第二章-天然药物化学成分提取分离鉴定方法与技术(色谱法)

1、 碳酸钙碳酸钙（固定相）（固定相）色素混合液色素混合液石油醚石油醚 (流动相）流动相）1906年，年，Tsweet发现色谱分离现象发现色谱分离现象色谱柱色谱柱2色色谱谱法法（Chromatography） 一、色谱法在研究天然药物有效成分中的应用、色谱法在研究天然药物有效成分中的应用：分离混合物分离混合物精制化合物精制化合物鉴定化合物鉴定化合物 利用混合物中各成分在固定相和移动相利用混合物中各成分在固定相和移动相中中吸附吸附、分配分配及其及其亲和力亲和力的差异而达到分离。的差异而达到分离。色谱的三要素色谱的三要素三者相互关系三者相互关系 色谱法的分类色谱法的分类 七、色谱法七、色谱法 柱色谱柱

2、色谱吸附色谱法吸附色谱法 *1 1）原理）原理： 利用吸附剂对混合物中各成分分子利用吸附剂对混合物中各成分分子吸附吸附能力能力的差异而达到分离的色谱法。的差异而达到分离的色谱法。物理吸附物理吸附 化学吸附化学吸附 半化学吸附半化学吸附v物理吸附物理吸附 ：v化学吸附：化学吸附：v半化学吸附：半化学吸附：“相似者易吸附相似者易吸附”避免避免氢键形成氢键形成能力能力3）吸附色谱的三要素）吸附色谱的三要素流动相流动相溶质溶质吸附吸附剂剂竞争竞争吸附作用吸附作用a a、吸附剂（固定相）、吸附剂（固定相）硅胶（硅胶（silica） SiO2 XH2O 注意：注意：活化温度不宜高，不宜分离碱性物质。活化温

3、度不宜高，不宜分离碱性物质。 氧化铝（氧化铝（aluminium oxide） 极性吸附剂，极性吸附剂，最适于分离植物中的碱最适于分离植物中的碱性或中性的亲脂性成分性或中性的亲脂性成分。 吸附特性与硅胶类似，但吸附特性与硅胶类似，但碱性氧化铝碱性氧化铝不宜分离酸性物质不宜分离酸性物质。聚酰胺（聚酰胺（polyamide）结构结构：-CH2-CO-NH-n原理原理：氢键吸附学说氢键吸附学说 酰氨基与化合物（羟酰氨基与化合物（羟基、羧基及醌基）形基、羧基及醌基）形成氢键吸附。成氢键吸附。用途用途：分离黄酮类、酚类、醌类、有机酸类及鞣质。分离黄酮类、酚类、醌类、有机酸类及鞣质。影响吸附强弱的因素影响

4、吸附强弱的因素：1 1、洗脱能力：水、洗脱能力：水 甲醇或乙醇甲醇或乙醇 丙酮丙酮 氯仿氯仿 稀氨水稀氨水 C=O，CHO，NH2，OH，COOH上样量大上样量大，常用于制，常用于制备分离，是分离天然化备分离，是分离天然化学成分最常用的方法。学成分最常用的方法。柱色谱是一种将柱色谱是一种将分离材料装入柱状容器中分离材料装入柱状容器中, ,以适当的洗脱剂进行洗脱以适当的洗脱剂进行洗脱而使不同成分得到分离的而使不同成分得到分离的色谱方法。色谱方法。其原理、吸附剂及洗脱剂的选择与薄层色谱其原理、吸附剂及洗脱剂的选择与薄层色谱法相同。法相同。操作步骤：操作步骤：注意点：上柱的样品须经过注意点：上柱的样

5、品须经过纯化处理纯化处理（过滤、（过滤、萃取、脱色、沉淀等）萃取、脱色、沉淀等）1）装柱）装柱实验室常用的柱内径与柱长之比实验室常用的柱内径与柱长之比通常为通常为1:151:151:201:20。若柱粗而短，则分离效果较差。若柱粗而短，则分离效果较差。若柱过长而细，分离效果虽好，若柱过长而细，分离效果虽好，但流速慢，消耗时间太长。但流速慢，消耗时间太长。a a、干法、干法b b、湿法：、湿法：因湿法装柱容易赶走硅胶内的气泡，因湿法装柱容易赶走硅胶内的气泡，故一般以湿法装柱较好。故一般以湿法装柱较好。 2）上样）上样a a、样品易溶于洗脱剂：湿法上上样、样品易溶于洗脱剂：湿法上上样 梯度洗脱：洗

6、脱剂极性从小到大。梯度洗脱：洗脱剂极性从小到大。 洗脱剂液面高度始终要高于柱面。洗脱剂液面高度始终要高于柱面。 控制洗脱剂流速为匀速。控制洗脱剂流速为匀速。 有色成分收集各色带洗脱液。有色成分收集各色带洗脱液。 无色成分则采用等分收集。无色成分则采用等分收集。 浓缩洗脱液，薄层检识后合并相同流分。混合浓缩洗脱液，薄层检识后合并相同流分。混合 成分则进一步分离。成分则进一步分离。3）洗脱）洗脱植物色素分离图示植物色素分离图示26 分配色谱法是以液体做固定相，用与其不分配色谱法是以液体做固定相，用与其不相混溶的的溶剂做流动相的相混溶的的溶剂做流动相的液液- -液色谱法液色谱法。利用被分离成分在固定

7、相和流动相中的利用被分离成分在固定相和流动相中的溶解度溶解度不同。不同。易溶于流动相的成分，移动速度快。易溶于流动相的成分，移动速度快。易溶于固定相的成分，移动速度慢。易溶于固定相的成分，移动速度慢。2、分分配配色色谱谱法法 *（ Distribution Chromatography）流动相流动相溶质固定相固定相竞争竞争支持剂支持剂固定相固定相流动相流动相待分离物质待分离物质分配色谱分配色谱四要素四要素正相分配色谱：亲水性成分和弱亲脂性成分正相分配色谱：亲水性成分和弱亲脂性成分反相分配色谱：强亲脂性成分反相分配色谱：强亲脂性成分1 1、正相分配色谱、正相分配色谱 2 2、反相分配色谱、反相分

8、配色谱 33先将支持剂和固定相拌匀先将支持剂和固定相拌匀抽滤，除去多余的固定相抽滤，除去多余的固定相将含有固定相的支持剂倒入流动相中饱和将含有固定相的支持剂倒入流动相中饱和湿法装柱湿法装柱洗脱用的流动相在使用前用固定相溶剂饱和洗脱用的流动相在使用前用固定相溶剂饱和3、离子交换色谱法、离子交换色谱法（Ion exchange chromatography）基本原理：基本原理： 离子交换树脂上有可解离的阳离子或阴离子交换树脂上有可解离的阳离子或阴离子基团，能离子基团，能可逆性可逆性的与被分离成分上的离子的与被分离成分上的离子基团发生交换，使混合成分中基团发生交换，使混合成分中离子型与非离子离子型与

9、非离子型物质型物质或或具有不同离解度的离子化合物具有不同离解度的离子化合物得到分得到分离。离。操作方式：操作方式： 柱色谱柱色谱液液- -固色谱法固色谱法固定相：离子交换树脂固定相：离子交换树脂流动相：含强离子的水溶液流动相：含强离子的水溶液阳离子交换树脂阳离子交换树脂：强酸性（强酸性（-SO-SO3 3-H-H+ +） 弱酸性（弱酸性（-COO-H-COO-H+ +） 阴离子交换树脂：阴离子交换树脂：强碱性（强碱性（-N+-N+（CHCH3 3）3 3ClCl- -） 弱碱性（弱碱性（-NH-NH2 2OHOH，-NH-NH-，-N=-N=） 4、凝胶过滤色谱法、凝胶过滤色谱法（Gelper

10、meation chromatography） 原理：原理：分子筛。分子筛。固定相：凝胶固定相：凝胶（具多孔网状结构）（具多孔网状结构） 葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（sephadex Gsephadex G） 羟丙基葡聚糖凝胶（羟丙基葡聚糖凝胶（ sephadex LH-20sephadex LH-20）流动相：流动相： 水或有机溶剂水或有机溶剂415、大孔吸附树脂色谱、大孔吸附树脂色谱 利用大孔树脂具有利用大孔树脂具有吸附性吸附性和和分子筛分子筛作用，作用，使天然药物中相对分子量大小及吸附力强弱使天然药物中相对分子量大小及吸附力强弱不同的化学成分得以分离。不同的化学成分得以分离。液液- -固色谱

11、法固色谱法固定相：大孔吸附树脂固定相：大孔吸附树脂流动相：溶剂流动相：溶剂多孔网状结构多孔网状结构对极性吸附剂来说，成分极性越大，越难对极性吸附剂来说，成分极性越大，越难洗脱；洗脱剂的极性越大，越易洗脱。洗脱；洗脱剂的极性越大，越易洗脱。 二、薄层色谱法（二、薄层色谱法（TLC）* 定义：定义：将吸附剂均匀的铺在平板上，把要分离将吸附剂均匀的铺在平板上，把要分离分析的样品点加到薄层色谱板上，然后用适当的溶剂分析的样品点加到薄层色谱板上，然后用适当的溶剂系统展开，在一定的条件下显色或直接在日光或紫外系统展开，在一定的条件下显色或直接在日光或紫外光下观察所获得的斑点，从而达到光下观察所获得的斑点，

12、从而达到分离、分析、鉴定分离、分析、鉴定的目的。的目的。1）薄层色谱的吸附剂和支持剂：）薄层色谱的吸附剂和支持剂： 在选用吸附剂或支持剂时，一般是根据在选用吸附剂或支持剂时，一般是根据被分离物质的化学性质来选用。当不了解被被分离物质的化学性质来选用。当不了解被分离物质的化学性质时，可以先选用分离物质的化学性质时，可以先选用最常用最常用的硅胶或氧化铝的硅胶或氧化铝，如果分离效果不好，可再，如果分离效果不好，可再改用其他的吸附剂或支持剂。改用其他的吸附剂或支持剂。 常常用用的的展展开开剂剂正己烷、环己烷正己烷、环己烷 、四氯化碳、甲苯、氯仿、四氯化碳、甲苯、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇

13、、水乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇、水2）薄层色谱的一般操作）薄层色谱的一般操作a a、制板、制板b b、活化、活化c c、点样、点样d d、展开、展开e e、显色、显色f f、计算比移值、计算比移值 C、展开、展开薄层色谱的展开方式有上行、下行、单向、双向、薄层色谱的展开方式有上行、下行、单向、双向、多次、径向等多种方式。多次、径向等多种方式。多数采用直线形上行展开，薄层板水平角度以多数采用直线形上行展开，薄层板水平角度以7575 为最佳。为最佳。预饱和中预饱和中展开中展开中预防预防 边缘效应边缘效应定义：定义：样品经色谱分离后，某成分从原点至该样品经色谱分离后，某成分从原点至该成分斑点中心的距离与从原点至展开剂前沿的距成分斑点中心的距离与从原点至展开剂前沿的距离的比值称为该成分的比移值（离的比值称为该成分的比移值（RfRf值）。值）。 原点至色谱斑点中心的距离原点至色谱斑点中心的距离 比移值（比移值（Rf值）值） 原点至展开剂前沿的距离原点至展开剂前沿的距离用作微量分析，特别适合于用作微量分析，特别适合于亲水性较强的成分。亲水性较强