基因工程第二章基因工程工具酶

1、第二章第二章 基因工程工具酶基因工程工具酶工具酶工具酶 -DNA-DNA分子的切割和连接技术。分子的切割和连接技术。 SmithSmith发现了第一个发现了第一个型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶(restriction endonuclease，RE) 对对DNADNA分子有特异地切分子有特异地切割作用。割作用。（手术刀剪）（手术刀剪） KhoranaKhorana又发现了又发现了T4DNAT4DNA连接酶（连接酶（LigaseLigase），能将），能将DNADNA片段连接在一起。片段连接在一起。（缝纫机、浆糊）（缝纫机、浆糊） DNADNA、RNARNA聚合酶和反转录酶等合成酶。聚合酶

2、和反转录酶等合成酶。（复印机）（复印机） 构成了一个研究构成了一个研究DNADNA、 RNARNA分子的分子的工具酶箱工具酶箱。第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 是一类能够识别双链是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。双链结构的核酸内切酶。一、宿主的限制和修饰现象一、宿主的限制和修饰现象-发现发现 19521953年在年在T偶数噬菌体和偶数噬菌体和 噬菌体对噬菌体对大肠杆菌的感染实验中研究者发现了细菌的限制大肠杆菌的感染实验中研究者发现了细菌的限制和修饰现

3、象。正是对限制和修饰现象的深入研究，和修饰现象。正是对限制和修饰现象的深入研究，导致限制性内切核酸酶的发现。导致限制性内切核酸酶的发现。 寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象由两种酶活性配合完成的，由两种酶活性配合完成的，一种叫一种叫修饰的甲基转移酶修饰的甲基转移酶，另一种叫，另一种叫核酸内切限制酶核酸内切限制酶。寄主控制的限制与修饰的作用，寄主控制的限制与修饰的作用， 一是一是保护自身的保护自身的DNA不受限制不受限制； 二是二是破坏外源破坏外源DNA使之迅速降解使之迅速降解。 根据限制根据限制- -修饰现象发现的核酸内切限制酶，现修饰现象发现的核酸内切限制酶，现在已成为重组在已

4、成为重组DNADNA技术学的重要工具酶。纯化后的限技术学的重要工具酶。纯化后的限制性内切酶允许分子生物学家以一种精确的可重复制性内切酶允许分子生物学家以一种精确的可重复的方式切割基因克隆所需的的方式切割基因克隆所需的DNADNA分子。分子。 这些酶的发现是基因工程发展过程中的一项突这些酶的发现是基因工程发展过程中的一项突破性进展。破性进展。二、限制性核酸内切酶的类型二、限制性核酸内切酶的类型 根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，一般将限制酶分为饰活性等，一般将限制酶分为I， 三大类。三大类。 I 类：不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。类：

5、不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。 类：基因工程的工具酶。类：基因工程的工具酶。 类：切割位点不在识别位点，一般离识别位点类：切割位点不在识别位点，一般离识别位点24 bp 26 bp，对分子克隆操作亦无实用意义。，对分子克隆操作亦无实用意义。 已有超过已有超过12001200种。种。三、限制性核酸内切酶的命名三、限制性核酸内切酶的命名 H.D.Smith等于等于1973年提议的命名系统。年提议的命名系统。 u名称的第个名称的第个1字母取自它来源细菌字母取自它来源细菌属名属名的第的第1个字母，个字母，大写大写；u第第2，3二个字母取自它来源细菌的二个字母取自它来源细菌的种名种名的头的头2个字

6、母，个字母，小写小写；u如果它的来源菌还有株系，则有第如果它的来源菌还有株系，则有第4个字母；若酶的编码基因个字母；若酶的编码基因位于噬菌体或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外的遗位于噬菌体或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外的遗传成分；传成分；u最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号。最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号。u前前三个字母用斜体三个字母用斜体表示。表示。 第一个字母取自产生该酶的细菌第一个字母取自产生该酶的细菌属名属名，用，用大写大写；第二、第三个字母是该细菌的第二、第三个字母是该细菌的种名种名，用，用小写小写；第四个字母代表株；第四个字母代表

7、株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d 属属 种种 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶所有的限制酶，除了以上名称外，前面还冠以系所有的限制酶，除了以上名称外，前面还冠以系统名称统名称内切酶系统名称内切酶系统名称 R；甲基化酶系统名称；甲基化酶系统名称 M。例如例如 R. Hind ，表示内切酶，表示内切酶 M. Hind ，表示甲基化酶，表示甲基化酶但现在限制性内切酶名称中的但现在限制性内切酶名称中的 R 省略不写。省略不写。 通常情况下，需要对克隆的通常情况下，需要对克隆

8、的DNADNA进行切割。进行切割。首先首先，如果以克隆单个基因为目的，该单个基因，如果以克隆单个基因为目的，该单个基因可能仅仅包含可能仅仅包含2-3kb DNA2-3kb DNA，则这个基因不得不从大的，则这个基因不得不从大的( (通常情况下超过通常情况下超过80kb)DNA80kb)DNA分子中切割出来。分子中切割出来。其次其次，大的，大的DNADNA分子不得不被切断成小的足以被载分子不得不被切断成小的足以被载体携带的片段。体携带的片段。绝大多数克隆载体能够承载的绝大多数克隆载体能够承载的DNADNA片段处于一个特片段处于一个特定的大小范围中。定的大小范围中。比如，以比如，以M13M13噬菌

9、体为基础的载体，所克隆的噬菌体为基础的载体，所克隆的DNADNA分子超过分子超过3kb3kb时运载效率非常低。时运载效率非常低。四、四、 型限制性核酸内切酶的基本特征型限制性核酸内切酶的基本特征 型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶的基本特性的基本特性 识别双链识别双链DNA分子中分子中4-8对碱基的特定序列大部对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型呈典型的旋转对称型回文结构回文结构(palindrome) 。 Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGAC

10、CAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口5 5 粘端切口粘端切口GAATTCCTTAAG EcoRGCTTAAAATTC GCTCGAGGAGCTCCTCGAG GAGCTC Pst3 3 粘端切口粘端切口DNADNA分子中识别序列的出现频率分子中识别序列的出现频率 对特定的限制性内切酶来说，在已知长度的对特定的限制性内切酶来说，在已知长度的DNADNA分子中分子中, ,识别序列的数量能够通过数学方法计算出来。识别序列的数量能够通过数学方法计算出来。 这一算法假定核苷酸以一种随机方式排列而这一算法假定核苷酸以一种随机方式排列而4 4

11、个个不同核苷酸以相同的比例出现不同核苷酸以相同的比例出现( (例如例如GCGC含量：含量：5050) )。 一个四核苷酸序列一个四核苷酸序列( (如如GATCGATC的酶的酶) )每每4 44 4=256=256个核个核苷酸出现一次。苷酸出现一次。 实际上，这些假设不可能完全有效。实际上，这些假设不可能完全有效。如，如，DNADNA分子，分子，49kb49kb， GCGC的含量要少于的含量要少于5050。对一个六核苷酸识别序列的限制性内切酶来说应该对一个六核苷酸识别序列的限制性内切酶来说应该具有具有1212个酶切位点。个酶切位点。实际上，这些识别位点发生的频率要小一些，实际上，这些识别位点发生

12、的频率要小一些，如：如：BglBgl有有6 6个，个， BamBamHIHI有有5 5个，个， SalSalI I则只有则只有2 2个。个。同功异源酶同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同尾酶同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，后，产生相同的粘性末端，称为称为同尾酶同尾酶。这两个相同的粘性末端

13、称为。这两个相同的粘性末端称为配配伍未端伍未端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A五、限制性内切酶的酶切反应条件五、限制性内切酶的酶切反应条件1.1.为内切酶提供一个合适的环境为内切酶提供一个合适的环境(buffer)(buffer)。 所有限制性内切酶所有限制性内切酶都需要在都需要在镁离子镁离子存在下才发存在下才发挥作用。挥作用。 离子强度通常由离子强度通常由氯化钠氯化钠(NaCl)(NaCl)提供。提供。 绝大多数限制性内切酶的最适绝大多数限制性内切酶的最适pHpH在在7.47.4

14、左右。左右。 不当的环境，不仅会降低限制性内切酶的活性，不当的环境，不仅会降低限制性内切酶的活性，还会导致酶的专一性的改变，使还会导致酶的专一性的改变，使DNADNA切割额外的、非切割额外的、非标准的识别序列。标准的识别序列。2. 2. 限制性内切酶的用量限制性内切酶的用量 供应商提供纯的已知浓度的溶液。供应商提供纯的已知浓度的溶液。1 1个酶单位：个酶单位： 被定义为在合适的温度与缓冲液中，在被定义为在合适的温度与缓冲液中，在2020L反反应体系中，应体系中，1h1h完全切割完全切割1 1g DNAg DNA所需要的酶量。所需要的酶量。 对于大量对于大量DNADNA的酶解，反应体积可按比例扩

15、大，的酶解，反应体积可按比例扩大，加入过量的酶（加入过量的酶（2 25 5倍）和较长的反应时间。倍）和较长的反应时间。3. 3. 反应温度：反应温度： 绝大多数，绝大多数，3737时活性达到最大；时活性达到最大； 一小部分需要不同的工作温度，如一小部分需要不同的工作温度，如SamSam酶酶消化时，消化时，2525才能达到酶的最大活性。才能达到酶的最大活性。BacBac酶酶消化时，消化时，5050才能达到酶的最大活性。才能达到酶的最大活性。 4. 4. 酶解过程：酶解过程： 酶解体系的确定；酶解体系的确定； 成分的混匀；成分的混匀； 酶切反应；酶切反应； 终止反应。终止反应。 终止反应的方法：终

16、止反应的方法： 如果酶切下来的如果酶切下来的DNADNA片段用于克隆实验，则反片段用于克隆实验，则反应中的酶应该消除掉以保证它不会意外地消化掉那应中的酶应该消除掉以保证它不会意外地消化掉那些将在以后步骤中加入的其他些将在以后步骤中加入的其他DNADNA分子。分子。“消灭消灭” ” 酶：酶： 7070保存很短的一段时间；保存很短的一段时间； 苯酚抽提苯酚抽提; ; 加入加入EDTA(EDTA(鳌和鳌和MgMg2+2+) )或加入或加入SDSSDS使酶变性。使酶变性。5.限制性内切酶的酶切结果鉴定6. 6. 内切酶对内切酶对DNADNA分子的不完全酶解：分子的不完全酶解： 完全酶切消化作用。完全酶

17、切消化作用。 不完全酶切消化作用不完全酶切消化作用（构建构建基因组物理图谱基因组物理图谱、基因组文库基因组文库及及片段连接片段连接）。）。 减少酶量，增加反应体系，缩短反应时间。减少酶量，增加反应体系，缩短反应时间。六、影响限制性内切酶的活性的因素六、影响限制性内切酶的活性的因素u酶的纯度酶的纯度uDNADNA样本的纯度样本的纯度uDNADNA甲基化的程度甲基化的程度u酶切反应的温度和时间酶切反应的温度和时间uDNADNA的分子构型的分子构型u内切酶的缓冲液内切酶的缓冲液 如果内切酶处于非最适的反应条件下其识别序列如果内切酶处于非最适的反应条件下其识别序列位点有时会发生改变，这时产生错误切割的

18、能力叫位点有时会发生改变，这时产生错误切割的能力叫内切酶的星活性内切酶的星活性。高甘油含量高甘油含量内切酶用量过大内切酶用量过大低离子强度低离子强度高高pHpH值值含有机溶剂含有机溶剂MnMn2+2+、CuCu2+ 2+ 、ZnZn2+2+等非等非MgMg2+2+的二价阳离子存在。的二价阳离子存在。第二节第二节 DNA连接酶连接酶DNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质 修复双链修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键。上切口处的磷酸二酯键。DNA连接酶连接酶OHP 5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5nicknick 3 C-

19、G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3OH Pds-DNA结构结构: 切口切口, 缺口缺口, 断口断口缺口缺口(gap) 切口切口(nick) 断口断口(cut)3HO P53HO P5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5 5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 T4-DNA连接酶DNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质 连接多个平头双链连接多个平头双链DNA分子分子

20、。DNA连接酶连接作用的分子机理连接酶连接作用的分子机理连接酶与辅助因子连接酶与辅助因子ATP（或（或NAD+）提供的激活）提供的激活AMP形形成一共价结合的酶成一共价结合的酶AMP复合物（腺苷酰酶）。同时释放出复合物（腺苷酰酶）。同时释放出 焦磷酸（焦磷酸（Ppi） 或烟酰胺单核苷酸（或烟酰胺单核苷酸（NMN） 。激活的激活的AMP从赖氨酸残基转移到从赖氨酸残基转移到DNA一条链的一条链的5末端末端磷酸基团上形成磷酸基团上形成DNA腺苷酸复合物。腺苷酸复合物。3OH末端对活跃的磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯末端对活跃的磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键将缺口封起来，同时释放出键将缺口封起来，同

21、时释放出AMP。 3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3OH PT4DNA连接酶连接酶ATP酶酶-AMP + PPi大肠杆菌连接酶大肠杆菌连接酶NAD+酶酶-AMP + NMN酶酶 3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3OH PAPDNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件Tris-HCl 50 - 100 mM pH 7.5MgCl2 10 mMATP 0.5 - 1 mM (不能大于不能大于1 mM )DTTVolume 10 - 20 m mlT T

22、 4 - 15 4 - 16 hr 1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应反应 1 小时，完全连接小时，完全连接 1 m mg l l-DNA（Hind III片段）所需片段）所需的酶量的酶量 1U酶已经足够酶已经足够DNA连接酶的种类连接酶的种类T4T4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶连接酶 分子量分子量68Ku68Ku。是噬菌体基因。是噬菌体基因30 30 编码的产物，需要编码的产物，需要ATPATP作为辅助因子。应用最广。作为辅助因子。应用最广。大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶 分子量分子量75Ku75Ku。是大肠杆菌基因组中的。是

23、大肠杆菌基因组中的lig lig 基因编码的基因编码的产物，需要产物，需要ATPATP作为辅助因子。不能连接平末端的两端片作为辅助因子。不能连接平末端的两端片段。假阳性背景低。段。假阳性背景低。影响连接反应的因素影响连接反应的因素温度温度 酶最佳反应温度酶最佳反应温度3737，在此温度下粘性末端之间氢键结合是不稳定在此温度下粘性末端之间氢键结合是不稳定的。连接反应最佳温度需介于两者之间。的。连接反应最佳温度需介于两者之间。DNADNA末端的浓度末端的浓度 两个两个DNADNA末端间的连接可认为是双分子反应，标准反应条件下，其末端间的连接可认为是双分子反应，标准反应条件下，其反应速率完全由相互匹

24、配的反应速率完全由相互匹配的DNADNA末端浓度决定。末端浓度决定。 线性分子；环状分子线性分子；环状分子 重组子的构型与重组子的构型与DNADNA浓度及浓度及DNADNA分子长度存在密切关系。小分子分子长度存在密切关系。小分子DNADNA片段易于分子内连接；较长片段易于分子内连接；较长DNADNA片段浓度降低有利于分子环化，浓度增片段浓度降低有利于分子环化，浓度增加利于分子间连接。加利于分子间连接。平头双链平头双链DNA片段的连接操作片段的连接操作 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连

25、接则属末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多 提高平头末端连接效率的方法包括：提高平头末端连接效率的方法包括：u加大连接酶用量（加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）倍大于粘性末端的连接）u加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 u加入加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用，促进大分子之间的有效作用u加入单价阳离子（加入单价阳离子（NaCl），最终浓度），最终浓度150-200 mM第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶（DNA

26、 polymerase） 能在能在引物引物和和模板模板的存在下，把的存在下，把脱氧核糖单核苷酸脱氧核糖单核苷酸连续的连续的加到双链加到双链DNA分子引物链的分子引物链的3 -OH末端，催化核苷酸的聚合末端，催化核苷酸的聚合作用。作用。DNA聚合酶的分类聚合酶的分类 依据聚合酶使用的模板不同，将其分为两类：依据聚合酶使用的模板不同，将其分为两类：l 依赖于依赖于DNA的的DNA聚合酶聚合酶l 依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌 DNA聚合酶聚合酶(pol ) 生物活性 聚活酶活性 外切酶活性 外切酶活性 置换活性 用途 - Mg2+ d NTPs polA G g2 pol

27、 pp g2 pol - p ppp d NTPs 抑制抑制- DNase - g2 , pol, dNTP - 外切酶活外切酶活性聚活酶活性性聚活酶活性用途用途 用切口平移方法标记 用于c克隆中合成第二链 用于对分子的突出尾进行末端标记 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（ Klenow Klenow ）KlenowKlenow酶的基本性质：酶的基本性质： 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I经枯草杆菌蛋白酶处理，经枯草杆菌蛋白酶处理，获得获得N N端三分之二的大肽段，即为端三分之二的大肽段，即为KlenowKlenow酶。酶。 KlenowKleno

28、w酶仍拥有酶仍拥有5353的的DNADNA聚合酶活性和聚合酶活性和3535的核酸外切酶活性，但失去了的核酸外切酶活性，但失去了5353的的核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。Klenow片段 补平限制酶切割产生的凹端 用d补平凹端，对片段进行末端标记 对带突出端的进行末端标记 在c克隆中，用于合成c第二链 在体外诱变中，用于从单链模板合成双链 应用anger双脱氧末端终止法进行测序 消化限制酶产生的突出端 应用于技术噬菌体聚合酶 生物活性 聚合酶活性 35外切核酸酶活性 交换（置换）反应 用途 5CCGOH33 GGCTACGA5 Mg T4DNA聚合酶聚合酶 dNTPs 5CCGATGCT3 3

29、GGCTACGA5 5CGCATCT33GCG5 Mg T4DNA聚合酶聚合酶 5CGCOH33GCG5 +5pA+5pC+5pT 5CGTCGCOH33GCAGCG5 Mg T4DNA聚合酶聚合酶 -32PdTTP5CGOH33GCAGCG5 5CGT * OH3 3GCAGCG5 补平或标记限制酶消化后产生的凹端 对带有突出端的分子进行末端标记 标记用作探针的片段 将双链的末端转化成平端 使结合于单链模板上的诱变寡核苷酸引物得到延伸Taq DNA 聚合酶聚合酶 Taq DNATaq DNA聚合酶是一种耐热的依赖于聚合酶是一种耐热的依赖于DNADNA的的DANDAN聚合聚合酶，最初从极度嗜热

30、的水生菌中纯化而来。酶，最初从极度嗜热的水生菌中纯化而来。 它具有它具有2 2种活性，需种活性，需MgMg2+2+作辅助因子。作辅助因子。 DNADNA聚合酶活性；聚合酶活性； 外切核酸酶活性。外切核酸酶活性。 主要应用于主要应用于PCRPCR反应。反应。逆转录酶 禽源逆转录酶和鼠源逆转录酶 生物活性聚合酶活性酶活性 用途 聚合酶活性聚合酶活性 5T T T T TOH3 3AAAAAUCUGUCCUA5 Mg dNTPs 逆转录酶逆转录酶 5 T T T T TAGACAGGAT 3 3AAAAAUCUGUCCUA 5 酶活性酶活性 RNA-5UCCGUA3DNA-3AGGCAT5 逆转录酶

31、逆转录酶 5UC33AGGCAT5+5CGUA3 用途 逆转录酶主要用于将转录成双链 在此反应中可用种类型的引物：寡脱氧胸苷酸12-18聚体,oligo dt特定序列的寡核苷酸 标记带突出端的片段 可用于双脱氧链终止法测序 DNA和RNA的修饰酶 末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl tranterminal deoxynucleotidyl transferasesferase），简称末端转移酶（），简称末端转移酶（terminal transferaseterminal transferase），能够），能够催化催化55脱氧核苷三磷酸

32、进行脱氧核苷三磷酸进行5 35 3方向的聚合作用，逐个方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性地将脱氧核苷酸分子加到线性DNADNA分子的分子的3-OH3-OH末端。末端。 当反应混合物中只有一种当反应混合物中只有一种dNTPdNTP时，就可以形成仅由一种核时，就可以形成仅由一种核苷酸组成的苷酸组成的33尾巴。我们特称这种尾巴为同聚物尾巴。尾巴。我们特称这种尾巴为同聚物尾巴。5 pOH 3 3 HOp 5 TdT Mg2+ dATP3 HOp 5 5 pAAAAAAAAAAAA OH 3 3 HOp 5 T4T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶与与DNADNA分子分子5-5-末端的标记末端的标记 多核苷酸激酶多核苷酸激酶（polynucleotide kinasepolynucleo