第二章 固定化酶(1~3节)

1、Enzyme Engineering酶工程第三章第三章 固定化酶固定化酶n第一节第一节 概述概述n第二节第二节 固定化酶的性质及其影响因素固定化酶的性质及其影响因素n第三节第三节 固定化酶的制备固定化酶的制备n第四节第四节 固定化细胞固定化细胞n第五节第五节 固定化辅酶和原生质体固定化辅酶和原生质体n第六节第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）酶反应器和固定化酶（细胞）的应用的应用生物催化剂细胞酶非生长生长可溶固定化悬浮固定化连续间歇吸附包埋交联化学连续材料膜固定酶液凝胶吸附化学连接物固定化再循环系统凝胶吸附连续半连续分批间歇 连续活塞模式搅拌连续反应器间歇连续活塞模式搅拌连续反应器第一节第一节

2、概述概述图6-1 生物催化剂作用方式示意固定化酶的发展史什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术第一节第一节 概述概述二 固定化酶的优缺点n 多次使用 n 可以装塔连续反应n优点： 纯化简单n 提高产物质量n 应用范围广n缺点： 首次投入成本高n 大分子底物较困难第一节结束第一节结束n点击返回第二节第二节 固定化酶的性质及其影响因素固定化酶的性质及其影响因素n一 影响固定化酶性质的因素n二 固定化后酶性质的变化n三 评价固定化酶的指标一一 影响固定化酶性质的因素影响固定化酶性质的因素1 酶本身的变化，主要是由于活性

3、中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。一一 影响固定化酶性质的因素影响固定化酶性质的因素2 载体的影响n（1） 分配效应n（2） 空间障碍效应n（3） 扩散限制效应3. 固定化方法的影响二二固定化后酶性质的变化固定化后酶性质的变化n1 固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降n原因：酶结构的变化n 空间位阻二二 固定化酶的性质固定化酶的性质2 固定化对酶稳定性的影响n（1） 操作稳定性提高n（2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。n (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。n (4 ) 对分解酶的稳定性提高。n（5） 对变性剂的耐受力升高2 固定化后酶稳定性提高的原因：

4、固定化后酶稳定性提高的原因：na. 固定化后酶分子与载体多点连接。nb. 酶活力的释放是缓慢的。nc. 抑制自降解，提高了酶稳定性。3 pH的变化的变化nPH对酶活性的影响：n（1） 改变酶的空间构象n（2）影响酶的催化基团的解离n（3）影响酶的结合基团的解离n（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。pH对固定化酶的影响对固定化酶的影响n1） 载体带负电荷，pH向碱性方向移动。 n微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。3 pH的变化的变化n载体带正电荷，pH向酸性方向移动。n（2）产物性质对体系pH的影响n催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值

5、比游离酶的pH值高；反之则低4 最适温度变化最适温度变化n一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。n5 底物特异性变化n作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化n既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。6 米氏常数米氏常数Km的变化，的变化，Km值随载体值随载体性质变化性质变化n（1） 载体与底物带相同电荷，KmKm固定化酶降低了酶的亲和力。n（2） 载体与底物电荷相反，静电作用，KmKm三三 评价固定化酶的指标：评价固定化酶的指标：n1 酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。n1Kat=1mol/s=60mo

6、l/min=60*106umol/minn =6*106IUn2. 酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力单位 三三 评价固定化酶的指标：评价固定化酶的指标：n1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。n 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。n2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）三三 评价固定化酶的指标：评价固定化酶的指标：n3. n4. n或称偶联效率，活力保留百分数。n5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对

7、酶活力n 四四 固定化酶的活力测定方法介绍固定化酶的活力测定方法介绍n1. 振荡测定法：n2. 酶柱测定法：四四 固定化酶的活力测定方法介绍固定化酶的活力测定方法介绍n3. 连续测定法n利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。n 第二节第二节固定化酶的性质及其影响因素提要固定化酶的性质及其影响因素提要n影响固定化酶性质的因素n固定化酶的性质n评价固定化酶的指标 酶本身的变化载体的影响固定化对酶活性的影响固定化对酶稳定性的影响最适pH的变化最适温度变化底物特异性与游离酶不同米氏常数Km的变化评价指标活力测定方法第二节结束第二节结束n点击返回第三节第

8、三节 固定化酶的制备固定化酶的制备n一 一般方法及特点n二 酶的固定化方法一一 一般方法及特点一般方法及特点关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。1 四大类方法：n吸附法（包括电吸附法）n结合法（无机多孔材料）n交联法（双功能试剂） n包埋法（微胶囊法） 各类固定化方法的特点比较各类固定化方法的特点比较: 比较项目吸附法结合法 交联法包埋法物理吸附.共价键结合离子键结合 制备难易易难易 较难较难固定化程度弱强中等 强强活力回收率较高低高 中等高载体再生可能不可能可能 不可能不可能费用低高低 中等低底物专一性不变可变不变 可变不变适用性酶源多较广广泛 较广小分子底物、药用

9、酶2 选择方法依据：选择方法依据： n（1） 酶的性质n（2） 载体的性质n（3） 制备方法的选择3 固定化后酶的考察项目：固定化后酶的考察项目：n（1） 测定固定化酶的活力，以确定固定化过n程的活力回收率。n（2） 考察固定化酶稳定性n（ 2） 考察固定化酶最适反应条件二二 酶的固定化方法酶的固定化方法n（一） 吸附法n（二）结合法n（三）交联法n（四） 包埋法（entrapping method）（一）（一） 吸附法吸附法n1 物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。n 选择载体的原则 （1）要有巨大的比表面积 （2） 要有活泼的表面（3） 便于装柱进行连续反应。（二）结

10、合法（二）结合法n1 离子键结合法n2 共价键结合法1 离子键结合法离子键结合法n概念n常用载体:DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶n使用注意：pH、离子强度、温度2 共价键结合法共价键结合法n（1）概念n（2）可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键n（3）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体共价键结合法制备固定化酶的共价键结合法制备固定化酶的“通式通式”n首先载体上引进活泼基团n 关键 n 然后活化该活泼基团n 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键（4）载体活化的方法）载体活化的方法nA重氮法nB叠

11、氮法nC烷基化反应法nD硅烷化法nE溴化氰法A重氮法重氮法n反应示意式如下 A重氮法重氮法n目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等n该方法需要载体具有芳香族氨基A重氮法重氮法n反应式及原理B 叠氮法叠氮法n例n用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下：n 酯化n 肼解n 叠氮化n(4) 偶联B 叠氮法叠氮法n对含有羧机基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于酶偶联 C烷基化反应法烷基化反应法n含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。D硅烷化法硅烷化法n多孔

12、玻璃特点：n机械强度好，表面积大。n耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。 D硅烷化法硅烷化法n一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。D硅烷化法硅烷化法D硅烷化法硅烷化法D硅烷化法硅烷化法E 溴化氰法溴化氰法n本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。E 溴化氰法溴化氰法（三）交联法（三）交联法n借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。（三）交联法常用

13、试剂（三）交联法常用试剂n常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱(shiff)（三）交联法的形式（三）交联法的形式n交联法有2种形式：酶直接交联法n 酶辅助蛋白交联n双重固定法 （1） 吸附交联法n（2） 交联包埋法酶直接交联法酶直接交联法n在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。酶辅助蛋白交联酶辅助蛋白交联n为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个载体蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血

14、红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。（1） 吸附交联法吸附交联法n先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。（2）交联包埋法）交联包埋法n把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。（四）（四） 包埋法（包埋法（entrapping method） n定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。（四）（四） 包埋法包埋法n包埋法分为网格型和微囊型n1网格型n2微囊型1网格型网格型n(1) 概念 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法2微囊型包埋法微囊型包埋法n是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。 微囊化法制备固定化酶有两种方法微囊化法制备固定化酶有两种方法