结构生物学：冷冻电镜及其在生物医学中的应用

1、21世纪是世纪是“冰川世纪冰川世纪”！-冷冻电镜及其在生物医学中的冷冻电镜及其在生物医学中的应用应用生物电子显微术的发展生物电子显微术的发展n1950s Hall, Huxley & Brener (Oxford)发明了发明了负染技术负染技术；研究了生物材料。；研究了生物材料。-分辨率分辨率2 nm.n1960s Klug (MRC-Cambridge) 提出电子显微图提出电子显微图像的像的三维重构理论三维重构理论；解析了；解析了T4噬菌体的结构。噬菌体的结构。-1982 诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖。n1970s Henderson & Uniwin (MRC-Cambridge) 建立了建立了

2、电子晶体学电子晶体学；解析了；解析了第一个膜蛋白第一个膜蛋白bacteriorhodopsin的结构。的结构。-分辨率分辨率0.7 nm.n1980s Adrian & Dubochet (EMBL)发明了快速发明了快速冷冻技术冷冻技术- 冷冻电子显微术冷冻电子显微术诞生。诞生。-分辨率分辨率0.2 nm.Why high resolution?Why high resolution?传统样品包埋处理传统样品包埋处理-负染法负染法n用重金属染料堆积在分子周围，反衬出分子结构用重金属染料堆积在分子周围，反衬出分子结构n优点：衬度大，易于观察优点：衬度大，易于观察n缺点：缺点：n染料颗粒较大，不能

3、渗入分子内部染料颗粒较大，不能渗入分子内部外部形貌，缺乏细节外部形貌，缺乏细节n样品脱水样品脱水分子变形，结构失真分子变形，结构失真n分辨率低，分辨率低，2 nm结构是低分辨的、失真的结构！结构是低分辨的、失真的结构！现代样品包埋处理现代样品包埋处理-冰冻法冰冻法n将样品快速的冷冻在玻璃态的冰中将样品快速的冷冻在玻璃态的冰中n优点：优点：n样品含水样品含水天然状态天然状态n结构与在溶液中相同结构与在溶液中相同 真实结构真实结构n分辨率高，分辨率高，0.2 nm结构是高分辨的、保真的结构！结构是高分辨的、保真的结构！冰的物理状态冰的物理状态n冰可以多种物理状态存在冰可以多种物理状态存在n六角形冰

4、六角形冰n立方体冰立方体冰n玻璃态冰玻璃态冰n玻璃态冰是一种无定形状态玻璃态冰是一种无定形状态保持生物分子的天然结构保持生物分子的天然结构提供生物分子所需的水分提供生物分子所需的水分n冰的物理状态与水的冷冻速率有关冰的物理状态与水的冷冻速率有关n在极高的冷冻速率（在极高的冷冻速率（104 C/s)，水形成玻璃态，水形成玻璃态的冰的冰冷冻电子显微术冷冻电子显微术（cryo-electron microscopy)n主要步骤主要步骤n样品冷冻，将样品快速包埋在玻璃态样品冷冻，将样品快速包埋在玻璃态冰中冰中n样品转移，将样品转移到液氮或液氦样品转移，将样品转移到液氮或液氦冷却的低温冷台中冷却的低温冷

5、台中n样品观测及图像采集，在液氮或液氦样品观测及图像采集，在液氮或液氦温度进行温度进行n应用计算机进行图像处理和三维重构应用计算机进行图像处理和三维重构如何冷冻包埋样品？如何冷冻包埋样品？150 Why cryo-electron microscopy?classical negative stainingcryo-electron microscopyAdrian M, Dubochet J, et al. Nature (1984), 308:32-36.电镜观测和记录电镜观测和记录n由于样品在辐射下产生损伤，观测时须采由于样品在辐射下产生损伤，观测时须采用低剂量技术（用低剂量技术（low

6、 dose technique)n一般控制一般控制电子剂量电子剂量 20 e/2n低剂量技术低剂量技术n寻找寻找在低倍下进行在低倍下进行 （1-3k）n聚焦聚焦在照像区域的相邻区域进行在照像区域的相邻区域进行 （100-300k)n记录记录区域仅在照相时受到辐射区域仅在照相时受到辐射 （30-100k)Low-dose techniqueSearch modeexposure mode电镜与图像三维重构电镜与图像三维重构Electron MicroscopyWhy do we need 3D information?3D objectprojection2D photoDrawing by J

7、ohn OBrien, The New Yorker Magazine (1991)三维图像重构三维图像重构n在电镜下观察样品时，所看到的是样品在电镜下观察样品时，所看到的是样品在垂直于电子束方向的投影（二维信息）在垂直于电子束方向的投影（二维信息）n要得到样品的三维结构，须将投影信息要得到样品的三维结构，须将投影信息（二维信息）转变为三维信息（二维信息）转变为三维信息n将二维信息组合得到三维信息并得到三将二维信息组合得到三维信息并得到三维结构的过程称为三维图像重构维结构的过程称为三维图像重构三维重构基本原理三维重构基本原理-中央截面定理中央截面定理n三维函数投影的傅立叶变换三维函数投影的傅立

8、叶变换(Fourier transform) 等于该三维函数傅立叶变换等于该三维函数傅立叶变换在垂直于投影方向的中央截面在垂直于投影方向的中央截面在电镜下，物体沿电子束方向投影的傅在电镜下，物体沿电子束方向投影的傅立叶变换是该物体三维傅立叶变换在垂立叶变换是该物体三维傅立叶变换在垂直于电子束方向的中央截面直于电子束方向的中央截面The principle of 3D reconstruction三维物体三维物体二维投影二维投影二维投影的二维投影的傅立叶变换傅立叶变换三维傅立叶变换三维傅立叶变换三维结构三维结构逆傅立叶变换逆傅立叶变换 De Rosier DJ, Klug A. Nature (

9、1968), 217:130-134.The effect of sampling冷冻电镜在生物医学中的应用冷冻电镜在生物医学中的应用乙酰胆碱受体乙酰胆碱受体(AchR)通道通道n已知：已知：n配体门控通道（乙酰胆碱）配体门控通道（乙酰胆碱）n由由5个亚基组成个亚基组成 （）n5个亚基围成一个孔（通道）个亚基围成一个孔（通道）n每个亚基含每个亚基含4个个 -螺旋螺旋 （M1-M4)nM2与形成通道有关与形成通道有关n配基（乙酰胆碱）结合部位位于配基（乙酰胆碱）结合部位位于 亚基上亚基上n未知：未知：n为什么为什么AchR是一个阳离子通道？是一个阳离子通道？n为什么为什么M2与形成通道有关？与形

10、成通道有关？n通道的门控机制是什么？通道的门控机制是什么？乙酰胆碱的突触间隙释放乙酰胆碱的突触间隙释放与实验模拟与实验模拟AchR的三维结构的三维结构(Unwin, Nature 423, 949, 2003)Side viewTop viewTransmembrane AchR通道门的结构通道门的结构(Unwin, MRC-Cambridge)negativehydrophobicM2AchR通道门的结构通道门的结构 (Unwin, MRC-Cambridge)n孔道的门由疏水性氨基孔道的门由疏水性氨基酸形成，直径酸形成，直径8水化离子可以通过水化离子可以通过n门由亚基之间疏水相互门由亚基之

11、间疏水相互作用锁住作用锁住门开放时需打断门开放时需打断n通道入口含带负电的氨通道入口含带负电的氨基酸，形成阳离子选择基酸，形成阳离子选择性滤器性滤器AchR是一个阳离子是一个阳离子通道通道 +AchShut open - AchAchR的门控机制的门控机制 (Unwin, Nature 373:37, 1995)Side viewTop viewBlue:-AchWhite:+AchBrcena M. et.al. PNAS 2009;106:582-5872009 by National Academy of SciencesStructural model of the coronavir

12、ion based on tomogramsBrcena M. et.al. PNAS 2009;106:582-5872009 by National Academy of SciencesHIV对宿主的感染机制对宿主的感染机制J Liu et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi:10.1038/nature07159=spikesJ Liu et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi:10.1038/nature07159Conformational change in the gp120 trimerinduced by CD4 bind

13、ingHarris A. et.al. PNAS 2006;103:19123-191272006 by National Academy of SciencesDistributions of HA and NA spikes on H3N2 influenza virusHarris A. et.al. PNAS 2006;103:19123-191272006 by National Academy of SciencesHA=neuraminidaseNA=ribonucleaprotein戊型肝炎病毒的结构戊型肝炎病毒的结构(PNAS，106:12992-12997，2009)戊型肝

14、炎病毒衣壳蛋白的结构戊型肝炎病毒衣壳蛋白的结构(PNAS，106:12992-12997，2009)The Nobel Prize in Chemistry 2009Venkatraman Ramakrishnan 1/3 of the prize MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United KingdomThomas A. Steitz 1/3 of the prize Yale University New Haven, CT, USAAda E. Yonath1/3 of the prize Weizmann Institute of Science Rehovot, Israelfor studies of the structure an