核酸化学生物化学

1、核酸化学生物化学第一节第一节 概述概述第二节第二节 核酸的化学组成核酸的化学组成第三节第三节 核酸的分子结构核酸的分子结构第四节第四节 核酸的性质核酸的性质第五节第五节 核酸的研究方法核酸的研究方法本章内容第1页/共108页第一节概 述 核酸（nucleic acidNA）是一类重要的生物大分子，担负着生命信息的储存与传递。 核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域，是基因工程操作的核心分子。第2页/共108页1868 F. Miescher从脓细胞的细胞核中分离出了一 种含磷酸的有机物，当时称为核素（nuclein）,后称为核酸（nucleic acid）。1944 Avery 等通过肺

2、炎球菌转化试验证明DNA是遗传物质。1952 Hershey, Chase-噬菌体标记实验。1953 Watson和Crick提出DNA结构的双螺旋模型。1958 Crick提出遗传信息传递的中心法则。1973 Boyer，Cohen-DNA Cloning(克隆）。1976 DNA Sequencing(序列分析）。1990 Human Genome Project（人类基因组计划）。一、核酸的研究历史第3页/共108页1944年Avery细菌转化实验肺炎病菌有二种，一种是光滑型肺炎双球菌：有荚膜、菌落光滑且有毒。这种菌通常外包有一层黏性发光的多糖荚膜，它是细菌致病性的必要成分，引起肺炎；另

3、一种是粗糙型肺炎双球菌：无荚膜、菌落粗糙且无毒。（a）将光滑型肺炎双球菌注入小鼠体内，使小鼠致死。（b）将粗糙型肺炎双球菌注入小鼠体内，对小鼠无害。（c）将光滑型肺炎双球菌加热杀死后，再注入小鼠体内，对小鼠无害。（d）将加热杀死的光滑型肺炎双球菌与粗糙型肺炎双球菌一起注入小鼠体内，小鼠死掉。 这说明粗糙型肺炎双球菌变成了致死的光滑型肺炎双球菌。暗示着被杀死的光滑型肺炎双球菌中含有某种因子，它进入了粗糙型肺炎双球菌将它转化成了致死的光滑型肺炎双球菌。（e）从加热杀死的光滑型肺炎双球菌中提取DNA，并且尽可能地将混在DNA中的蛋白质除去，然后将除去了蛋白质的DNA与粗糙型肺炎双球菌混合后，再注入小

4、鼠体内，小鼠死掉。1928年细菌学家Griffith 细菌毒性实验 第4页/共108页1952年美国Hershey 噬菌体感染实验 DNA的遗传作用的进一步证明是来自A.Hershy和M.Chase的噬菌体感染大肠杆菌的研究。用放射性同位素32P标记噬菌体DNA，使标记的噬菌体感染大肠杆菌，经短期保温后，噬菌体就附着在细菌上。然后用搅拌器（10000转/分）搅拌几分钟，使噬菌体与大肠杆菌分开，再用高速离心机使细菌沉淀，分析沉淀和上清中的放射性（右图）。用35S标记噬菌体的蛋白质外壳，进行同样的验证实验。实验结果是大多数噬菌体的DNA存在于细菌中，而外壳留在上清中。但是被感染的细菌内部出现了奇迹

5、。随着被感染的细菌的培养，有的细菌破裂，释放出很多噬菌体来。这说明用于复制的遗传信息通过病毒DNA，而不是通过病毒蛋白质导入细菌内的。第5页/共108页第6页/共108页 真核生物 原核生物 细胞核（98%） 拟核 线粒体mDNA （少量） 质粒DNA（plasmid） 叶绿体ctDNA （少量）等 病毒DNA 细胞质（90%） 细胞质 核仁（少量） 病毒RNA 二、核酸的种类和分布二、核酸的种类和分布脱氧核糖核酸核糖核酸注：生物细胞都含有注：生物细胞都含有DNA DNA 和和 RNARNA； 病毒中只含病毒中只含 DNA DNA 或或 只含只含 RNARNA。第7页/共108页第二节核酸的化

6、学组成 核酸是由几十个甚至几千万个核苷酸聚合而成的具有一定空间结构的生物大分子。 基本元素：基本元素：C、H、O、N、P ；其中其中P 的含量比较稳定，占的含量比较稳定，占9%-10%，通过测，通过测定定P 的含量来推算核酸的含量（定磷法）。的含量来推算核酸的含量（定磷法）。第8页/共108页磷酸 核苷 碱基 戊糖 核酸核苷酸 第9页/共108页一、戊糖 组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。OHHOHHOHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHHOHHD-核糖D-2-脱氧核糖第10页/共108页二、碱基二、碱基1. 嘌呤（Purine） 腺嘌

7、呤Adenine 鸟嘌呤guanine第11页/共108页2. 嘧啶（Pyrimidine）胸腺嘧啶胞嘧啶尿嘧啶第12页/共108页 核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。NNNNNHCH3dRN6-Methyl-dANNCH3NH25-Methyl-dCOdR二氢尿嘧啶 （DHU）第13页/共108页修饰碱基的简写符号 m N22取代位置核苷取代基的数目取代基( 为1时可以不写 )第14页/共108页核苷：戊糖核苷：戊糖+ +碱基碱基 糖与碱基之间的糖与碱基之间的C-NC-N键，称为键，称为C-NC-N糖苷键糖苷键核苷中戊糖与碱基的连接方式：(O

8、H)(OH)第15页/共108页修饰核苷/稀有核苷修饰核苷包括三种情况: （1）由修饰碱基和糖组成的核苷 （2）由非修饰碱基和2-O-甲基核糖组成的核苷 （3）由碱基与糖连接方式特殊的核苷 第16页/共108页NNNNNHCH3dRN6-Methyl-dA（1）HNNHO5,6-dihydrouridineORHHH(D or hU)（2）OCH2HHOHHOCH3HHO2-O-甲 基 腺 苷Ade(Am)NNCH3NH25-Methyl-dCOdR二氢尿嘧啶核苷 (Am)第17页/共108页（3）OCH2HHOHHOHHHO (pseudouridine)HNNHOO51假 尿 嘧 啶 核

9、苷()第18页/共108页取代基用下列小写英文字母表示 :甲基甲基m 乙酰基乙酰基ac 氨基氨基n 甲硫基甲硫基ms 羟基羟基o或或h 硫基硫基s 异戊烯基异戊烯基i 羧基羧基c 第19页/共108页例：例：HNNORSHNNOROCH2OHs4 Uom5 U或hm5 U第20页/共108页四、核苷酸（四、核苷酸（nucleotide） 核苷酸： 核苷+磷酸 戊糖+碱基+磷酸H第21页/共108页五、游离核苷酸及其衍生物的形五、游离核苷酸及其衍生物的形式式1. 继续磷酸化第22页/共108页2.2.环化磷酸环化磷酸化化 cAMP cGMP第23页/共108页3.3.辅酶辅酶 NAD、NADP、

10、FAD、HSCoAFADNAD、NADPHSCoA第24页/共108页4. GDP-4. GDP-半乳糖、半乳糖、GDP-GDP-葡萄糖等是糖葡萄糖等是糖蛋白蛋白 生物合成和多糖生物合成的活性生物合成和多糖生物合成的活性糖糖 基供体。基供体。 第25页/共108页第三节 核酸的分子结构 一、DNA的结构一级结构: DNA核苷酸链中脱氧核苷 酸的组成和排列顺序。二级结构：DNA的两条多聚链间通过 氢键形成的双螺旋结构。三级结构：DNA双链进一步折叠卷曲 形成的构象。第26页/共108页（一）DNADNA的一级结构 由dAMP、dGMP、 dCMP、 dTMP核苷酸单体通过3,5-磷酸二酯键相连而

11、成的链状聚合物。5533第27页/共108页结构式l 5-5-磷酸端（常用磷酸端（常用5 5-P-P表表示）；示）；3 3- -羟基端（常用羟基端（常用3 3 -OH-OH表示）表示）l 核苷酸链具有方向性，当核苷酸链具有方向性，当表示一个核苷酸链时，必表示一个核苷酸链时，必须注明它的方向是须注明它的方向是5353或是或是3535。第28页/共108页字母式5PAPCPGPCPTPGPTPAOH 3 5 PACGCTGTAOH 3线条式PP5335PP53P53ACGTOH第29页/共108页DNA的一级结构也可指DNA分子中碱基的顺序。DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物

12、种的多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。第30页/共108页（二）DNA的二级结构qWatson 和 Crick 于1953年提出了DNA 双螺旋结构模型，说明了DNA 的二级结构。（即B型DNA）第31页/共108页（1 1）ChargaffChargaff定则 （1950s,E. Chargaff1950s,E. Chargaff发现）I.I. DNADNA碱基组成符合：碱基组成符合： A=TA=T；G=CG=C； A+G=T+CA+G=T+C。II.II. 不对称比率：不对称比率：A+T/G+CA+T/G+C； 物种不同，物种不同，DNADNA碱基组成不同；碱基

13、组成不同； 物种亲缘愈接近，碱基组成也愈接近，该比物种亲缘愈接近，碱基组成也愈接近，该比 率越相近似。率越相近似。.具有种的特异性，没有器官和组织的特异性，具有种的特异性，没有器官和组织的特异性，年龄、营养状况、环境的改变不影响年龄、营养状况、环境的改变不影响DNADNA的的碱基组成。碱基组成。1提出DNA双螺旋结构模型的根据 第32页/共108页第33页/共108页（2）x-光衍射分析 20世纪40年代Astbury 1952年M.Wilkins 第34页/共108页2DNA双螺旋结构模型（双螺旋结构模型（double-helical structure） 1953年年Watson和和Cri

14、ck提出了提出了DNA双螺旋结构。双螺旋结构。 第35页/共108页DNADNA双螺旋结构模型要点（1 1）q螺旋中的两条链反向平行，即其中一条链的方向为53，而另一条链的方向为35，两条链共同围绕一个假想的中心轴呈右手双螺旋结构。 第36页/共108页DNADNA双螺旋结构模型要点（2 2）q疏水的碱基位于双螺旋的内侧，亲水的磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基平面与螺旋轴垂直，脱氧核糖平面与中心轴平行。q由于几何形状的限制，碱基对只能由嘌呤和嘧啶配对，即A与T，G与C。这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键， G与C之间形成三个氢键。第37页/共108页T-A碱基对C-G碱基对第

15、38页/共108页DNADNA双螺旋结构模型要点（3 3）q由于碱基对排列的方向性，使得碱基对占据的空间是不对称的，因此，在双螺旋的表面形成大小两个凹槽，分别称为大沟和小沟，二者交替出现。2.0 nm小小沟沟大大沟沟第39页/共108页DNADNA双螺旋结构模型要点（4 4）q双螺旋横截面的直径约为2 nm，相邻两个碱基平面之间的距离（轴距）为0.34 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺距（即螺旋旋转一圈）的高度）为3.4 nm。2.0 nm小小沟沟大大沟沟第40页/共108页DNADNA双螺旋结构模型要点（5 5）q两条链借碱基之间的氢键和碱基堆积力（即碱基之间的范德华力）牢固的连接起来

16、，维持DNA双螺旋的三维结构。q两条链是碱基互补关系。第41页/共108页3. DNA的双螺旋结构稳定因素 氢键 碱基堆积力 磷酸基上负电荷被胞内组蛋白或正离子中和 碱基处于疏水环境中第42页/共108页4. DNA的双螺旋结构的意义 该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，这是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。该模型的提出是上个世纪生命科学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石。第43页/共108页DNA双螺旋构象的类型第44页/共108页（三）DNADNA的三级结构-超螺旋1）超螺旋

17、是指双螺旋进一步扭曲或再螺旋的构象。2）正超螺旋（变紧，过旋）和负超螺旋（变松，欠旋）。3）人类46条染色体的DNA总长可达1.7m，经过螺旋化压缩，实际总长只有200nm。第45页/共108页负超螺旋第46页/共108页核小体盘绕及染色质示意图第47页/共108页DNADNA的存在形式-核小体 真核生物中DNA双螺旋沿着组蛋白八聚体核心的短轴绕1.75圈，形成左手超螺旋，称核小体。 染色质的基本结构单位是核小体。 串珠状结构进一步卷曲形成螺线管，后者再进一步卷曲形成超螺旋管，形成染色单体。第48页/共108页基因和基因组 基因即一段有功能的DNA片段，生物细胞中DNA分子的最小功能单位（交换

18、单位）。 一个细胞或生物体所含的全套基因称基因组。第49页/共108页二、RNA的分子结构（一） RNA的分类及特点（二） RNA分子的结构特点 第50页/共108页（一）RNARNA的特点及分类结构特点：1. 碱基组成：A、G、C、U （AU/GC）；2. 稀有碱基较多，稳定性较差，易水解；3. 多为单链结构，少数局部形成螺旋（发夹结构）；4. 分子较小。分类：1. 信使RNA（ mRNA）2. 转运RNA （ tRNA）3. 核糖体RNA （r RNA）第51页/共108页 Messenger RNA Messenger RNA1)约占总RNA的3%-5%，含量最少，种类最多。2)成熟mR

19、NA不含内含子，hnRNA含有。3)mRNA从DNA转录遗传信息，并作为蛋白质合成的模板，决定蛋白质的氨基酸顺序。第52页/共108页Ribosome RNARibosome RNA 约占全部RNA的80%，含量最多。 与多种蛋白质结合成核糖体，后者是合成蛋白质的场所。第53页/共108页原核生物原核生物真核生物真核生物核糖体核糖体rRNArRNA核糖体核糖体rRNArRNA 30s30s70s70s 50s50s16s16s5s 5s 、23s23s 40s 40s 80s80s 50s 50s 18s18s5s5s、5.8s5.8s、28s28s第54页/共108页Transfer RNA

20、Transfer RNA 约占总RNA的10-15%，分子最小。 它在蛋白质生物合成中起翻译mRNA信息，并将相应的氨基酸转运到核糖体，参与蛋白质体的合成。 已知每一个氨基酸至少有一个相应的tRNA。第55页/共108页（二）RNA分子的结构特点 tRNA 的结构第56页/共108页二级结构二级结构特征特征： 单链单链 三叶草叶形三叶草叶形 四臂四环四臂四环三级结构三级结构 特征：特征： 在二级结构基础上在二级结构基础上进一步折叠扭曲形成倒进一步折叠扭曲形成倒L型型第57页/共108页酵母tRNA Ala 的二级结构DHU环IGC反密码子反密码环氨基酸臂可变环TC环CCAAla35第58页/共

21、108页2） rRNA的分子结构特征： 单链，螺旋化程度较tRNA低 与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能5SRNA5SRNA的二级结构第59页/共108页 3）mRNA的分子结构在转录一章讲授第60页/共108页第四节 核酸的性质一、一般物理性质二、核酸的水解三、两性解离四、紫外吸收性质五、稳定性六、变性七、复性与杂交第61页/共108页一、一般物理性质1. DNA白色纤维状固体，RNA白色粉末状固体，都微溶于水，不溶于乙醇，因此常用乙醇来沉淀DNA ； DNA溶液黏度大于RNA 。2. DNA难溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于 12 mol/L的NaCl溶液，RNA则相反，可据此

22、分离二者。3. 加热条件下， D核糖浓盐酸苔黑酚 绿色 D2脱氧核糖酸二苯胺 蓝紫色第62页/共108页二、核酸的水解1.核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。2.DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。室温条件下，DNA在碱中变性，但不水解，RNA水解。3.在细胞内核酸分子受DNA酶作用。第63页/共108页三、两性解离1.核酸含酸性的磷酸基团，又含弱碱性的碱基，为两性电解质，可发生两性解离；2.核酸相当于多元酸，pH大于4时，呈阴离子状态；3.等电点第64页/共108页四、紫外吸收1.在核酸分子中嘌呤碱和嘧啶碱都含有共轭双键体系，在260 nm有吸收；2.可以作为区别蛋白质

23、和对核酸及其组份定性和定量测定的依据，进行核酸纯度鉴定，也可作为核酸变性和复性的指标。第65页/共108页DNA的紫外吸收光谱天然天然DNA变性变性DNA核苷酸总吸收值核苷酸总吸收值1232202402602800.10.20.30.4波长（nmnm）光吸收123第66页/共108页根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度纯DNA：A260/A280=1.8 纯RNA：A260/A280=2.0（若样品中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低）纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值算出其含量若260nm光吸收值为1相当于50g/ml双螺旋DNA或相当于40g/ml单链DNA或

24、RNA或相当于20g/ml寡核苷酸。第67页/共108页五、DNADNA的稳定性1.DNA的溶液呈粘稠状，但实际上DNA的双螺旋结构僵直而有刚性，易断成碎片，这也是目前难以获得完整大分子DNA的原因。2.溶液状态的DNA易受DNA酶作用而降解，抽干水分的DNA性质十分稳定。第68页/共108页六、DNA的变性1. 概念2. 变性条件3. 变性的特征第69页/共108页1. 概念是指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，变成单链结构的过程。第70页/共108页2.DNA2.DNA的变性的条件能够引起核酸变性的因素有：1）温度升高；2）酸碱度改变、 pH（11.3或5.0）；3）有机溶剂如甲醛和

25、尿素、甲酰胺等；4）低离子强度。第71页/共108页3.DNA3.DNA变性的特征 变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。 变性改变了DNA的二级结构。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。 DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。 DNA解链温度 紫外吸收值明显增加，即增色效应。 粘度降低，沉降系数增加。第72页/共108页DNADNA解链温度（熔点，TmTm ） 当50% 的DNA变性时的温度称为该DNA的解链温度，即增色效应达到一半时的温度；一般DNA的Tm值在70-85C之间。 均一DNA（如病毒）的Tm值范围较小。 分子中G和C的含量

26、越高，越不易变性，Tm值越高。可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44Tm值随溶液盐浓度增加而增大， Tm值较低，易变性，不易保存。第73页/共108页溶解曲线与T Tm m。第74页/共108页影响Tm值的因素 DNA的均一性 DNA中G-C对的含量 经验式: (G-C)%=(Tm-69.3)2.44 盐离子强度 第75页/共108页增色效应与减色效应 天然DNA分子在热变性条件下，双螺旋结构破坏，碱基暴露，在紫外光260nm波长处的吸收度明显增加，此现象称为增色效应。 变性DNA分子复性形成双螺旋结构时其紫外吸收降低的现象称为减色效应。第76页/共108页第77页/共

27、108页七、DNADNA的复性1. 概念2. 复性的条件3. 影响复性的因素4. 复性动力学5. 分子杂交第78页/共108页1. 1. 概念1.变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，其物理性质和生物活性随之恢复，这一过程称为复性；2.对于热变性的DNA，在缓慢冷却的条件下可重新结合恢复双螺旋结构，称为退火。3.DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。第79页/共108页DNA的复性图示第80页/共108页2.DNA2.DNA的复性条件1.将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。即淬火。2.将变性的DNA缓慢冷却时，

28、可以复性。退火温度Tm253.分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性需要一定的盐浓度，也与它本身的组成和结构有关。第81页/共108页高于Tm值5 复性 也称退火 缓缓慢慢冷冷却却迅迅速速冷冷却却第82页/共108页3. 影响复性的因素 样品的性质(G+C) DNA的浓度 DNA片段的大小 温度 离子强度 第83页/共108页5.5.分子杂交1.在变性的DNA溶液中加入外源DNA单链分子或RNA单链分子（与原DNA具有同源性），去掉变性条件后复性形成双螺旋结构的过程。2.这样形成的新分子称为杂交DNA分子。3.利用核酸杂交可检测特定的核苷酸片段或研究同源性等。第84页/共

29、108页分子杂交 探针：用于杂交的异源DNA或RNA序列，其核苷酸序列是人工特定的、已知的，经放射性标记的一条链。第85页/共108页核酸的变性、复性和杂交变性（加热）探针杂交（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）第86页/共108页分子杂交的种类 Southern Blot：DNA-DNA杂交 Northern Blot：DNA-RNA杂交 Western Blot：抗原-抗体进行杂交 原位杂交：活体组织上进行杂交，显出荧光第87页/共108页Southern印迹法DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记DNA探针杂交放射自显影带有DNA片段的凝胶凝胶滤膜用缓冲液转移D

30、NA吸附有DNA片段的膜第88页/共108页第五节第五节 核酸的研究方法核酸的研究方法 一、核酸的分离、提取通则 为了得到完整的大分子核酸，一般要注意3点 ：1保持低温（04）。2防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌。3防止核酸酶的作用。 第89页/共108页抑制DNase： 可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂 十二烷基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂。 抑制RNase： （1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用 具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethyl pyrocarbonate, DEPC）处理。 （2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。 （3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（

31、RNasin）等RNase的抑制剂。 第90页/共108页二、大分子DNA的提取 1材料的选择 2细胞破碎 第91页/共108页3DNA-蛋白质（DNP）的提取 真核细胞DNA与蛋白质结合成核蛋白（DNP），RNA与蛋白质结合成RNP，而且DNP和RNP常常混在一起。利用DNP和RNP在不同浓度NaCl中溶解度的不同来分离DNP和RNP。 可用1mol/LNaCl溶液提取DNP。 0.51.0012 0.14相 对 溶 解 度NaCl（mol/L）DNP在NaCl中的溶解度第92页/共108页4去蛋白质 （1）SDS （2）苯酚法 （3）氯仿法 （4）酚:氯仿:异戊醇25:24:1 第93页/共108页5沉淀DNA 6去杂质 （1）去RNA （2）去多糖 7进一步纯化 生物材料 DNP（RNP） DNP 纤维状DNA 较纯DNA 纯DNA *原核生物的DNA是裸露的，与蛋白质结合不多，分离纯化要简单些。 破细胞1.0mol/L NaCl*去蛋白质酒精沉淀去RNA柱层析，电泳密度梯度离心去