概念：一小段（十几至数百）多聚核苷酸单链用）概念：一小段（十几至数百）多聚核苷酸单链用 32 32P P、3535S S或生物素标记其