翁长秀山茶属外植体区域特异性胚胎发生能力和植株再生

1、In Vitro Cell. Dev. Biol. 31:8-14, January 1995 1995 Society for In Vitro Biology 1054-5476,/95 $02.50+0.00 山茶外植体区域特异性胚胎发生能力和植株再生 M. CRISTINA PEDROSO AND M. SALOMI PAIS Departamento de Biologia Vegetal, Faculdade de Cincias, Universidade de Lisboa, Bloco C2, Piso 1, Campo Grande, P-1700 Lisboa, Port

2、ugal （接收于1994年4月21日 ；接受于1994年8月31日;编辑：T. A. Thorpe) 摘要 建立了山茶 cv. Elegans 和 cv. Villc de Nantes直接、间接、重复胚胎发生的培养条件。在加了1.0mg/LN6苄基腺嘌呤和0.5mg/L 2，4-D的MS培养基上，每个叶片平均直接产生15.3个胚胎，每个叶片产生(7.11.5)株植物。在加了1.0mg/LN6-苄基腺嘌呤和0.1mg/L吲哚乙酸的MS培养基上，从茎的直接胚胎发生，平均每个芽产生5.7个胚胎，每个茎产生2.7个。只有在重复胚胎发生以后才能获得转换。来源于叶的愈伤组织转移到MS/2-25培养基后

3、，这些愈伤组织都能产生胚胎。每个愈伤组织产生(16.33.6)株植物。重复胚胎发生增加了胚胎的产量，每四个星期能达到2.3到3.6倍。 在加了2.0mg/LN6-苄基腺嘌呤，0.2mg/L吲哚乙酸和5mg/L赤霉素的MS培养基上，可以获得次级胚胎的转换。从叶、茎、子叶的直接胚胎发生，以及从叶得到胚性愈伤组织，这些都受限于外植体的特定区域。 关键词：能力，循环胚胎发生，嵌合体胚胎发生，植物再生，山茶科，木本植物。 介绍 嵌合体胚胎发生首先在1958年有Steward et al. 和 Reinert报道。尽管过去15年进行了嵌合体胚胎发生的生理、生化、分子方面的研究，而且对于这一过程的基本知识有

4、了一定了解，但是关于影响诱导这一过程的因素以及胚胎发生的意义的知识还是比较缺乏。嵌合体胚胎发生的不同步性和少量的真正类型的胚胎发生的效率被指出是缺点。嵌合体胚胎发生为获得大规模克隆繁殖和人工种子，还有转基因植物的克隆繁殖提供了有用的体系。山茶的嵌合体胚胎发生已经从胚胎组织，叶，茎，根，细胞悬浮培养获得。通过可以控制的和可以再生的途径在特异的外植体区域诱导直接胚胎发生，给胚胎提供了一个结构、生理、活力和受精卵相似的环境，这会是研究植物细胞中胚胎发生能力的表达和决定的很好的体系。这些特点，在加上胚胎产生和植株再生的高频率，使得这成为用于繁殖的优良体系。 这里我们报道了从山茶属叶、茎、子叶的特定区域

5、的直接、间接胚胎发生和植株再生。 材料和方法 植物材料 从C. japonica cv. Elegans和cv.Vifle de Nantes中得到的嫩枝在预培养12周之后，作为叶片和茎干的来源。嫩枝是从顶端尖端处和在体外发芽秧的节点段引发的，像先前一样，得预培养四个周期后再使用。 实验条件 除非另有说明，培养条件如同先前。培养在改良后的MS培养基中，pH5.5, 温度 24+/ -1 C,放在 16h光照下(26 #E. m -2 s-l; 寒冷的白色荧光Grolux Sylvania灯)。培养基中加入7g/L琼脂作为支持剂，每两周进行一次培养观察。实验中要求对于每个培养基都采取同一条件下的

6、培养方法。显微镜进行观测应该使用立体奥林匹斯显微镜(S2H、日本)epifluorescence倒排光尼康相机显微镜(Narashige、日本)。照片拍摄换成黑白打印后，应该使用400ASA的Ektachrome柯达胶片。 直接胚状体和分化 在完全离体培养了12周时间后的枝条液体改良MS培养基中添加25 g/L的 D-葡萄糖, 1.0 mg/L的Nt-benzyladenine (BA),和0.5mg/L的2，4-D，平均每20叶在250 ml Erlenmeyers烧瓶装了80毫升的液体培养基中培养。待结束后,放入一个双人铝箔培养(国内使用)。培养的转数为80 rpm.，每个实验重复10次，

7、6到10烧瓶，历时3年。外植体的胚胎发生和胚胎的形成的数量及与外植体的比例，在培养开始6周后记录。在这培养期间，20毫升旧的培养基被同等体积的MS28的培养液代替，MS培养基中以25g/L D-葡萄糖、1.0mg/LBA和0.1mg/L IBA补充。两周后，外植体（叶嵌合体胚）被转移到固体MS28培养基上培养以使得胚成熟。5到10组织(取决于叶子的大小)培养在用300cm3的玻璃器皿配制的35毫升的固体培养基中，并且用塑料瓶盖封住。胚胎转换和离体植株的再生在MS56培养基（MS28培养基中的生长调节剂浓度加了一倍，并加入GA35mg/L）中进行，胚胎转换和离体植株的产生（每片叶子正常发育成海棠

8、离体新梢的数量）在转移到MS56培养基后，每隔4和8周分别记录数目。 直接胚的形成是从MS28培养基上通过保持在同一培养基上超过12周的亚培养后所获得的嫩枝的基部发生的，重复两次实验，历时3年，每次试验用15个容器（20-30个嫩枝每容器）。茎干的一部分(5 到10 mm)培养在固体MS28中是用于直接胚诱导。每50个移植组织放入500 cm 3装满100 ml的固体培养基中，放在16h的光照下培养(26 gE. m -2 s-1)。外植体胚发生的比例和每个外植体形成胚的数目（每外植体产生胚的产量）在培养开始12周后开始记录。实验在3年内重复8次，每次化验5个器皿。 间接胚状体和分化，将整片叶

9、预培养在固体和液体MS6培养基中，在改良的 MS培养基中添加20g/L 蔗糖、1mg/L 2,4-D以及0.1mg/L的细胞分裂素。外植体的预培养周期是4周，根据初步结果，用25g/L的D-葡萄糖代替蔗糖的效果已经被测试出(MS9 培养基)。选择胚性愈伤组织是根据它们的起源以及培养的不同方式决定的。在培养开始8至12周后，胚性愈伤组织在固体和液体的基础上形成，然后转移到固体MS28培养基上培养，以利于诱导胚(感应阶段)。在培养8周后，愈伤组织被转移到补充了25g/L D-葡萄糖的1/2MS培养基，以利于胚胎发育(生产期)。胚胎转换发生在同一培养液中，无须转换到新的培养基中。当接种于MS28培养

10、基6周后并接种于MS/2-25培养基1,4,6,8周后，记录形成胚胎（胚胎外植体）愈伤组织的百分比和每单位愈伤组织胚胎的数量。每4周把次培养基放入新鲜的培养基中。在MS/2-25培养基培养12周后记录每立方厘米愈伤组织幼苗的数量。 重复胚胎，由叶子和茎繁殖而来的胚胎在子叶发展阶段，培养在MS28的培养基中并降低光照。每6周接种于新的培养基中。在接种于新的培养基中四周后，记录每个嵌合体胚胎（每个外植体胚胎的数量）胚胎子叶的百分比和胚胎的数量。 微繁殖并植入土壤。由体细胞繁殖而来的幼苗在MS28的培养基中微繁殖，称之为初期阶段。根据vieitez 和 barciela 制定装盆和适应环境的药物配制

11、报告。 组织学。在形成嵌合体胚胎的外植体和所获得的胚胎上，制作切片。切片浮在水面上，并在尼康光学显微镜下观察。胚胎外植体区域的解剖图基于手制切，在叶子切片中所示的次生维管束仅具代表性。 山茶的胚状体 表1 C. JAPONICA植物嵌合体胚的发生和植物复苏利用直接的、间接的和重复胚 直接胚 间接胚 重复胚 - - - - 培养基时间全叶 基嫩枝的基部 茎部 培养基 时间 Group I Group 1I Group III 培养基时间 体细胞胚胚胎体 MS13 3 30.9% MS28 - - - MS/2-25 1周 0% 100% 0% MS28 4周 76.4% 6 60.1% 2-3%

12、 15.1% 12 2-3% 77.6%胚产量 MS13 6 15.3 MS28 5.7 2.7 MS/2-25 4 0 33.5 0 MS28 4 4.3(_+9.1) (-+1.7) (-+1.2) (-+0.8) (-+2.3) 外植体的转换MS56 4 3 7-89% 重复胚后 MS/2-25 6 0 95% 0 MS56 4 35-79%离体培养植株产量MS56 8 7.1 - - - - MS/2-25 12 0 16.3 0 MS56 6 4.1(41.5) (_+3.6l (_+0.9) MS13, MS 培养基包括 1.0 mg/L BA和 0.5 mg/L -2,4-D;

13、MS28, MS 培养基包括 1.0 g/L BA 和 0.1 mg./L IBA, MS56, MS 培养基含有2.0g/L BA, 0.2 mg/L IBA 和 5 g/L GA3; MS/2-25, MS 培养基含有 25g/LD-葡萄糖 结果 在不同品种的之间，在胚胎发生能力以及植株复苏方面几乎没有很显著的区别,培养的结果都是相同的。 胚胎的直接发生和植株的再产生，在MS13培养基培养叶片两至三周后，在茎叶的表面有30.9%的叶片变得膨胀和透明的白色，叶部分显示,高皮下层细胞的数量分为形式再生胚胎.随着再生胚的发展，叶子胚发生的部位产生越来越饱满的现象。在4和6个星期的培养内，植物嵌合

14、体胚叶表皮上快速生长.。胚胎起源于栅栏叶片中薄壁组织细胞, 远离维管束(叶胚发生区域)。根据他们的方向树叶中的胚胎的薄壁组织也不发达。这经常导致那些根原基早熟的发展，或使在一个较高的细胞上部的胚胎增殖。在正常情况下,子叶也就形成了，透明的白色的胚胎与光滑的表面形成了紧凑的结构。他们总体保持在那片叶子上形成集群。剩余的集群在胚胎成熟以前发芽，胚胎形成一致的合子。经常很少（2-3%）的球形胚与其余分化叶组织能在培养基上孤立发育。虽然这些胚胎是双极结构, 他们从不同形态得出了胚胎是半透明的。转移到固体培养基2周后，胚胎发生转换。胚胎只有从集群里才能发展成海棠离体新梢。它们从第一片叶子开始发育，对于胚

15、胎发芽来说它们转换是相似的。当转移到固体介质, 在经历了重复的胚悬浮培养，胚胎变得发达，但绝不会发展成海棠离体新梢。直接从整个叶体细胞发育成胚途径已经在表1进行了总结。转换的胚胎受到集群簇移植胚胎数目形成了更高的小集群(79%为集群小于10胚胎)。通常,胚胎转换导致生产几个腋窝型嫩枝，在某些情况下会发生异常的胚胎转换，最高的是大胚胎星团达到37.5%。当转移到土壤重复培养后，观察到只有11%胚胎能正常发育成海棠离体新梢。 嫩枝和茎干部分 直接从胚根基部的2 - 3%部分观察，胚胎形成于集群中相同的(形态学和组织学)合子中，胚胎形成于没有发育海棠离体新梢，但重复胚培养在MS28培养基中。胚胎转换

16、由次生胚获得胚胎，相对于胚根基部的生长，末端的培养部分的增加使得体细胞胚胎加快生长。至于在叶片上的直接胚状体，箴胚胎形成总是从皮下干薄壁组织开始，通过破裂了的胚胎表皮或断端根干段产生。虽然胚发生的百分比为77.6%发生率很高，胚胎生产却很低，并且低于标记的胚胎基部生产的嫩枝枝及整个叶片。茎干部分衍生的胚胎只有在MS / 2-25 培养基上重复培养后，转移到MS56培养基上培养一段时间才能得到。 间接胚状体和分化 胚性愈伤组织的形成有91.6%是在在固体和液体MS6培养的叶片的基部出现的，有48.9%在叶片中产生，主要脉是23.7%，培养在MS9液体生产中增加67.8%叶片愈伤组织。 这三组愈伤

17、组织的获得都是独立培养的，第一组的愈伤组织是生根的，而第三组的愈伤组织是非形态因子，只有第二组愈伤组织能产生胚胎。这些愈伤组织起源于皮下层叶片的薄壁组织细胞，可用来观察叶产生植物体细胞胚，胚胎的形成在感应阶段(MS28中)是非常少见的。再6周转接后，可观察有4%愈伤组织的转移，一个愈伤组织能够产生4到7个胚，一周后转接到MS/2-25中（产生阶段)。可以看到球形胚是100%的愈伤组织转移形成的 (表1)。在MS/2-25培养中胚胎的形成需要经过三个周期。第一步，转接一周后，胚胎的产生是不同步的而且很低(一个愈伤组织产生一到四个胚)。第二步，4周后转接，胚胎产生是同步的而且很高(在99.8%的愈

18、伤组织中), 每个愈伤组织能够形成33.5(+ 0.8)胚胎 (表1)。第三个周期，在转接至生长培养基中后8周形成，也是同步产生的。转接期间有一个优先发育顶芽。如果培养基上发生了变化，根原基可以进一步发展。海棠离体新梢数每个愈伤组织形成非常高，达到 (163 + 3.6海棠离体新梢每厘米),愈伤组织诱导不再是可见的。海棠离体新梢只能够在震荡的培养基中发育，通过观察，海棠离体新梢没有异常。嫩枝的培养是通过愈伤组织衍生产生海棠离体新梢的。 重叠胚 当成熟胚培养在MS28中减少光照后，重叠胚有76.4%产生于叶或根衍生的植物体细胞胚(表1)。胚胎起源于三层细胞即原表皮微披角质层以下。胚胎形成于微披角

19、质层的表面,造成了在原来基础上的膨胀，次生胚也就产生了(4.3 + 2.3胚胎每个微披角质层)。每4周增加体细胞2.3 到3.6个折痕。当光照提升到一定的强度，以及材料和方法都合适时，获得得次生胚能够成熟。转接到MS56中萌发后，35%到79%的胚胎能发育成为海棠离体新梢, 但离体培养植株的产量比较低为(4.1 + 0.9)(表1)。 讨论 叶、茎干以及分支处的胚的获得都是从皮下起源的。位于皮下位置的胚基因细胞被限制于隔离的叶片中，处在它们的近表面的子叶。愈伤组织的发生，只能从叶片获得,也源于皮下组织细胞。嵌合体胚在山茶属中总是起源于同样的外植体地区, 但独立于培养基，到目前为止，测试外植体的

20、类型使用了(10、12、15)等方法。尽管皮下层细胞的形态经常被记录为其它物种(3,16,23-25,29,30)中,但只是为山茶的子叶和稻梗的胚轴部分进行了部分及相关反应的报告。我们更早的结果关于直接从珍稀物种上得到胚叶，显示不同体外叶在同一个部位的反应时相关联的。拍张x光片分析研究被控制的树叶，在任何一种叶的部位都符合上述结论。类似的结果也能从能量分散的x射线光谱采集皮下层细胞子叶中得到。在所有情况下, 只有在预期的外植体部分进行细胞检测才能检测到。 扩散在不同生理梯度材料中的组织，在决定形成位置的时候起到作用，,即形态开始于外植体。相反于山茶的体系, 在其他物种，胚发生反应发生在中部叶脉

21、的附近及次要叶脉。一项关于胚叶上元素分布的研究，也类似于进行了珍稀物种山茶的研究。在这两种情况下,梯度概念(生理或其他)似乎不足够解释为什么只有在特定的一些细胞组织成为主干后才能接受胚状体。在薄层细胞区域，是视在实验的类型表达情况而定的, 在一定的培养条件下,是以外植体的生理状态为主，主要是利用切除的部分植物体进行培养。在杨树进行太阳光度测定器时，叶片外植体成熟叶细胞的状态是一个关键因素，以及2,4 D也能够刺激诱导分化。我们先前的和现在的结果似乎表明,细胞的位置在胚发生能成为非独立的条件，在外植体的起源(叶、茎、子叶)，或者是品种都起作用。然而,早期的结果似乎表明,胚胎发生的数量受外植体起源

22、的影响。此外,重复胚状体的结果似乎表明, 一旦获得能力，则是一个长期的能力。在不改变培养条件的情况下，所有的细胞群都能够保留植物体细胞胚发生的能力。在从叶间接产生胚的培养体系中，得到了一个类似的结果,胚胎发生的三个周期能获得清除生长调节剂的能力。在所有培养体系报道：在所有的组合的化学和物理培养条件中，到目前为止(未出版测试的结果)，没有形态因子反应比体细胞胚从具体的外植体中胚发生途径取得更好的研究进展。 目前的结果证实我们先前的研究表明是正确的，胚的完全发生可能是在山茶外植体的特定部分处。茎、叶、微披角质层的培养体系阐述了这个观点，在这一控制过程中，获得特定的外植体才能够选择到真实的体细胞诱导

23、类型，在研究和得到木本植物胚胎发生的能力时，可以成为非常有用的工具。比起先前的报道山茶属(4、5、12、15,27)的结果，我们的结论认为，胚胎生产、胚胎转换、植物的 恢复力，展示了山茶在体外发展培养体系的潜力。 感谢 我们为Eng. Eliseu和Eng. Oliveira授权接受植物材料在Parque de Monserrate (Sintra, Portugal)上而表示感谢，这项工作是被Junta Nacional de Investigaqao Cien tifica e Tecnoltgica (Lisboa, Portugal), PhD grant BD/239/90-IF所支

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