放射药物学04体外分析2与irma

1、Page 2Page 3条件条件：1.*Ag与与Ag免疫活性相同免疫活性相同2.Ag恒量恒量，Ab恒量恒量3.*Ag与与Ag总量大于总量大于Ab有效结合位点有效结合位点 Ag： 抗原抗原 *Ag：标记抗原：标记抗原 Ab：抗体：抗体 Ag-Ab：抗原抗体复合物：抗原抗体复合物*Ag + AbAg+*Ag-Ab + *AgAg-Ab + Ag（B）（F）K1K2K2K1 AgAg* *与与AgAg由于免疫化学性质一致，共同竞争性与由于免疫化学性质一致，共同竞争性与AbAb结合结合，当，当AgAg* *和和AbAb的量保持恒定，的量保持恒定，AgAg* *与与AgAg之和大于之和大于AbAb时，时

2、，则则AgAg* *-Ab-Ab复合物的形成受复合物的形成受AgAg含量的制约，二者之间存含量的制约，二者之间存在在; ; 即即随着随着AgAg浓度的增浓度的增加，加，* *Ag-Ag-AbAb复合物就减少，因为复合物就减少，因为AgAg* *对对AbAb的结合被的结合被AgAg竞争性抑制。根据这一函数关系的竞争性抑制。根据这一函数关系的，可求出被测抗原的含量，可求出被测抗原的含量。Page 6K即为反应的平衡常数，又叫亲合常数即为反应的平衡常数，又叫亲合常数Ka。它反映抗原和体间亲合力的大小，直接影响分析的灵敏度。它反映抗原和体间亲合力的大小，直接影响分析的灵敏度。对特定的一对抗原抗体，在一

3、定温度下，对特定的一对抗原抗体，在一定温度下，K值是固定的。值是固定的。温度与温度与K值之间一般是负相关关系。值之间一般是负相关关系。Page 7Page 9BFB/F0.670.3320.50.510.330.670.50.170.830.21. 平衡加样法：平衡加样法：标准（待测）标准（待测）Ag + Ab + 标记标记*Ag 温育温育 分离分离 测定测定2. 顺序加样法顺序加样法 （非平衡法，两步法）：（非平衡法，两步法）：Ag + Ab Ag . Ab + Ab *Ag + Ab *Ag . Ab + *Ag第一步：第一步：第二步：第二步：Page 12Page 13 在实际的操作中，

4、为了绘制标准曲线，我们需要在实际的操作中，为了绘制标准曲线，我们需要设立一下几个反应管：设立一下几个反应管：1.1. 最大结合管（最大结合管（B B0 0）：标准抗原的量为：标准抗原的量为0 0，仅有标记，仅有标记抗原和特异性抗体，反应后分离所得抗原和特异性抗体，反应后分离所得B B的放射性为的放射性为B B0 0。这表示标记抗原和抗体的最大结合值，也即。这表示标记抗原和抗体的最大结合值，也即是待测样品的最小测量点。是待测样品的最小测量点。2.2. 非特异结合管（非特异结合管（NSBNSB）：）：使用蒸馏水代替特异性抗使用蒸馏水代替特异性抗体，在反应后测得的放射性。这表示标记抗原和体，在反应后

5、测得的放射性。这表示标记抗原和杂质蛋白或容器管壁等的结合情况，也反映了我杂质蛋白或容器管壁等的结合情况，也反映了我们实际工作条件下的环境所带来的误差。们实际工作条件下的环境所带来的误差。3. 3. 总防射性管（总防射性管（T T）：反应后不分离，直接测得的放：反应后不分离，直接测得的放射性就是总放射性。这表示游离的标记抗原与结合射性就是总放射性。这表示游离的标记抗原与结合的标记抗原的标记抗原- -抗体复合物的总放射性。这也代表了抗体复合物的总放射性。这也代表了我们实验的最大量我们实验的最大量程。程。T%=B%+F%=100%T%=B%+F%=100%。4. 4. 标准管（标准管（B1 B1 B

6、nBn）：加入不同浓度的标准抗原后，：加入不同浓度的标准抗原后，再加入等量的标记抗原和特异性抗体进行反应。反再加入等量的标记抗原和特异性抗体进行反应。反应结束后分别分离出每管的沉淀，测定出的沉淀放应结束后分别分离出每管的沉淀，测定出的沉淀放射性作为射性作为B B。B1-BnB1-Bn是标准曲线绘制的依据。是标准曲线绘制的依据。5. 5. 样品管（样品管（BxBx）：使用待测的临床样本代替标准管中）：使用待测的临床样本代替标准管中的标准抗原，在相同条件下进行反应和分离，得到的标准抗原，在相同条件下进行反应和分离，得到的沉淀放射性，其对应的浓度可以在绘制的标准曲的沉淀放射性，其对应的浓度可以在绘制

7、的标准曲线上对照得出。线上对照得出。Page 15Page 16Page 17Page 18Page 19 二抗法：非特异性低，但沉淀较差；二抗法：非特异性低，但沉淀较差； PEG PEG法：沉淀较好，但非特异性高；法：沉淀较好，但非特异性高；二抗二抗-PEG-PEG法：较好，目前常用；法：较好，目前常用； 固相法：较好，目前常用；固相法：较好，目前常用；磁珠分离法：较好，但成本高磁珠分离法：较好，但成本高Page 20Page 21 以药物浓度的对数为横坐标，以药物浓度的对数为横坐标，B/FB/F对数函数为纵坐标，对数函数为纵坐标，完成的的一元方程直线图，拟合性较差。完成的的一元方程直线图，

8、拟合性较差。 logit logit Y=a + b Y=a + b logitlogit Y= Y=lnln( (logXlogX/ 1-B/Bo)/ 1-B/Bo) a a截距截距 b b斜率为斜率为-值值 Y Y结合率结合率 Y Y与与X X呈负相关呈负相关优点：操作简单，普通计优点：操作简单，普通计算器也可拟合算器也可拟合缺点：由于缺点：由于Log0Log0无解，拟无解，拟合时缺失合时缺失0 0剂量点，降低了剂量点，降低了灵敏度；如有突出值，拟灵敏度；如有突出值，拟合合线会变化；线会变化；顺序加顺序加样法样法不不可用。可用。Page 23ad(NSB)a=Bo, d= NSB,c=使使

9、Bo下降一半的抗原浓度下降一半的抗原浓度, b=Logit-Log线性回归所得斜率线性回归所得斜率Page 24R2 b(c+*p+X)+q + Rc(b-1)+q-*p-X-c=0R = F/Bb = NSB/Fc = 1/Ka*p = *AgX = Agq = AbPage 25放射核素标记在抗体上放射核素标记在抗体上，与待测抗原结合后，用一，与待测抗原结合后，用一定手段将多余抗体除去，测定定手段将多余抗体除去，测定复合物的放射性复合物的放射性，其，其活度与待测抗原呈正活度与待测抗原呈正相关相关。Ag + * Ab*Ag-Ab + *Ab* Ab* Ab* Ab（B）（F）Page 28P

10、age 29Page 30分组分组名称名称代表符号代表符号Ag*Ab分离试剂分离试剂标准曲线组总放射性管T非特异结合管NSB最大结合管B0标准管B1-Bn样品组样品管U质控组质控管QC 被测物质浓度被测物质浓度标准曲线的有效范围标准曲线的有效范围结合率（结合率（%）无法测量的平台效应无法测量的平台效应Page 32Page 33Page 34Page 35杂质杂质 标记标记抗体抗体Page 36固相包固相包被一抗被一抗待测待测抗原抗原第二第二抗体抗体标记的第标记的第三抗体三抗体Page 37Page 38函数模型及函数式函数模型及函数式曲线类型曲线类型B% - D 曲线B% - LogD半对数S曲线B/Bmax% - LogD半对数S曲线CPM LogD半对数S曲线，在一定范围内为直线五参数Logistic模型 曲线三参数单位点质量作用模型 曲线Page 39Page 40Page 41差异差异RIAIRMA反应原理竞争性抗原抗体结合非竞争性抗原抗体结合标记方法标记抗原标记抗体反应试剂三种主要反应试剂：标准抗原，标记抗原，抗体二种