植物总DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测ppt课件

1、植物基因组DNA的提取琼脂糖凝胶电泳检测n脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)、核糖核酸、核糖核酸(RNA) (RNA) n与蛋白质结合在一同以核蛋白与蛋白质结合在一同以核蛋白DNPDNP的方式存在。的方式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。白释放出来。n植物总植物总DNADNA包括细胞核包括细胞核DNADNA和细胞核外和细胞核外DNA,DNA,前者存前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)D

2、NA(mtDNA)和和叶绿体叶绿体DNA(ctDNA)DNA(ctDNA)。背景知识背景知识核酸的存在方式核酸的存在方式nDNADNA为白色类似石棉样的纤维状物，为白色类似石棉样的纤维状物，RNARNA的纯品呈的纯品呈白色粉末或结晶。白色粉末或结晶。nDNADNA、RNARNA和核苷酸都是极性化合物，普通都溶于和核苷酸都是极性化合物，普通都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。游离酸易溶于水。n在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。中较稳定。 核酸的理化性质核酸的理化性

3、质细胞破碎细胞破碎 抽提去蛋白质抽提去蛋白质 沉淀核酸沉淀核酸根本过程根本过程 机械方法：机械方法： 超声波处置法、研磨法、匀浆法；超声波处置法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用化学试剂法：用SDSSDS处置细胞；处置细胞； 酶解法：酶解法： 参与溶菌酶，破坏细胞壁。参与溶菌酶，破坏细胞壁。 细胞破碎细胞破碎 uSDSSDS法法 SDS SDS是有效的阴离子去垢剂是有效的阴离子去垢剂, , 细胞中细胞中DNADNA与蛋与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合白质之间常借静电引力或配位键结合, SDS, SDS可以破可以破坏这种价键。坏这种价键。uCTABCTAB法法 CTAB CTAB是一种阳离子

4、去垢剂，它可以溶解膜是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的与脂膜，使细胞中的DNA-DNA-蛋白质复合物释放出来，蛋白质复合物释放出来，并使蛋白量变性，使并使蛋白量变性，使DNADNA与蛋白质分别。与蛋白质分别。DNADNA提取提取u 蛋白质蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇常用苯酚：氯仿：异戊醇2525：2424：1 1或氯仿：异戊醇或氯仿：异戊醇2424：1 1抽提。抽提。u RNA RNA 常选用常选用RNaseRNase消化消化 ，或是用，或是用LiClLiCl来消除大来消除大分子的分子的RNARNA。u 酚类物质酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩提取液中加少量巯基乙醇

5、，选取幼嫩的资料。的资料。u 多糖多糖 提取液中加提取液中加1 1PVPPVP。DNADNA纯化去杂质纯化去杂质实验资料实验资料 新颖蔬菜叶片新颖蔬菜叶片( (去叶脉去叶脉) )试剂试剂 2 2CTABCTAB抽提液抽提液 TE TE 缓冲液缓冲液(pH=8.0) (pH=8.0) 氯仿：异戊醇氯仿：异戊醇(24:1)(24:1) 资料与试剂资料与试剂离心机离心机 水浴锅水浴锅研钵研钵 微量移液器微量移液器仪器器具仪器器具移液器量程的选择移液器量程的选择1取取 2g 清洗凉干的新颖叶片于研钵中，加清洗凉干的新颖叶片于研钵中，加 1/3 药匙石英砂药匙石英砂和和 4mL 2 倍的倍的 CTAB

6、提取液，迅速研磨。提取液，迅速研磨。2将将 1mL 研磨液转入研磨液转入 1.5mL 离心管中，置于离心管中，置于65水浴中保水浴中保温温 20min，其间颠倒混匀，其间颠倒混匀23次。破碎细胞次。破碎细胞3. 12000r/min 离心离心 5min，取上清液，取上清液700L转到另一离心管转到另一离心管中。参与等体积氯仿：异戊醇中。参与等体积氯仿：异戊醇24:1混合液，充分颠倒混合液，充分颠倒混匀。混匀。12000r/min，离心，离心 5min。抽提去蛋白。抽提去蛋白4将上清液移入新的将上清液移入新的1.5mL离心管内，加离心管内，加 600L异丙醇。颠异丙醇。颠倒混匀，可见倒混匀，可见

7、 DNA 絮状沉淀。沉淀核酸絮状沉淀。沉淀核酸512000r/min，离心，离心 1min，倒掉上清液，将离心管倒置枯，倒掉上清液，将离心管倒置枯燥。燥。 将沉淀回溶于将沉淀回溶于20L TE 缓冲液待测。缓冲液待测。操作步骤操作步骤1)选取新颖资料，研磨迅速彻底，研磨好的资料应与选取新颖资料，研磨迅速彻底，研磨好的资料应与 CTAB 抽提抽提液充分混匀；液充分混匀；2)假设提取产物有颜色，能够是资料中含有较多的多酚类物质，假设提取产物有颜色，能够是资料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇添加巯基乙醇25，尽能够选取幼嫩的资料；，尽能够选取幼嫩的资料；3为了获得具有生物活性的天然核酸，在分别制

8、备过程中必需采为了获得具有生物活性的天然核酸，在分别制备过程中必需采用温暖的条件，防止过酸过碱、猛烈地搅拌，防止热变性，同用温暖的条件，防止过酸过碱、猛烈地搅拌，防止热变性，同时还要防止核酸降解酶类的降解。时还要防止核酸降解酶类的降解。本卷须知本卷须知DNADNA分子在高于等电分子在高于等电点的点的PHPH溶液中带负溶液中带负电荷，在电场中向电荷，在电场中向正极挪动。在一定正极挪动。在一定电场强度下，电场强度下，DNADNA分分子的迁移速度与相子的迁移速度与相对分子质量的对数对分子质量的对数成反比。成反比。电泳原理电泳原理琼脂糖是一种线性多糖聚合物。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越

9、小，其分辨才干就越强。浓度越高，孔隙越小，其分辨才干就越强。仪器和试剂仪器和试剂 仪器仪器 电泳仪电泳仪 电泳槽电泳槽 灌胶模具等灌胶模具等Tris-硼酸硼酸TBE Tris-乙酸乙酸TAE Tris-磷酸磷酸TPE常用电泳缓冲液常用电泳缓冲液 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，普电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，普通与蔗糖、甘油或聚蔗糖通与蔗糖、甘油或聚蔗糖400400组成上样缓冲液。组成上样缓冲液。 作用：作用：添加样品比重，以确保添加样品比重，以确保DNADNA均匀沉入加样孔内。均匀沉入加样孔内。构成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速构成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置

10、。度和位置。使样品呈色，使加样操作更方便。使样品呈色，使加样操作更方便。上样缓冲液上样缓冲液溴化乙锭溴化乙锭EBEB是一种荧光染料，是一种荧光染料，EBEB分子可嵌入核酸双链分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与色荧光。其荧光强度与DNADNA的含量成正比。的含量成正比。据此可粗略估计样品据此可粗略估计样品DNADNA浓度。浓度。 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶EBEB染色，肉眼可见核酸电泳带，染色，肉眼可见核酸电泳带，其其DNADNA量普通量普通5ng5ng。核酸染色剂核酸染色剂本卷须知：本卷须知：EBEB是致癌物质，切勿用手接是

11、致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。触，更不要污染环境。DNADNA分子量规范分子量规范不同种类不同种类DNA Marker1.1.凝胶制备凝胶制备 制备制备0.8%0.8%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖参琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖参与与 20mL 0.5 20mL 0.5TBETBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-50-60 60 时，参与时，参与 EB EB 至终浓度至终浓度 0.5 0.5g/mLg/mL。缓慢倒入胶板，。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。待胶凝固后拔出梳子。2.2.加样加样 取取1010l DNAl DNA样液与样液与 2 2l l 上样上样 buffer buffer 混匀，混匀，用微量移液器小心参与样品槽。用微量移液器小心参与样品槽。3.3.电泳电泳 接通电源，切记接近加样孔的一端为负，电压接通电源，切记接近加样孔的一端为负，电压为为15V/cm15V/cm长度以两个电极之间的间隔计算长度以两个电极之间的间隔计算, ,待溴酚待溴酚兰挪动到一定位置，停