段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用概要

1、会计学1段旭昌免疫磁珠分离技术段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生及在食品生产中的应用概要产中的应用概要磁性微球磁性微球结构、分类及特点磁性微球的制备磁性微球分离技术免疫磁株免疫磁珠结构与性质免疫磁株的特点免疫磁珠的分类免疫磁珠的制备免疫磁珠分离技术免疫磁珠技术的应用免疫磁珠在食品安全检测中的应用免疫磁珠与其它检测手段的联用免疫磁珠技术在其他领域的应用免疫磁珠技术的优缺点及发展望磁性核材料多为Fe、Co、 Pt 、Ni等金属及其氧化物。如Fe3O4、- Fe2O3、Me Fe2O3（Me= Co、Mn、Ni）、 BaFe12O19、铁钴合金（Fe-Co和Ni-Fe）。最常用的是Fe、 Fe2

2、O3、 Fe3O4。其中Fe3O4 应用最多。构成磁性微球的高分子材料有天然高分子和合成高分子物质。天然高分子有明胶、球蛋白、牛血清白蛋白、聚赖氨酸、淀粉和多种聚糖如纤维素、葡聚糖、琼脂糖、壳聚糖、果胶等。合成高分子材料有聚苯乙烯、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸（酯）及其共聚物、聚酰胺类、聚苯胺及硅烷等。这些材料可单独用，也可复合使用。磁性微球表面可根据需要赋予不同的功能基 团(如OH、COOH、CHO、NH2,SH、CONO2、CONH2、SO3H、SiH3、环氧基、CHCl等)，使其表现具有疏水-亲水、非极性-极性、带正电荷-带负电荷等不同物理性质。同时具有磁响应性，在外磁场作用下具有磁导

3、向性。 导电聚合磁微球 聚合磁微球不需连接其他活性基团即可与生物配基不需连接其他活性基团即可与生物配基（如抗体、抗原等）偶联，及其他基团的（如抗体、抗原等）偶联，及其他基团的微型磁珠在生物学、医学方面应用较为广微型磁珠在生物学、医学方面应用较为广泛。泛。 金属离子在碱性条件下与高分子共沉淀，一步反应生成磁性高分子微球的方法。2Fe3+ Fe2+8OHFe3O4+4H2O Pich等先通过单体聚合反应得到PS-AAEM颗粒分散剂，再把配制好的Fe3+、Fe2+溶液加入聚苯乙烯（PS）-乙酰乙酸基甲基丙烯酸乙酯（AAEM）颗粒的分散剂中，然后滴加NH3H2O。Fe3O4 粒子在PS-AAEM 表面

4、沉积，制得PS-AAEM为核心、Fe3O4 粒子为壳层的磁性微球。微球的磁性能通过改变FeCl2 和FeCl3 的浓度或改变PS-AAEM 核心的尺寸来控制。Xia 等把一定配比的FeCl2、FeCl3 与葡聚糖（dextran T-10）共混，然后滴加NH3H2O，在超声连续作用下水浴加热，制得以Fe3O4 为核、dextran 为壳的磁性微球。杨玉东等把一定配比的FeCl36H2O、FeCl26H2O与配体（如二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）或乙二氨四乙酸（EDTA）等）组成的混合液体加入到75的葡聚糖T-10 溶液中，并快速滴加NH3H2O，制备了葡聚糖为壳、氧化铁为核的磁性微球。异相聚合

5、法包括分散聚合、乳液聚合、悬浮液聚合三种。该法是将磁性粒子用表面改性剂、偶联剂、引发剂等处理后分散到含有聚合物单体的溶剂中进行聚合反应。通常以磁性粒子为活性中心进行单体聚合。 几种 DNA 分离方法的比较Comparation of several DNA extraction methods方法方法传统法传统法鳌合树脂法鳌合树脂法玻璃粉法玻璃粉法磁珠法磁珠法免疫亲和法免疫亲和法DNA 提取提取酚酚 / 氯仿等氯仿等溶剂抽提溶剂抽提Chelex 100 树脂树脂吸附吸附玻璃粉吸附玻璃粉吸附离心分离离心分离磁珠吸附磁珠吸附磁场分离磁场分离抗原抗体反应抗原抗体反应磁场分离磁场分离适用范围适用范围大

6、多数标本大多数标本 DNA 提取纯化提取纯化培养及培养及各种临床标本各种临床标本土壤标本土壤标本冰冻、陈旧组织冰冻、陈旧组织冰冻、陈旧组织，冰冻、陈旧组织，样本含量很少的标样本含量很少的标本本方法评价方法评价DNA 纯度高、含纯度高、含量多，但较费时，量多，但较费时，步骤繁琐，用有步骤繁琐，用有机溶剂，有损操机溶剂，有损操作者健康。作者健康。可用于培养标本可用于培养标本和各种临床标本和各种临床标本细菌及部分病毒细菌及部分病毒核酸的提取。核酸的提取。方法简便，可用于方法简便，可用于土壤中细菌芽孢土壤中细菌芽孢 DNA 的提取，不能的提取，不能彻底除去彻底除去PCR抑制抑制剂。剂。简单、快速，整简

7、单、快速，整个过程不到个过程不到 2h ，可获得较纯可获得较纯 DNA 。 适于少适于少量样本。量样本。DNA 纯度高，含量纯度高，含量多，适于样本含量多，适于样本含量少标本，单克隆抗少标本，单克隆抗体的制备是关键。体的制备是关键。免疫磁珠（IMB）也称免疫磁性微球，是在磁性微球表面偶联上免疫配基的一种磁性微球，是将磁性微球技术和免疫学相结合的特殊磁性微球。免疫配基通过生物高分子的功能基团结合到磁性载体微球上形成免疫磁珠。由于载体微球制备材料和方法不同，其表现出的物理性质也不同， 从而可结合不同的免疫配基， 如抗原、抗体、凝集素、DNA 和RNA 等。配基必须具有生物专一性的特点， 而且载体微

8、球与配基结合要不影响或改变配基原有的生物学特性， 保证磁珠的特殊识别功能。具有均匀性、超顺磁性及保护性外壳，由磁性载体微球和免疫配基结合而成，表面具有专一亲和性和吸附作用。免疫磁珠大小和形状具有均一性， 可使靶物质迅速有效地结合到磁珠上，可使新生成复合物在磁场中具有相同磁响应性，且行为一致。磁珠球形结构可消除与不规则形状粒子间的非特异性结合，顺磁性可使磁珠置于磁场时显示其磁性，并做定向移动， 从磁场移出时磁性消除， 磁珠分散， 可方便地进行分离和磁性导向。保护性壳可防止磁性内核漏出或被载液腐蚀； 免疫配基可专一性结合反应体系中相应的抗原、抗体、核酸等生物活性物质。由于聚苯乙烯磁性微球强度高、表

9、面易进行化学维修饰，是比较理性的制造免疫磁珠的材料。n50nm表面积大、表面吸附活性配基多，只有细胞体积的万分之一，对细胞表型和功能影响小，不影响细胞的后续培养。但磁力弱，需特殊分离柱才能实现样品分离，分离速度慢，成本高免疫磁珠的制备是将磁性微球和抗体等配基结合而成。磁性微球与抗体的连接方式有共价结合和吸附结合两种方式。共价结合：依靠磁珠表面的活性基团如-CHO、-COOH等与抗体Fab段上的-NH2共价反应和结合吸附结合：依靠磁珠巨大的比表面与抗体见得非特异性吸附而结合。共价结合的牢固度远远大于吸附结合牢固度。制备方法：先制备磁性微球，然后将磁性微球分散于抗体配机溶液中使磁珠与抗体充分吸附结

10、合，然后分离免疫磁珠分散于缓冲溶液中可以使用。免疫磁珠( immunomagnetic bead, IMB)分离技术：是一种以特异的抗原抗体反应为基础的免疫学磁性微球检测和分离技术。它是以抗体包被的微球磁珠为载体，通过抗体与反应介质中特异性抗原结合，形成抗原抗体复合物，此复合物在外加磁场作用下发生定向移动，从而达到分离抗原的目的。直标微珠多选微珠间标微珠获得非标记细胞。获得非标记细胞。3 3 酶解法：酶解法：通过木瓜蛋白酶和唾液蛋白酶通过木瓜蛋白酶和唾液蛋白酶使磁珠与细胞解离，再通过磁场除去游使磁珠与细胞解离，再通过磁场除去游离磁珠，获得裸细胞。离磁珠，获得裸细胞。磁珠法分离抗体、抗原、蛋白、

11、多肽、多糖、DNA、RNA操作过程示意图MACS Vitalvirus Hiv分离试剂盒分离标记造血细胞表面的Hiv-1病毒CD44H异型细胞免疫磁珠标记细胞示意图免疫磁珠分离细胞及病毒示意图十二 免疫磁珠在食品安全检测中的应用免疫磁珠对病毒细胞具有特异选择性，因此能用于食品有害微生物的检测。免疫磁珠技术与常规检验方法相比具有检测迅速、有选择性分离目的微生物，有效减少背景干扰，提高了精准性。同时还能捕获受损伤靶细菌。目前，免疫磁珠技术已广泛用于食品样品中致病微生物的检测。传统分离E.coli O157H7所采用的直接分离法存在着鉴别力差、抑制杂菌能力弱、耗时长、工作量大等缺点。采用免疫磁珠技术

12、，能够快速地从各种食品样品中分离富集E.coli O157H7，满足流行病学的研究要求和提高控制力度。 现在这种免疫磁珠的方法已经被英国公共健康服务实验室认定为标准的分离方法，我国也已将免疫磁珠法对大肠杆菌O157的检测纳入国家标准（GB/T 4789.36-2008）和出入境检验检疫行业标准(SN/T 1059.5-2006)。已有市售的专用免疫磁珠销售。 检样25g(mL)+225mL改良EC肉汤（mEC+n），均质225mL 免疫磁珠捕获涂布CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157弧菌显色琼脂平板挑取可疑菌落5个10个，氧化酶阴性，革兰氏阴性杆菌接种TSI MUG-LST 阳

13、性 阴性 血清学试验 非O157细菌 生化试验 报告361oC18h24h361oC361oC18h24h18h24h具体操作具体操作Fratamico等将兔抗E.coli O157H7多克隆抗体连接到羊抗兔IgG包被的磁珠上，从食物增菌培养液中分离O157H7菌株，再将带菌的磁珠接种到培养基上，加入荧光素标记的O157H7抗血清，在荧光显微镜下观察，此法敏感性为10cfu/mL增菌培养液。Decory等建立了免疫磁珠-免疫脂质体（IMB/IL）荧光试验方法，可在8h内快速检测出多种液态样品（水样、苹果汁、苹果酒）中低至1cfu/mL的E. coli O157H7，而传统微生物学方法不能从阴性

14、样本中区分出E. coli O157H7感染样本。 传统的单增李斯特菌检测方法检测周期长，约传统的单增李斯特菌检测方法检测周期长，约514d，步骤，步骤繁琐且灵敏度低，而繁琐且灵敏度低，而IMB技术的优点在于在较低的菌液浓度技术的优点在于在较低的菌液浓度时也可以通过免疫磁珠的富集作用进行检测，缩短了检测时时也可以通过免疫磁珠的富集作用进行检测，缩短了检测时间并进一步降低了单增李斯特菌的检测限。间并进一步降低了单增李斯特菌的检测限。2008年，我国将免疫磁珠检测单核细胞增生李斯特菌的方法年，我国将免疫磁珠检测单核细胞增生李斯特菌的方法纳入了出入境检验检疫行业标准中纳入了出入境检验检疫行业标准中(

15、SN/T0184.3-2008)。 检样25g(mL)对225mLFB1増菌液（30 士1 ，24h士1h） 1mL转种10mL FB2増菌液（ 35 ，24h士1h）通过免疫磁珠捕获李斯特菌，然后再用灭菌缓冲液洗涤用0.1mL的灭菌缓冲液重新制成悬液吸取50uL免疫磁珠悬液划线于CHROMagar 显色培养基，OXA/PALCAM琼脂平板（35 +1 ,24h28h) 各挑选5个典型菌落接种于TSA-YE琼脂平板，纯培养 鉴定和确认试验单增李斯特菌的检测程序与方法单增李斯特菌的检测程序与方法Skjerve等通过包被单克隆抗体的磁珠从不同食物样品中分离李斯特菌，采用将磁珠接种到琼脂平板培养的方

16、法进行菌株鉴定，此法的敏感性为102104cfu/mL样品。Hudson等研究表明，将免疫磁珠技术与PCR结合，24h内即可检出火腿中的单增李斯特菌。Notzon等用IMB-荧光PCR检测肉类中的沙门氏菌，实验包括非选择性增菌、免疫磁珠分离、DNA提取及PCR扩增，1213h即可完成检测过程，IMB-荧光PCR在检测自然感染肉类和人工感染肉类都具有较高的敏感性和特异性。 Blackburn 等将用生物素标记的抗沙门菌多价多克隆抗体连接到链霉亲和素包被的磁珠上，以此试剂检测从不同食物中提取的活沙门菌。此法的敏感性可达105cfu/g 食物，总的检测时间从5d减少至12d。适用于各类食品基质中的沙

17、门氏菌的快速检测，能快速有效富集食品基质中的目标病原菌，且有良好的灵敏度和特异性，检测限可达到110cfu/25g;在检测时间方面可将常规检测方法中的72小时检测周期缩短至40小时，而且能有效减轻过程交叉污染;筛选结果既可以与常规的细菌生化和血清学联用，也可以和显色培养基、荧光PCR以及微生物全自动鉴定仪器等方法联用，为食源性致病菌检测和鉴定提供有效快速筛选技术。陈伶俐等将人IgG结合到磁珠上，用该磁珠对样品中的金黄色葡萄球菌进行快速分离检验。取适量免疫磁珠，加入金黄葡萄球菌菌液中，磁场下分离磁珠，将分离前后的菌液及磁珠涂平板，并用大肠杆菌、白葡萄球菌等作对照。结果用此磁珠分离后，只有金黄葡萄

18、球菌的浓度有明显的降低。对磁珠所涂平板的菌落进行鉴定，证明为金黄葡萄球菌。应用此法分离检验此菌，富集速度快，灵敏度高，效果好。 刘琳琳利用自制的金属螯合免疫磁珠来检测食品中金黄色葡萄球菌，该法能够在30min内富集检测金黄色葡萄球菌且检测低限可达100 CFU，同时磁珠可保持活性达3周以上。Hara-Kudo等利用IMS和显色培养基分离贝类中产TDH的副溶血性弧菌O3:K6。Datta等利用副溶血性弧菌ATCC17802制备针对极鞭毛的单克隆抗体,这将有益于快速检测从环境来源的副溶血性弧菌。张凡非等利用IMS分离环境及食品中产生TDH副溶血性弧菌，分别从1份海水、1份海泥和3份蛤肉中检出了神奈

19、川现象阳性,并产生耐热溶血毒素的副溶血性弧菌,血清型为03:K6。该方法与一般的细菌培养分离法相比,极大地提高了环境样品及食品中病原性副溶血性弧菌的检出率。利用IMB可有效地吸附、浓缩大量样品中的少量病原微生物, IMB为难于从环境及食品中分离病原性副溶血性弧菌的问题提供一种有效手段。志贺氏菌例：Islam等应用O抗原特异性单克隆抗体包被免疫磁珠，快速检测粪便中的疾痢志贺菌和福氏志贺菌。分离出的志贺菌株用PCR扩增方法进行鉴定。此种免疫磁珠分离与PCR联合法检测志贺菌，较传统的培养法敏感、快速(7 h)。小肠结肠炎耶尔森氏菌例：Kapperud等用抗小肠结肠炎耶尔森氏菌血清抗体包被磁性微球，从

20、食物和水样中分离，并能将小肠结肠炎耶尔森氏菌与假结核耶尔森氏菌和非致病性耶尔森氏菌区别开来。免疫磁珠荧光微球免疫磁珠荧光微球优点优点: :分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单，不需分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单，不需昂贵仪器设备昂贵仪器设备, ,不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能等性状和功能等, ,从而在微生物检测方面具有很大的优势。从而在微生物检测方面具有很大的优势。缺点：免疫磁珠敏感性不高，易于其他杂菌交叉反应，价缺点：免疫磁珠敏感性不高，易于其他杂菌交叉反应，价格昂贵，应用受到一定限制。格昂贵，应用受到一定限制。总的来说，

21、免疫磁珠分离技术未来将在生物医学、食品、农业科研、新药开发等领域具有更加广泛的发展前景。 几种 DNA 分离方法的比较Comparation of several DNA extraction methods方法方法传统法传统法鳌合树脂法鳌合树脂法玻璃粉法玻璃粉法磁珠法磁珠法免疫亲和法免疫亲和法DNA 提取提取酚酚 / 氯仿等氯仿等溶剂抽提溶剂抽提Chelex 100 树脂树脂吸附吸附玻璃粉吸附玻璃粉吸附离心分离离心分离磁珠吸附磁珠吸附磁场分离磁场分离抗原抗体反应抗原抗体反应磁场分离磁场分离适用范围适用范围大多数标本大多数标本 DNA 提取纯化提取纯化培养及培养及各种临床标本各种临床标本土壤标本土壤标本冰冻、陈旧组织冰冻、陈旧组织冰冻、陈旧组织，冰冻、陈旧组织，样本含量很少的标样本含量很少的标本本方法评价方法评价DNA 纯度高、含纯度高、含量多，但较费时，量多，但较费时，步骤繁琐，用有步