一种CAST基因过表达小鼠的建立

1、钙蛋白酶抑制蛋白基因过表达Balb/C 小鼠的繁育及鉴定虞 勇，李明辉，刘桂剑，李冰玉，邹云增，陈瑞珍*( 复旦大学附属中山医院心血管病研究所实验室，上海200032)收稿日期2016-02-03接受日期2016-06-04基金项目国家自然科学基金(31070786). Supported by National Natural Science Foundation ofChina( 31070786) .作者简介虞勇，主管技师. E-mail: yu.yong1zs-* 通 信 作 者 (Corresponding author). Tel:8543, E-mai

2、l: chen.ruizhenzs-摘要 目的： 建立 Balb/C 小鼠遗传背景的钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin, CAST )基因过表达小鼠的培育方法，并探讨碱性裂解液提取基因组DNA 在子代鼠基因型鉴定中的应用价值。方法： 将雄性 C57BL/6-CAST +/-转基因小鼠与雌性Balb/C 野生型小鼠杂交，子代小鼠中取雄性鉴定为CAST +/-杂合子小鼠与雌性Balb/C 野生型小鼠杂交，连续杂交直至消除C57BL/6小鼠遗传背景。取子代小鼠鼠尾组织，采用碱性裂解液提取基因组DNA ， PCR 法扩增 CAST基因片段，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。采用柯萨奇B3 病毒( CVB3

3、 )感染 Balb/C-CAST -/-小鼠以建立急性病毒性心肌炎小鼠模型。结果： C57BL/6-CAST +/-转基因小鼠与雌性Balb/C野生型小鼠连续杂交10 代可消除C57BL/6 小鼠遗传背景。采用碱性裂解液提取的基因组DNA 数量、纯度能夠满足后续实验需要，且产物大小与目的片段一致。成功建立Balb/C-CAST -/-基因型小鼠急性病毒性心肌炎模型。结论： 成功建立Balb/C-CAST 基因过表达小鼠，为后续研究奠定了基础；碱性裂解液提取基因组DNA 简单、高效，值得推广。关键词钙离子依赖性蛋白酶；钙蛋白酶抑制蛋白；柯萨奇B3 病毒；转基因；基因型鉴定中图分类号 R文献标志码

4、 ABreeding of calpastatin gene overexpression and identification in Balb/C mice YU Yong, LI *Ming-hui, LIU Gui-jian, LI Bing-yu, ZOU Y un-zeng, CHEN Rui-zhenLaboratory of cardiovascular disease research institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, ChinaAbstractObjective ： To est

5、ablish methods for the breeding of calpastatin (CAST ) gene overexpression mice on Balb/C background and to investigate the application of alkaline lysis solution extracted genomic DNA in genotyping. Methods：Tg-C57BL/6-CAST +/- male mice+/- were backcrossed to Balb/C wild type female mice. In the fi

6、lial generations, CAST heterozygous male mice were backcrossed to Balb/C wild type female mice for more than 10 generations to remove C57BL/6 genetic background. Then, Balb/C-CAST -/- mice from the same brood were infected with coxsakievirus ( CVB3 ) to establish the mouse model of acute viral myoca

7、rditis.Genomic DNA was isolated from filial generation mice tails. Then CAST gene fragment was amplified by PCR. Results： The reproduction of the filial generations with different phenotypes(CAST +/-, CAST -/- ) is basically in accordance with Mondels Genetics Law. To remove C57BL/6 genetic backgrou

8、nd,CAST +/- heterozygous male mice should be backcrossed to Balb/C-/-wild type female mice for at least 10 generations. the Mouse model of VMC with Balb/C-CAST mice was established. The agarose electrophoresis showed that the molecular weight of PCR products were consisted with that of objective gen

9、e fragments. Conclusions： Calpastatin gene overexpression transgenic mice on Balb/C background is a comparatively ideal experimental animal to study the interaction between calpain and CAST in the context of viral myocarditis and other diseases.The method of DNA extraction in our study can isolate g

10、enomic DNA from large number of tissue samples of mice which providing a solution for genotyping.Key Words calpain； calpastatin； coxsakie virus group B type3（ CVB3 ） ; transgenic； genotyping Calpain 是一类主要存在于细胞质中的钙离子依赖性半胱氨酸蛋白酶，激活后能通过有限酶切作用切割其底物，参与包括心血管疾病在内的多种病理过程1-2。 研究3发现，Calpain在急性病毒性心肌炎（VMC ）发病过程中

11、被激活，介导柯萨奇B3 病毒（ CVB3 ）直接感染导致的心肌损伤作用。在许多炎症性疾病模型的研究中，calpain 抑制剂表现出相应的器官保护作用4。Calpastatin（ CAST）是 Calpain 的内源性抑制剂，在心肌细胞内两者共定位，CAST 负向调控 Calpain 的活性，在体内及体外过表达CAST 均可抑制Calpain 活性 5。转基因动物模型常用于致病机制的探讨及治疗药物的筛选，2011 年本研究室从加拿大西安大略大学病理生理学系彭天庆教授实验室引进了C57BL/6-CAST 基因过表达小鼠。因此，本研究以C57BL/6-CAST 基因过表达小鼠为基础，尝试建立稳定的B

12、alb/C 小鼠遗传背景CAST 基因过表达模型，为后续研究奠定基础。1 材料与方法1.1 主要材料及试剂实验动物：C57BL/6-CAST +/-杂合子转基因小鼠雌、雄各1 只（5 6周龄）引进于加拿大西安大略大学病理生理学系彭天庆教授实验室，Balb/C 雌性野生型小鼠 （ 5 6 周龄） 购于复旦大学实验动物部。试剂：2 PCR Master mix、 DNA Marker 购自 ThermoFisher 公司； PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成；小鼠cTnI ELISA 试剂盒购自上海威奥生物科技有限公司；CVB3（ Nancy 株， 由本实验室保存复制）， 在 Vero 细

13、胞上复制。基因组 DNA 裂解液配制：溶液A 成分为 25 mmol/L NaOH ， 0.2 mmol/L EDTA ；溶液 B 成分为 40 mmol/L Tris-HCl ， pH 值 5.0。小鼠组织基因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。仪器： Thermo Fisher 公司高速台式冷冻离心机；美国 Bio-Rad 公司 PCR仪、电泳槽、ChemiDoc? MP System 全能型成像系统；Eppendorf 紫外分光光度计。1.2 Balb/C 遗传背景CAST 基因过表达小鼠的培育转基因小鼠饲养于复旦大学实验动物部，光照及黑暗每隔12 h 循环，恒温恒湿，

14、自由饮水进食，自然交配。采用1 雄配 3 雌合笼的方法将雄性C57BL/6-CAST +/-小鼠与雌性Balb/C 近交系小鼠交配繁殖，F1 代子鼠在3周龄时与亲代分离，提取鼠尾DNA ，用 PCR 方法鉴定出CAST 基因表达阳性小鼠，将雄性+/CAST 基因表达阳性小鼠与雌性Balb/C 近交系小鼠交配繁殖，获得的F2 代雄性CAST +/-小Balb/C 近交系小鼠交配繁殖，连续交配直至可获得遗传背景稳定的Balb/C-CAST 基因过表达小鼠，具体繁殖方案见图1 。100%C57BL/60%Balb/CF150%C57BL/650%Balb/CN225%C57BL6/75%Balb/C

15、N100.1%C57BL6/99.9%Balb/CC57-CAST+/-CAST+/-CAST+/-CAST+/-CAST+/-CAST+/-Balb/CBalb/CBalb/C图 1 Balb/C 遗传背景CAST 基因过表达小鼠繁育方法1.3 碱性裂解液提取子代小鼠基因组DNA 及 PCR 鉴定 子代小鼠断奶打耳号标记后剪取1 2 mm 鼠尾，采用碱性裂解液法提取DNA，放入 1.5 mL EP 管，加入50 L 溶液A，于金属浴上95孵育40 min， 室温放置1.5 h， 再加入 50 L 溶液B， 充分震荡混合，4 10 000 g离心 5 min，放4冰箱待用。基因组DNA 提取试

16、剂盒(北京天根)操作按说明书进行。基因组 DNA 扩增： CAST 基因引物上游，5 -GTT GGC TTA GGC TGC TTT TCG T- 3；下游，5 -CCA GAC TCC GTG ACA CCC CTT-3 。目的基因片段长度为518 bp。 PCR 反应体系：2 PCR Master Mix 12.5L，Primer( 25 mol/L ) 0.4L，DEPC-H2O 10.1L， cDNA 2L，总体积 25 L。 PCR 反应条件：(1)预变性 94，3 min；(2)变性 94，30 s；(3)退火 60,30s； (4)延伸72，60 s； 重复步骤(2) (4)4

17、0 次循环； (5)最后延伸72，10 min； (6)4保存。60琼脂糖凝胶电泳:用 0.5 TBE 缓冲液配置1%琼脂糖凝胶，加热融化，待温度降至左右加入溴化乙啶（EB） 1 2 L（ 10 mg/mL ） ，混匀后铺板，室温放置30 min，待凝胶完全凝固后放入电泳槽，25 L PCR 样本+5 L 6Loading Buffer ，上样量30 L，电压90 V，电泳 40 min，使用Bio-Rad 凝胶成像仪进行凝胶扫描。Eppendorf 紫外分光光度计上检测各样本浓度在600 800 ng/mL， D260/280值在1.6 1.8。1.4 Balb/C-CAST -/-小鼠急性

18、心肌炎模型的建立以第 10 代同窝3 4 周龄、基因型鉴定为 CAST -/-的雄性小鼠腹腔注射100 TCID50 的 CVB3 0.1 mL/只，对照组腹腔注射Eagle 液0.1 mL/只， 正常条件饲养7 d 时断颈处死，取心肌组织在10%中性甲醛中固定，H-E 染色观察心肌组织病变程度；取小鼠外周血分离血清，ELISA 法检测外周血中cTnI 含量。1.5 统计学处理采用 SPSS13.0软件包进行统计学分析，数据以x s 表示，两样本比较采用 t 检验，组间显著性检验采用单因数方差分析，所有实验重复3 次，检验水准（） =0.05。2 结 果2.1 转基因小鼠大体观察结果（图2）表

19、明：经过连续10 代以上杂交，得到遗传背景稳定的 Balb/C-CAST 基因过表达小鼠。图 2 不同遗传背景CAST 基因过表达小鼠A: C57BL/6-CAST 基因过表达小鼠;B: 杂交 F1 代 CAST 基因过表达小鼠;C: 杂交第 10 代 Balb/C-CAST 基因过表达小鼠2.2 碱性裂解液法及商品化试剂盒提取基因组DNA 效果的比较结果（图3）表明：碱性裂解液提取DNA 效果与市售DNA 提取试剂盒完全符合。图 3 杂交第 10 代 Balb/C-CAST 小鼠不同基因型PCR 鉴定结果1 5 ： 碱 性 裂 解 液 法 提 取 DNA ； 6 ： DNA marker;

20、711: 试 剂 盒 提 取 DNA. 1,7: 同 一 标 本( Balb/C-CAST +/-) ； 2,8：同一标本(Balb/C-CAST +/-) ； 3,9：同一标本(Balb/C-CAST -/-) ； 4,10：同一标本(Balb/C-CAST -/-) ； 5， 11：同一标本(Balb/C-CAST +/-)2.3 Balb/C-CAST -/-基因型小鼠急性病毒性心肌炎模型的建立同窝基因型鉴定为CAST-/-的雄性小鼠感染CVB3 进行急性心肌炎造模7 d 后，可见心脏表面有点状、片状白斑(图4) 。H-E 染色(图5)显示：心肌组织可见明显病灶和炎性细胞浸润，心肌纤维排

21、列紊乱，局部存在钙化现象。CVB3 模型组小鼠外周血cTnI 定量检测，与注射Eagle s液对照组小鼠相比，外周血 cTnI 浓度显著上升(P0.01 ) 。（ ng/ml）123456平均数SDP值对照组0.020.010.650.330.230.160.2330.24CVB3 组8.336.521.233.429.256.485.8723.030.00106图 4 VMC 造模小鼠心脏外观A: 正常对照小鼠心脏；B: CVB3 感染 7 d 小鼠心脏5 VMC 造模小鼠心肌组织H-E 染色A C:正常对照小鼠心肌组织；D F: VMC 小鼠心肌组织.Original magnificat

22、ion: 10(A,D); 100(B,E); 400(C,F)3 讨 论Calpain是一类主要存在于胞质中的钙离子依赖性的半胱氨酸蛋白酶，与许多疾病相关6，是许多疾病的潜在分子治疗靶点7-8。前期研究3已证实，Calpain在急性病毒性心肌炎( VMC )发病过程中被激活，介导CVB3 直接感染导致的心肌损伤作用。CAST是 Calpain的内源性抑制剂，通过其C末端的I、 IV结构域结合Calpain抑制其活性，同时通过其特定的氨基酸序列调节Ca2+通道的启闭，调控Calpain活性 9。Balb/C小鼠是公认的病毒性心肌炎模型动物，而C57BL/6-CAST 基因过表达小鼠因其C57B

23、L/6 小鼠遗传背景导致的免疫偏离不适合用作病毒性心肌炎模型小鼠10。 因此， 需要用C57BL/6-CAST 基因过表达小鼠与Balb/C小鼠进行杂交，以去除C57BL/6小鼠遗传背景。一般认为，通过至少10代的回交，同类系基本可以去除C57BL/6 小鼠遗传背景，8代及以上的代数种群小鼠，可基本认为遗传背景一致11。本研究以第11代同窝3周龄基因型鉴定为Balb/C-CAST -/-的雄性小鼠感染CVB3 制作 VMC 小鼠模型，CVB3 模型组 5只小鼠造模均成功，提示该类系小鼠已排除C57BL/6 小鼠遗传背景影响，完全可用于VMC 小鼠模型制作。本研究采用碱性裂解液裂解法提取DNA

24、，所用试剂均为常规化学试剂，不需用蛋白酶K ， DNA 得率较高、成本低廉；不使用酚、氯仿等试剂，不污染环境；不需要匀浆操作，避免交叉污染；鉴定结果与市售商品化DNA 提取及基因型鉴定试剂盒相比，完全一致。此外， 使用碱裂解法提取DNA 能节约大量实验经费，尤其是进行大批量小鼠的基因型鉴定时。本研究室自2012 年起使用该方法对转基因/基因敲除小鼠进行基因型鉴定，取得了稳定、可靠的鉴定结果，证明其是一种高效、低成本的解决方案，完全能够满足后续实验的需要。综上所述，本研究成功建立Balb/C-CAST 基因过表达小鼠，为后续研究奠定了基础；采用的碱性裂解液提取基因组DNA 具有高效、可靠、低成本

25、的特点，值得推广。参考文献1Ono Y, Sorimachi H. Calpains:an elaborate proteolytic systemJ. Biochim Biophys Acta, 2012,1824(1):224-236.2Inserte J, Hernando V, Garcia-Dorado D. Contribution of calpains to myocardial ischaemia/reperfusion injuryJ.Cardiovasc Res, 2012, 96(1):23-31.3 李明辉 ,汪云开,虞勇,陈瑞珍,杨英珍.急性病毒性心肌炎小鼠心肌中C

26、alpain mRNA 表达与心肌细胞凋亡的关系研究.中国分子心脏病学杂志, 2009, 9(5):277-281.4Li X, Li Y, Shan L, et al. Over-expression of calpastatin inhibits calpain activation and attenuates myocardial dysfunction during endotoxaemiaJ. Cardiovasc Res, 2009, 83(1):72-79.5 Campbell RL, Davies PL. Structure-function relationships in c