细胞传代培养

1、细胞传代培养（消化法）具体操作： (?k  一. 传代前准备： 1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37水浴锅内预热。 v V-f&5W  2.用75酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。I  3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 O_ K  4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 F"5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。 O/u O%6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。06Es

2、7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。F + )V  8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 7t二.胰蛋白酶消化； "-mm-,x  1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37。  2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。+<2  3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。

3、 &三.吹打分散细胞： u  1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 <o2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 X|OH4S/6y  3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。 S3 %J 4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 <'>u0%)  四.分装稀释细胞： (T0 1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 2>Q 2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细

4、胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。五.继续培养： t2o;e6f    用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25时为一个，占50为，占75时为。 "g3aZ>  传代细胞培养注意事项： ;P?W  1.严格的无菌操作 .aSu*0G8  2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的

5、变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。 m+)C5d  附：EDTA（0.02乙二胺四乙酸二钠）消化液配方： S8s/7  EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5酚红4ml，加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。 OSoW- p  细胞的复苏 "T7;3kJ  细胞复苏的原则快速融化：必须将冻存在-196液氮中的

6、细胞快速融化至37，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 fZ/G:X8q  具体操作 b#Ok1yU)  一. 实验前准备： aORUI3-y  1.将水浴锅预热至37 AJ +'lD.  2.用75酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。 (NX%|O=l9    3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 #=DwVVu  二取出冻存管： !xo:2(-    1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。 OUUV

7、)    2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。 &8;BW:"  三迅速解冻： &9rk)!x(    1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。 1$ 0A/!    2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。 A!G  四.平衡离心： %)P=Be    用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min ZK 五.制备细胞悬液： _Y

8、UXDh    1.吸弃上清液。 $ Vt3U/A    2.向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。n >  六.细胞计数： &/OF9Ue   细胞浓度以5×105/ml为宜。 +_七.培养细胞   将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37和5CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。 a v=/c  初学者易犯错误： 1水浴锅未预热或者未预热到37。 JkNI_ J  2.水浴锅内冻存管太多，导致

9、传热不佳，使融化时间延长。 =br3M,d  3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。 1D/T9&Yd*  4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。细胞传代培养 一、原理    细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。    传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。    二、材料和

10、试剂    1、细胞：贴壁细胞株    2、试剂：0.25胰酶、1640培养基（含10小牛血清）    3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等    三、操作步骤    1、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。    2、加入0.51ml 0.25胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。    3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于

11、圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。    观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为13分钟。    4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。    附：消化液配制方法：    称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hanks液溶解，滤器过滤除菌，4保存，用前可在37下回温。 &#

12、160;  胰酶溶液中也可加入EDTA，使最终浓度达0.02。实验：细胞的原代和传代培养1.实验目的     初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医学上的应用打下基础。 2.实验原理     从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞

13、作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。近年来，在体细胞遗传、分化、胚胎发生、肿瘤发生、免疫学、细胞工程、放射生物学以及老年学等一系列的研究领域中得到广泛的应用，并取得了丰硕的成果。     细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。 细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长

14、都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。 3.实验用品   3.1 材料和标本  乳兔、HeLa细胞(人宫颈癌细胞)   3.2 器材和仪器  手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。   2.3 试剂  含有5小牛血清的MEM培养液、0.01molL  PBS，0.25胰蛋白酶一0.02EDT

15、A混合消化液、75乙醇。 4.实验方法 4.1 原代细胞培养  原理     细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培

16、养。 4.1.2 操作     取材     用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。然后，把整个动物浸入盛有75乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。置于无菌平皿中。     切割     用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数分钟

17、，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。     消化、接种培养     吸取0.25胰蛋白酶一0.02EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37水浴中消化810分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入510ml含5小牛血清的MEM培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。 4.1.3 结果     细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天

18、到一周即可形成单层。  4.2 传代细胞培养 4.2.1 原理     体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。     细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增36次。细胞传代后，一般

19、经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。 常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数100个细胞。一般细胞分裂指数介于0.20.5，肿瘤细胞可达35。细胞接种23天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。 4.2.2 操作     将长成单层的原代培养细胞或HeLa细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液。(以液面盖住细胞为宜)，静置510分钟。 .在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即 在超净台中将消化液倒掉，加入35m

20、l新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。     将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。 4.2.3 结果     一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，24天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。 4.3 器材及液体的准备和无菌操作的注意事项 4.3.1 器材和液体的准备     细胞培养用的玻璃器材，如：培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和

21、铁筒中，120，2小时干烤灭菌后备用；手术器材、瓶塞、配制好的PBS液用灭菌锅15磅，20分钟蒸气灭菌；MEM培养液、小牛血清、消化液用G6滤器负压抽滤后备用。 4.3.2 无菌操作中的注意事项     在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。为此，在操作前要认真地洗手并用75乙醇消毒。操作前2030分钟起动超净台吹风。操作时，严禁说话，严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。

22、操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。 5实验报告     (1).原代细胞和传代细胞培养有哪些区别?  (2).总结一下你自己的经验，怎样才能既迅速，又保证无菌操作。细胞传代培养一、原理    细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。    传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也

23、是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。二、材料和试剂    1、细胞：贴壁细胞株    2、试剂：0.25胰酶、1640培养基（含10小牛血清）    3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等三、操作步骤    1、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。    2、加入0.51ml 0.25胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。    3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐

24、渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。    观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为13分钟。    4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。    附：消化液配制方法：    称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hanks液溶解，滤器过滤除菌，4保存，用前可在37下回温。    胰酶溶液中也可加入ED

25、TA，使最终浓度达0.02。细胞的冻存和复苏一、原理    在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在130以下的低温中能减少冰晶的形成。  细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的50，细胞仍能生长，活力受损不大。  目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。二、操

26、作步骤（一）冻存1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。7、按下列顺序降温：室温4（20分钟）冰箱冷冻室（30分钟）低温冰箱（30 1小时）气态氮（30分钟）液氮。  注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用11.

27、5月。（二）复苏1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37的温水。2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37培养，第二天观察生长情况。三、试剂和器材器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等试剂：0.25胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）附：冻存液配制：培养基加入甘油或DSMO，使其终浓度达520%。保护剂的种类

28、和用量视不同细胞而不同。配好后4下保存。细胞计数及活力测定一、原理         培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。  在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。  用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细

29、胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。二、仪器、用品与试剂   1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计）2、试剂：0.4台盼兰，0.5四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇3、材料：细胞悬液三、操作步骤   （一）细胞计数1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml4大格细胞总数/ 4×1

30、0000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。（二）细胞活力1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。  死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。  活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。（三）MTT法测细胞相对数和相对活力  活细胞

31、中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。l、细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。2、沉淀加入0.51ml MTT，吹打成悬液。3、37下保温2小时。4、加入45 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。5、1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。  注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。附：1、0.4%台盼兰染液配制： 台盼兰0.4克加双蒸水至100 ml。2、MTT配制：MTT0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4下保存。3、酸化异丙醇配制：异丙醇中加入HCl使最终达0.04mol/L。动物细胞培养:细胞传代培养实验目的实验原理实验材料、用品实验步骤实验结果实验报告注意事项思考题熟练掌握细胞的传代培养法。 传代培养是组织培养常