课件十四酶的固定化

1、模块四、酶的固定化模块四、酶的固定化酶制剂生产技术酶制剂生产技术生物化工学院生物化工学院 杨芳杨芳固定化生物技术固定化生物技术 通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。反复利用。 引入引入学习情境十四学习情境十四 酶的固定化酶的固定化工作任务（一）固定化技术和固定化酶概述工作任务（一）固定化技术和固定化酶概述工作任务（二）酶的固定化技术工作任务（二）酶的固定化技术工作任务（三）固定化酶的特点工作任务（三）固定化酶的特点工作任务（四）固定化酶的应用工作任务（四）固定化酶的应用水溶

2、性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术工作任务（一）固定化技术和固定化酶概述工作任务（一）固定化技术和固定化酶概述固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)(immobilized enzyme) 固定在载体上并在一定空间范围内进行固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。催化反应的酶。固定化技术和固定化酶概述固定化技术和固定化酶概述工作任务（一）工作任务（一）固定化技术和固定化酶概固定化技术和固定化酶概固定化技术和固定化酶概述固定化技术和固定化酶概述工作任务（一）工作任务（一）固定化技术和固定化酶概固定化技术和

3、固定化酶概固定化方法固定化方法吸附法吸附法结合法结合法网格型网格型微囊型微囊型热处理热处理法法交联法交联法包埋法包埋法固定化酶与游离酶相比，具有下列优点固定化酶与游离酶相比，具有下列优点（l l）极易将固定化酶与底物、产物分开；）极易将固定化酶与底物、产物分开；（2 2）可以在较长时间内进行反复分批反应和连续反应；）可以在较长时间内进行反复分批反应和连续反应；（3 3）在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；）在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；（4 4）酶反应过程能够加以严格控制；）酶反应过程能够加以严格控制；（5 5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯

4、工艺；（6 6）较游离酶更适合于多酶反应；）较游离酶更适合于多酶反应；（7 7）可以增加产物的收率，提高产物的质量；）可以增加产物的收率，提高产物的质量；（8 8）酶的使用效率提高，成本降低。）酶的使用效率提高，成本降低。固定化技术和固定化酶概述固定化技术和固定化酶概述工作任务（一）工作任务（一）固定化技术和固定化酶概固定化技术和固定化酶概固定化酶操作的注意事项固定化酶操作的注意事项 活性中心活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严

5、密的条件下进行。需要在非常严密的条件下进行。 功能基团功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合定化结合 酶的高级结构酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。应尽量

6、在非常温和的条件下进行。固定化技术和固定化酶概述固定化技术和固定化酶概述工作任务（一）工作任务（一）固定化技术和固定化酶概固定化技术和固定化酶概吸附法吸附法 利用各种固体吸附剂将利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。上，而使酶固定化的方法。 常用的固体吸附剂有常用的固体吸附剂有活活性炭、氧化铝、硅藻土、多性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石羟基磷灰石等。等。固定化技术固定化技术 操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。 由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不

7、牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。 工作任务（二）工作任务（二）固定化技术固定化技术包埋法包埋法 将酶或含酶菌体包埋在各种多将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。孔载体中，使酶固定化的方法。固定化技术固定化技术 包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。工作任务（二）工作任务（二）固定化技术固定化技术根据载体材料和方法的不同，可分为：根据载体材料和方法的不同，可分为：凝胶包埋法凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶凝胶内部的微孔中，内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含

8、酶菌体。大多数为球制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。状或片状，也可按需要制成其他形状。 常用的凝胶有常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。凝胶。 半透膜包埋法半透膜包埋法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等胺膜、火棉胶膜等 固定化技术固定化技

9、术工作任务（二）工作任务（二）固定化技术固定化技术（1）琼脂凝胶包埋法）琼脂凝胶包埋法 将一定量的琼脂加入到一定体积的水中，加热使将一定量的琼脂加入到一定体积的水中，加热使之溶解，然后冷却至之溶解，然后冷却至4855C，加入一定量的酶，加入一定量的酶液，迅速搅拌均匀后，趁热分散在预冷的甲苯或四液，迅速搅拌均匀后，趁热分散在预冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形成球状固定化细胞胶粒，分离后氯乙烯溶液中，形成球状固定化细胞胶粒，分离后洗净备用。洗净备用。缺点：机械强度较差，底物、产物扩散困难，故使缺点：机械强度较差，底物、产物扩散困难，故使用受限制用受限制固定化技术固定化技术工作任务（二）工作任务（二）固

10、定化技术固定化技术（2）海藻酸钙凝胶包埋法）海藻酸钙凝胶包埋法 称取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制成一定称取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制成一定浓度的海藻酸钠溶液，经杀菌冷却后，与一定体积浓度的海藻酸钠溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的酶液或细胞混合均匀，然后用注射器或滴管将冷的酶液或细胞混合均匀，然后用注射器或滴管将冷凝悬液滴到一定浓度的氯化钙溶液中。凝悬液滴到一定浓度的氯化钙溶液中。优点：优点：操作简便、条件温和，对细胞无毒害，通过操作简便、条件温和，对细胞无毒害，通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径。改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径。使用时注意控制培养基中磷酸盐的浓度，维持一定使用

11、时注意控制培养基中磷酸盐的浓度，维持一定的钙离子浓度。的钙离子浓度。固定化技术固定化技术 工作任务（二）工作任务（二）固定化技术固定化技术海藻酸钙包埋法装置海藻酸钙包埋法装置 将水溶性的海藻酸钠配成将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶或细胞分散水溶液，并把酶或细胞分散在其中，然后将其滴入凝固在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用浴中（常用CaClCaCl2 2 溶液），溶液），使海藻酸钠中的使海藻酸钠中的Na+Na+，部分被，部分被CaCa2+2+所取代而形成由多价离所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。子交联的离子网络凝胶。固定化技术固定化技术 工作任务（二）工作任务（二）固定化技术固定化技

12、术 （3 3）角叉菜胶包埋法）角叉菜胶包埋法 角叉菜，属褐藻门，杉藻科，角叉菜属，自然分布于大西洋角叉菜，属褐藻门，杉藻科，角叉菜属，自然分布于大西洋沿岸和我国东南沿海以及青岛、大连等海域，是中国的一种沿岸和我国东南沿海以及青岛、大连等海域，是中国的一种重要经济海藻。角叉菜不仅是重要经济海藻。角叉菜不仅是卡拉胶卡拉胶生产的重要原藻，而且生产的重要原藻，而且近年来越来越多地应用于医药领域，引起人们的广泛关注。近年来越来越多地应用于医药领域，引起人们的广泛关注。固定化技术固定化技术 工作任务（二）工作任务（二）固定化技术固定化技术 将一定量的角叉菜胶悬浮于一定体积的水中，加热溶解。将一定量的角叉菜

13、胶悬浮于一定体积的水中，加热溶解。灭菌后冷却到灭菌后冷却到30-5030-50C C，与一定量的酶液等混合均匀后，与一定量的酶液等混合均匀后，趁热滴到预冷的氯化钾溶液中，或者先滴到冷的植物油中，趁热滴到预冷的氯化钾溶液中，或者先滴到冷的植物油中，成型后再置于氯化钾溶液中的到球状固定化颗粒。成型后再置于氯化钾溶液中的到球状固定化颗粒。 优点：通透性能好，对细胞无毒害。优点：通透性能好，对细胞无毒害。固定化技术固定化技术 工作任务（二）工作任务（二）固定化技术固定化技术 （4 4）明胶包埋法）明胶包埋法 将一定量的明胶悬浮于一定体积的水中，加热溶将一定量的明胶悬浮于一定体积的水中，加热溶解。灭菌后

14、冷却到解。灭菌后冷却到3535C C以上，与一定量的酶液等以上，与一定量的酶液等混合均匀后制成所需形状的胶粒。机械强度不够混合均匀后制成所需形状的胶粒。机械强度不够可用戊二醛等双功能试剂交联。可用戊二醛等双功能试剂交联。固定化技术固定化技术 工作任务（二）工作任务（二）固定化技术固定化技术（5 5）聚丙烯酰胺凝胶包埋法）聚丙烯酰胺凝胶包埋法 先配置一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺与一定量先配置一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺与一定量的酶液等混合均匀后加入一定量的过硫酸钙和四甲基乙二胺，的酶液等混合均匀后加入一定量的过硫酸钙和四甲基乙二胺，混合后让其静置聚合即可获得。混合后让其静置聚合即可获

15、得。优点：机械强度高，可调节凝胶孔径优点：机械强度高，可调节凝胶孔径缺点：丙烯酰胺单体有毒性缺点：丙烯酰胺单体有毒性固定化技术固定化技术 工作任务（二）工作任务（二）固定化技术固定化技术（6 6）光交联树脂包埋法）光交联树脂包埋法例：相对分子量为例：相对分子量为1000-30001000-3000的的光交联聚氨酯光交联聚氨酯预聚物等，加入预聚物等，加入1%1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至5050，然后，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射用紫外照射3min3min，

16、就可制得，就可制得 优点：强度高、使用时间长固定化时间短优点：强度高、使用时间长固定化时间短固定化技术固定化技术 工作任务（二）工作任务（二）固定化技术固定化技术（7 7）半透膜（微囊型）包埋法）半透膜（微囊型）包埋法 是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。半透膜的孔径只有几酶。半透膜的孔径只有几至几十至几十，所以也称为微囊化法。，所以也称为微囊化法。 适用于底物和产物都是小分子物质的固定化适用于底物和产物都是小分子物质的固定化固定化技术固定化技术 工作任务（二）工作任务（二）固定化技术固定化技术结合法结合法 选择适宜的载体

17、，使之通过共价键或离子键选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法。与酶结合在一起的固定化方法。固定化技术固定化技术 工作任务（二）工作任务（二）固定化技术固定化技术根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：离子键结合法：离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有离子交换剂。常用的有DEAE-DEAE-纤维素纤维素、TEAE-TEAE-纤维素纤维素、DEAE-D

18、EAE-葡聚葡聚糖凝胶糖凝胶等。等。 共价键结合法：共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有：共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素纤维素、琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶、甲壳质甲壳质、氨基酸共聚物氨基酸共聚物、甲基丙稀甲基丙稀醇共聚物醇共聚物等。等。酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使使载体

19、活化载体活化，固定化技术固定化技术 工作任务（二）工作任务（二）固定化技术固定化技术交联法交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。状结构的固定化酶的方法。戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫（游离氨基反应，形成席夫（SchiffSchiff）碱，而使酶或菌）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。常用的双功能常用的双功能试剂有戊二醛、试剂有戊二醛、己二胺、顺丁己二胺、顺丁烯二酸酐、双烯二

20、酸酐、双偶氮苯等。其偶氮苯等。其中应用最广泛中应用最广泛的是的是戊二醛戊二醛。固定化技术固定化技术 工作任务（二）工作任务（二）固定化技术固定化技术 交联法制备的固定化酶或固定化菌体交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固结合牢固，可以长，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使团被交联，致使酶活力损失较大酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的或固定化菌体的颗粒较小颗粒较小，给使用带来不便。为此，给使用带来不便。为此，可将可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短交联法与吸附法

21、或包埋法联合使用，以取长补短。 固定化技术固定化技术 工作任务（二）工作任务（二）固定化技术固定化技术热处理法热处理法 将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内而制备得到的固定化菌体。在菌体内而制备得到的固定化菌体。 只适用于热稳定性较好的酶的固定化，严格控制加热温只适用于热稳定性较好的酶的固定化，严格控制加热温度和时间。度和时间。 热处理法也可以与交联法或其他固定化方法联合使用。热处理法也可以与交联法或其他固定化方法联合使用。固定化技术固定化技术 工作任务（二）工作任务（二）固定化技术固定化技术固定化酶的特性固定化酶的特性 将酶

22、或含酶菌体固定化制成固定化酶或固定化菌将酶或含酶菌体固定化制成固定化酶或固定化菌体以后，由于受到载体等的影响，酶的特性可能会体以后，由于受到载体等的影响，酶的特性可能会有些变化。有些变化。 1 1、固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。、固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。 贮存稳定性和操作稳定性比游离酶大多数提高贮存稳定性和操作稳定性比游离酶大多数提高对热稳定性绝大多数提高对热稳定性绝大多数提高对蛋白类分解酶的稳定性提高对蛋白类分解酶的稳定性提高对变性剂的耐受力升高对变性剂的耐受力升高工作任务（三）工作任务（三）固定化酶的特性固定化酶的特性 2 2、固定化酶的、固定化酶的最适作用温度最

23、适作用温度一般与游离酶差不多，活化一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。能也变化不大。 3 3、固定化酶的、固定化酶的底物特异性底物特异性与游离酶比较可能有些不同，与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特其变化与底物分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起。异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起。 4 4、酶经过固定化后，其作用的最适、酶经过固定化后，其作用的最适pHpH值往往会发生一些值往往会发生一些变化。这一点在使用固定化酶时，必须引起注意。变化。这一点在使用固定化酶时，必须引起注意。 影响固定化酶最适影响固定化酶

24、最适pHpH值的因素主要有两个：一个是载体的值的因素主要有两个：一个是载体的带电性质，载体带负电荷，带电性质，载体带负电荷，pHpH向碱性方向移动，载体带正向碱性方向移动，载体带正电荷，电荷，pHpH向酸性方向移动；另一个是酶催化反应产物的性向酸性方向移动；另一个是酶催化反应产物的性质，催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适质，催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pHpH值比游值比游离酶的离酶的pHpH值高；反之则低。值高；反之则低。固定化酶的特性固定化酶的特性工作任务（三）工作任务（三）固定化酶的特性固定化酶的特性5 5、 评价固定化酶的指标：评价固定化酶的指标：（1 1）固定化酶的比活）

25、固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（位面积（cmcm2 2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。（2 2）操作半衰期操作半衰期：衡量稳定性的指标。：衡量稳定性的指标。 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t t1/21/2）（3 3）相对酶活力：相对酶活力： 具有相同酶蛋白（或具有相同酶蛋白（或RNARNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力相

26、对酶活力固定化酶的特性固定化酶的特性工作任务（三）工作任务（三）固定化酶的特性固定化酶的特性固定化酶的应用固定化酶的应用1 1、固定化酶在工业生产中的应用、固定化酶在工业生产中的应用（1 1）氨基酰化酶）氨基酰化酶世世界上第一种工业化生产的固定化酶。界上第一种工业化生产的固定化酶。 19691969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶氨基酰化酶. .（2 2）植酸酶）植酸酶 植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称，属类酶的总称，属磷酸单酯水解酶。磷酸单酯水解

27、酶。 固定化植酸酶已经工业化生产，广泛用于饲料行业。固定化植酸酶已经工业化生产，广泛用于饲料行业。工作任务（四）工作任务（四）固定化酶的应用固定化酶的应用葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶 世界上生产规模最大，应用世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。最为成功的一种固定化酶。工作任务（四）工作任务（四）固定化酶的应用固定化酶的应用固定化酶的应用固定化酶的应用（3 3）高果糖浆的生产）高果糖浆的生产- -葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶（4 4）-半乳糖苷酶半乳糖苷酶又称为乳糖酶，用于水解乳中存在的乳糖，生成半乳糖又称为乳糖酶，用于水解乳中存在的乳糖，生成半乳糖和葡萄糖用于制造低乳糖奶。已于和葡萄糖用于制造低乳糖奶。已于19771977年实现工业化年实现工业化（5 5）延胡索酸酶）延胡索酸