TALEN靶向基因操作技术

1、TALENE向基因操作技术技术介绍：TALE技术(Transcription activator like effectors )是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自植物细菌Xanthomonassp.的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的。目前 TALE技术主要有两种应用：1 ) TALEN( transcriptionactivator-like (TAL) effector nucleases)技术构建针对任意特定核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位点

2、打断目标基因DNA进而在该位点进行 DNAB作，如Knock-out、Knock-in或点突变。它克服了常规的 ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有 ZFN相等或更好的活性，使基因操作变得更加简单、方便。)技术，针对基因启动子上2 ) TALEA( transcription activator-like (TAL) effector activator游任意特定DNA序列构建转录激活因子，可提高特异内源基因的表达水平，而不需要购买或克隆cDNA。TALE 技术已经成功应用到了细胞、植物、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类研究对象，日益成为功能 强大的实

3、验室工具，使得过去无法逾越的项目成为可能。技术特点：1. 无基因序列、细胞、物种限制。2 .TAL的核酸识别单元与 A G C、T有恒定的对应关系。实验设计简单准确、实验周期短、成本低。3 . 成功率几乎可达100%。4 . 毒性低、脱靶情况少。5 .克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题， 而具有ZFN相等或更好的活性。TALE构建与应用：1 .TALE 靶点识别模块构建TAL 的核酸识别单位为重复34 个恒定氨基酸序列，其中的12、 13 位点双连氨基酸与A G G T有恒定的对应关系，即NG识别T, HD识别C, NI识别A, NN识别Go

4、为获得识别某一特定核酸序列的 TALE只须按照DNAff歹将相应TAL 单元串联克隆即可。由于物种基因组大小的不同，选择的特异序列长度也不同， 对于哺乳类动物包括人类，一般选取 16-20bp的DNAff列作为识别靶点。2 .TALEN 的基因敲除将识别特异DNAJ列的TALE与内切核酸酶FokI偶联，可构建成剪切特异DNAff列的内切酶TALEN而且FokI需形成2聚体方能发挥活性，大大减少了随意剪切的几率。在实际操作中，需在目标基因的编码区或外显子和内显子的交界处选择两处相邻（间隔13-22 碱基）的靶序列（一般16-20 个碱基）分别进行TAL识别模块构建。将这两个相邻靶点识别模块（分别

5、）融合克隆到FokI的N-末端，形成真核表达载体，得到 TALENW粒 对。将TALENW粒对共转入细胞中可实现靶基因敲除。TALENT粒对共转入细 胞后，表达的融合蛋白，分别与靶位点特异结合，由于两个TALENT合蛋白中的 FokI 临近， 形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA，形成DSB（Double-StrandBreaks）,诱发DNA®伤修复机制。细胞可以通过NHE（J Non-homologousEndJoining ） 修复DNA， 在此修过程中或多或少地删除或插入了一定数目的碱基，造成移码，形成目标基因敲除突变体。3 .TALEN 的同源重组

6、当通过TALENT生DSB后，若能提供同源修复模板，细胞可通过同源重组 方式修复DNA因此可以对内源DNA故更精细的操作，如点突变（磷酸化位点）、 保守区域替换、N端或C端加标记（GFP HA Flag）等等。通过TALENT生 DSB后，在外源模板存在的情况下，发生同源重组修复DNA4 .TALEA的转录激活将识别特异DNAff歹1J的TALE与转录因子激活区域VP64（VP64 ActivationDomain）融合，可构建成识别启动子上特异DNAff列的转录激活因子TALEA在实际操作中，需在目标基因的启动子上游 选取靶序列（一般12-18个碱基），构建TAL识别模块。将识别模块TALE

7、融合 克隆到VP64的N-末端，形成真核表达质粒TALEA将TALENW粒转入细胞中， 表达的融合蛋白结合启动子附近的特异DNAJ列，并通过VP64敢活区域与PolII结合，从而激活基因的转录，提高了内源目标基因的表达。为什么选择我们：1. 特有纳米打印自组装TALENT术（已申报PC"*利）使得我们构建 TALEN（A：时间大大缩短，成本极大降低。我们的方法比市场现有方法快一倍， 而 且成本降低一倍。2. 业内顶尖的技术支持团队。我们专业人员具备深厚细胞分子生物学技术、多年的模式生物重组经验，加上一流的服务理念，能百分之百满足客户的需求。除付费服务外，对于意义重大的项目，可以采取各

8、种合作方式，尽快先开展客户的课题，以充分保证客户项目的进展。我们的团队既有留学美国顶级学校的的高级科学家，他们曾就职美国多家著名医药公司的首席科学家职位, 也有毕业于国内顶级院校的的研究人员。因此，我们能随时与客户进行深入沟通，帮助客户分析研究难题，并提供最优解决方案，从而满足各种实验研究需求。3. 灵活的合作（运营）模式。可以通过合作共享成果的模式，尽快开展客户的课题。成功案例：本公司自提供TALENT术服务以来，已累计成功构建了1000多对已验证活性的 TALEN质粒，得到了客户的广泛认可，其中比较有代表性的成功案例有：1 、中科院动物所客户在成纤维细胞中，分别成功构建三个基因敲除的细胞系

9、，效率在10-20%（其中一个基因的双链敲除效率达到20%）。2、北京大学客户从服务开始的两个月时间内，拿到6 个 Knock-in 细胞系。3、西南家蚕实验室从本公司提供服务开始，不到3 个月时间拿到基因敲除的家蚕突变体。4、台湾中原大学使用本公司提供的质粒陆续成功构建了 5 种基因敲除的斑马鱼。5 、香港科技大学使用本公司提供的质粒成功构建了6 种基因敲除的斑马鱼。（持续增加中）新一代 E-TALEN本公司研究人员经过大量的实验工作，对TALEN吉构进行持续优化， 现在成功改造了 TALEN吉构，现推出新一代 E-TALEN （Enhanced TALEN）,活性更好，效率更高！图1 TA

10、LEN E-TALEN SSA测信号活性对比图2分别转染TALEIN E-TALEN后，细胞基因组 PCR产物T7E1酶切结果对比实验表明，E-TALEN比起TALEN活性更好，对基因组 DNAM有更高的剪切效率，使用E-TALEN将会大大提高实验者后续实验操作的效率。TALEN®务流程TALENT术服务内容服务内容说明周期价格TALEN质粒组装套餐针对同一目标基因设计合成 3对测序正确的TALEN质粒。10工作日询 价TALEIW 装根据DNAf歹U组装TALEN质粒，用于细胞内 DN砌断。提供一个或多个质粒和测序结果。10工作日询价TALENT性检测检测构建好的TALEN质粒活性

11、（报告基因方法或细胞系内直接检测）10工作日询价细胞系TALEN100%基因敲除通过TALENW断和修复基因编码区第一个外显子，敲除基因，提供两个目标基因敲除的细胞系（包括基因敲除后测序结果）。6周询价细胞系TALEN同源重组通过TALEN进彳f DN砌断和同源重组，提供两个目标基因变异的细胞系。基因变异包括内源基因点突变（磷酸化位点、保守区域替换），N端或C端标记（GFP HA Flag ）8周询价TALEN®因文库提供含有70多个络氨酸激酶的 TALEN基因文库，也可单个基因购买。即时询价TALEAS 装根据基因启动子DNA列组装TALEA提高内源基因的表达水平。提供一个或多个质粒和测序结果。10工作日询价TALEA活性检测检测构建好的TALEA质粒活性10工作日询价TALEAg因文库提供含有70多个络