第二章高效液相色谱法

1、（high performance liquid chromatography HPLC） 目的要求：目的要求：1. 熟悉熟悉HPLC法的基本原理和测试技术。法的基本原理和测试技术。2. 掌握掌握HPLC法色谱条件选择、定性定量分析方法。法色谱条件选择、定性定量分析方法。3. 了解了解HPLC法在中药研究中的应用。法在中药研究中的应用。主要参考书： 第一节第一节 绪绪 论论 高效液相色谱法：高效液相色谱法： 二十世纪六十年代末期，在二十世纪六十年代末期，在经典液相色谱的基础上引入了气相色谱的理论和经典液相色谱的基础上引入了气相色谱的理论和技术，采用高压泵、高效固定相，以及高灵敏度技术，采用高压

2、泵、高效固定相，以及高灵敏度检测器发展而成的检测器发展而成的分离分析分离分析方法。方法。 HPLC和经典和经典LC的主要区别为固定相、输的主要区别为固定相、输液设备和检测手段的差别；和液设备和检测手段的差别；和GC的主要差别为的主要差别为分析对象和流动相的差别，和分析对象和流动相的差别，和GC相同之处在于相同之处在于都具有分离和分析的功能，可以在线检测都具有分离和分析的功能，可以在线检测。1 1经典经典LC：只能做为一种分离手段。只能做为一种分离手段。 常压或低压下输送流动相常压或低压下输送流动相 固定相颗粒粗，粒径固定相颗粒粗，粒径 100m，且不均匀，柱，且不均匀，柱 内径内径13cm，流

3、动相仅靠重力流经色谱柱，溶，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶 质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱效低质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱效低 （H，n），色谱柱不能连续使用），色谱柱不能连续使用 分析周期长分析周期长 无法在线检测无法在线检测 样品用量大，灵敏度低样品用量大，灵敏度低 2 2HPLC：既可分离又可分析手段既可分离又可分析手段高压输送流动相高压输送流动相固定相粒度小且均匀，粒径固定相粒度小且均匀，粒径 流动相极性流动相极性1分离机制：溶质分子与固定相之间诱导力分离机制：溶质分子与固定相之间诱导力和氢键作用力。（相似相溶原则）和氢键作用力。（相似相溶原则）2固定相：极性大的氰基或氨基键合

4、相（含固定相：极性大的氰基或氨基键合相（含水硅胶易流失，现已不用）水硅胶易流失，现已不用）3流动相：极性小流动相：极性小主体为饱和烷烃主体为饱和烷烃 20的有机极性调节剂如醇类的有机极性调节剂如醇类 如：正己烷或庚烷如：正己烷或庚烷 氯仿氯仿-甲醇或氯仿甲醇或氯仿-乙醇乙醇4流动相极性与流动相极性与k的关系：流动相极性的关系：流动相极性P值值，洗脱能力，洗脱能力，组分，组分tR，k，选择，选择P值合适值合适的溶剂，使样品的溶剂，使样品k值在值在110之间之间范围内。范围内。5出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱，极出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱性大的组分后

5、出柱6适用范围：适用范围：u氰基键合相：分离可诱导极化的化合物或极性化合物氰基键合相：分离可诱导极化的化合物或极性化合物 u氨基键合相：分析极性大物质、糖类等氨基键合相：分析极性大物质、糖类等注：注：有很多样品使用氰基柱、氨基柱采用反相系统作为有很多样品使用氰基柱、氨基柱采用反相系统作为流动相，一般以乙腈流动相，一般以乙腈-水作为流动相，但是要求乙腈的水作为流动相，但是要求乙腈的含量一般不得低于含量一般不得低于80%，含水过多的流动相容易使氰，含水过多的流动相容易使氰基、氨基水解基、氨基水解。同时还要注意。同时还要注意“过渡过渡”问题。问题。（二）（二）反相分配色谱（反相分配色谱（RPC）：）

6、： 固定相极性固定相极性 流动相极性流动相极性 1分离机制：疏溶剂理论分离机制：疏溶剂理论 当非极性溶质或溶质分子中的非极性部当非极性溶质或溶质分子中的非极性部分进入到极性流动相中时，由于疏溶剂效应，分进入到极性流动相中时，由于疏溶剂效应，分子中的非极性部分与极性溶剂分子间产生分子中的非极性部分与极性溶剂分子间产生排斥力，和键合相的烃基产生疏溶剂缔合。排斥力，和键合相的烃基产生疏溶剂缔合。 溶质的保留主要是由于溶质分子与键合溶质的保留主要是由于溶质分子与键合相间的色散力。相间的色散力。 流动相的表面张力流动相的表面张力越高，缔合力越高，缔合力越越强，强，k，组分，组分tR。 若溶质分子有极性官

7、能团存在时，则与若溶质分子有极性官能团存在时，则与极性溶剂间的作用力增强，而不利于缔合，极性溶剂间的作用力增强，而不利于缔合，k，组分，组分tR。 2固定相：极性小的烷基键合相固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，柱，C18柱（柱（ODS柱柱典型的反相键典型的反相键合相，应用最广）合相，应用最广） 3流动相：极性大流动相：极性大 主体为水或无机盐缓冲溶液主体为水或无机盐缓冲溶液 + 有机极性调节剂有机极性调节剂 例：例： 水水 + 甲醇或乙腈或四氢呋喃甲醇或乙腈或四氢呋喃 4流动相极性与流动相极性与k的关系：的关系： 随有机极性调节剂的加入，流动相极性随有机极性调节剂的加入，流动相极性减小减小，

8、洗脱能力强度，洗脱能力强度，k减小，组分减小，组分tR减少。减少。 流动相流动相P值的选择与优化，使样品值的选择与优化，使样品k值在值在110之间之间范围内有很好的分离。采用梯度洗脱可获得较好范围内有很好的分离。采用梯度洗脱可获得较好的分离。的分离。 加入适当的酸或碱来控制流动相的加入适当的酸或碱来控制流动相的pH值，加入值，加入量一般为量一般为0.050.5，可防止色谱峰拖，可防止色谱峰拖尾。尾。 5出柱顺序：极性大的组分先出柱出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱极性小的组分后出柱6适用范围：非极性适用范围：非极性中等极性组分中等极性组分（80%的有机化合物可用的有机化合物可用H

9、PLC测定）测定） 二、吸附色谱，二、吸附色谱，又称液固吸附色谱（又称液固吸附色谱（LSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂流动相为液体，固定相为固体吸附剂1分离机制：是根据被分离组分的分子与流分离机制：是根据被分离组分的分子与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，靠溶质分动相分子争夺吸附剂表面活性中心，靠溶质分子的吸附系数的差别而分离。子的吸附系数的差别而分离。 分离前提：分离前提：K K不等或不等或k k不等不等溶质分子极性溶质分子极性，kk，t tR R，不易被洗脱，不易被洗脱2固定相：固定相：YWG和和YQG 与与LC相比，固定相粒径不同，相比，固定相粒径不同，10m3流动相：常采用二元

10、混合溶剂流动相：常采用二元混合溶剂 烷烃烷烃 + 有机极性调节剂有机极性调节剂 ， n 例：例： 正己烷或庚烷正己烷或庚烷 + 氯仿氯仿- - - 流动相选择原则：大大，小小流动相选择原则：大大，小小 的关系的关系 溶剂极性用溶剂极性用溶剂强度参数溶剂强度参数0值表示，值表示， 0，洗脱能力，洗脱能力，k值值 ，tR； 0 ，洗脱，洗脱能力能力，k值值 ，t tR R 。 溶剂的优化，溶剂的优化，选择性选择性的改变，在溶剂强度参的改变，在溶剂强度参数数0值不变下进行。值不变下进行。 可通过薄层色谱作为先导试验，来确定吸附可通过薄层色谱作为先导试验，来确定吸附色谱的最优分离条件。色谱的最优分离条

11、件。 在理想条件下，薄层色谱在理想条件下，薄层色谱的的Rf值与值与HPLC的容的容 量因子量因子k有如下关系：有如下关系：4出柱顺序：强极性组分后出柱出柱顺序：强极性组分后出柱 弱极性组分先出柱弱极性组分先出柱5. 适用范围：分离相对分子质量中等的脂溶性样适用范围：分离相对分子质量中等的脂溶性样品，特别适宜分离异构体。品，特别适宜分离异构体。RfRfRf)Rf)(1(1k k 三、离子交换色谱（三、离子交换色谱（IEC） 1分离机制：是以离子交换剂为固定相，用缓分离机制：是以离子交换剂为固定相，用缓冲液为流动相，根据选择性差别而分离。冲液为流动相，根据选择性差别而分离。 2固定相：键合离子交换

12、剂固定相：键合离子交换剂 u 阳离子交换剂：强酸性磺酸型（阳离子交换剂：强酸性磺酸型（-SO3H）键合相）键合相分离阳离子化合物分离阳离子化合物 u 阴离子交换剂：强碱性季铵盐（阴离子交换剂：强碱性季铵盐（-NR3Cl）键合相）键合相分离阴离子化合物分离阴离子化合物 3流动相：流动相： 缓冲溶液缓冲溶液 + 适量有机极性调节剂如甲醇、适量有机极性调节剂如甲醇、乙腈或四氢呋喃乙腈或四氢呋喃 降低保留，改变选择降低保留，改变选择性。性。 4. 盐或缓冲剂类型的影响：不同的流动盐或缓冲剂类型的影响：不同的流动相离子在离子交换柱上的保留不同，因相离子在离子交换柱上的保留不同，因而对样品离子的置换强度不

13、同。而对样品离子的置换强度不同。u在阴离子交换色谱中，各种反离子的相对强度为在阴离子交换色谱中，各种反离子的相对强度为: F-OH-Ac-Cl-SCN-Br-CrO4-NO3-I-C2O42-（草酸根）（草酸根）SO42-C6H5O73-（枸橼酸根）（枸橼酸根）u在阳离子交换色谱中，各种反离子的相对强度为在阳离子交换色谱中，各种反离子的相对强度为:Li+H+Na+NH4+K+Rb+Cs+Ag+Mg2+Zn2+Co2+ Cu2+Cd2+ Ni2+Ca2+Pb2+其其pKa两两个单位个单位u对于碱性化合物的分离，对于碱性化合物的分离，pH应应其其pKb两两个单位个单位5. 影响影响k的因素：的因素

14、：u同反相色谱，与物质的极性有关同反相色谱，与物质的极性有关u与与R的链长有关：的链长有关：R长，极性长，极性小，小，tR，k 6. 离子对试剂的选择：离子对试剂的选择： 烷基磺酸钠烷基磺酸钠 分析碱分析碱 四烷基季胺盐四烷基季胺盐 分析酸分析酸7. 适用范围：主要用于较强适用范围：主要用于较强的有机酸、碱的分析。的有机酸、碱的分析。六、尺寸排阻色谱（六、尺寸排阻色谱（SEC） 又称凝胶色谱，或者分子排阻色谱。又称凝胶色谱，或者分子排阻色谱。SEC是获得聚合物分子量及其分布的基本是获得聚合物分子量及其分布的基本方法。方法。1. 分离机制：分离机制： 利用被分离物质分子大小的不同导致利用被分离物

15、质分子大小的不同导致在填料上渗透程度的不同而使组分分离。在填料上渗透程度的不同而使组分分离。2. 固定相：分子筛、葡聚糖凝胶、微孔固定相：分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等3. 流动相：四氢呋喃、流动相：四氢呋喃、N、N二甲基二甲基甲酰胺、邻二氯苯、间苯酚、缓冲液等。甲酰胺、邻二氯苯、间苯酚、缓冲液等。 选择原则：要能很好溶解样品，黏度选择原则：要能很好溶解样品，黏度要低，且和柱填料匹配。要低，且和柱填料匹配。 4出柱顺序：样品在两相的分配取决于填出柱顺序：样品在两相的分配取决于填料对分子中心提供的容积，这个容积越大，料对分子中心提供的容积，这个容积越

16、大，保留也越大保留也越大 u大分子因尺寸大不能进入柱填料先出柱大分子因尺寸大不能进入柱填料先出柱u小分子能进入填料孔的网络，因而消耗部小分子能进入填料孔的网络，因而消耗部分时间在固定相中后出柱分时间在固定相中后出柱 5适用范围：适用范围：SEC是一种低分辨的是一种低分辨的LC，因为，因为所有的色谱峰都在一个狭窄的保留范围内洗脱完所有的色谱峰都在一个狭窄的保留范围内洗脱完毕，主要用于：毕，主要用于：u复杂样品的预分离复杂样品的预分离u聚合物的分子量及分布测定，如蛋白、多糖聚合物的分子量及分布测定，如蛋白、多糖u分析纯分析纯 化蛋白，检查二聚体、三聚体或其化蛋白，检查二聚体、三聚体或其它聚体它聚体

17、 第五节第五节 化学键合固定相化学键合固定相 固定相（或称填充剂、填料）是保证色谱柱高柱效和固定相（或称填充剂、填料）是保证色谱柱高柱效和高分离的关键。高分离的关键。化学键合固定相化学键合固定相是将各种不同的有机官能是将各种不同的有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶（载体）表面的游离羟基团通过化学反应共价键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上生成而得的。上生成而得的。 化学键合相的制备化学键合相的制备: 广泛使用全多孔或薄壳型微粒硅广泛使用全多孔或薄壳型微粒硅胶作为载体（胶作为载体（球形球形YQG 310m ，或者堆积硅珠，或者堆积硅珠 YQG 35 m ），），主要键合方法形成硅氧硅碳键型主要键

18、合方法形成硅氧硅碳键型。 键合固定相的性质键合固定相的性质 在实际应用中，键合固定相的键合完全程度和使用的重复性具有在实际应用中，键合固定相的键合完全程度和使用的重复性具有重要性。可用一些参数表示：重要性。可用一些参数表示：（1）表面键合官能团的浓度）表面键合官能团的浓度SMmBm-1g载体上键合有机官能团的质量（ug）M-有机官能团的摩尔质量(g/mol)S-载体的表面积（m2/g)文献报道的此值约为2-4umol/m2（2）表面碳覆盖率表面碳覆盖率61012%/)(MNmCWCNc-键合的有机官能团的碳数对于商品键合相，碳含量约为2%-50%之间变化3 . 81002. 6/105%/17

19、18BBOHBB（3）有机官能团的表面覆盖率（度有机官能团的表面覆盖率（度)OH =5个/nm21m2 =1018 nm26.02 1017是以umol为单位的阿伏伽德罗常数即单位面积上已键合的有机官能团的量与可反应的硅醇基的量之比。化学键合固定相的特点：化学键合固定相的特点： 1. 消除了担体上的表面活性作用点，缓和了复杂样品在固定消除了担体上的表面活性作用点，缓和了复杂样品在固定相表面上的不可逆化学吸附，峰形对称；对溶剂中微量水相表面上的不可逆化学吸附，峰形对称；对溶剂中微量水分含量的变化要求不苛刻分含量的变化要求不苛刻（取代液-固吸附色谱）。）。2. 耐溶剂冲洗，使用过程中固定相不流失耐

20、溶剂冲洗，使用过程中固定相不流失（取代传统的液-液分配色谱）。）。3. 热稳定性好热稳定性好（氧化锆和聚合物等热稳性色谱填料）。4. 表面改性灵活，容易获得重复性产品。表面改性灵活，容易获得重复性产品。5. 载样量大载样量大（比普通硅胶约高一个数量级）；溶剂的残留效应小，；溶剂的残留效应小，梯度洗脱平衡快。梯度洗脱平衡快。如应用最广的十八烷基键合相（如应用最广的十八烷基键合相（ODS或或C18）：）： Si-OH + Cl-Si(R2)-C18H37 Si-O-Si(R2)-C18H37 HClHCl 影响溶质保留行为的因素影响溶质保留行为的因素:当烷基键合相表面键合的碳链长度越长，对溶质当烷

21、基键合相表面键合的碳链长度越长，对溶质k， tR,载样量载样量大，如大，如C18C8有机官能团的表面覆盖率越大，对溶质有机官能团的表面覆盖率越大，对溶质k，tR。 表面覆盖度表面覆盖度，分配作用，分配作用，吸附作用，吸附作用 封尾键合相封尾键合相，没有吸附作用，为强疏水性没有吸附作用，为强疏水性硅胶表面残留的硅醇基对碱性化合物产生吸附效应，引硅胶表面残留的硅醇基对碱性化合物产生吸附效应，引起色谱峰拖尾或不对称，影响色谱柱的稳定性和保留值起色谱峰拖尾或不对称，影响色谱柱的稳定性和保留值的重复性。的重复性。氨基、氰基、醚基键合相作为正相色谱，主要是以氢键力与溶质相氨基、氰基、醚基键合相作为正相色谱

22、，主要是以氢键力与溶质相互作用，氢键力大小顺序为氨基氰基醚基。互作用，氢键力大小顺序为氨基氰基醚基。氨基键合相兼有质子接受体和给予体的双重性能，具有强极性，对氨基键合相兼有质子接受体和给予体的双重性能，具有强极性，对极性大物质极性大物质k。具有碱性，可在酸性水溶液中作为弱阴离子交换剂，。具有碱性，可在酸性水溶液中作为弱阴离子交换剂，用于分离酚、羧酸、核苷酸。氨基用作反相固定相可与糖分子中的用于分离酚、羧酸、核苷酸。氨基用作反相固定相可与糖分子中的羟基作用，广泛用于单糖、双糖及多糖的分离。（羟基作用，广泛用于单糖、双糖及多糖的分离。（注意：一级胺可注意：一级胺可与醛、酮的羰基反应生成席夫碱，因此

23、不能用氨基柱分析含羰基的与醛、酮的羰基反应生成席夫碱，因此不能用氨基柱分析含羰基的化合物如甾酮、还原糖等，且流动相中也不能含有羰基化合物如丙化合物如甾酮、还原糖等，且流动相中也不能含有羰基化合物如丙酮酮）氰基键合相为质子接受体，具有中等极性，分离选择性与硅胶相似，氰基键合相为质子接受体，具有中等极性，分离选择性与硅胶相似，所分离的物质也相似，但相同流动相条件下比硅胶的保留值低。对所分离的物质也相似，但相同流动相条件下比硅胶的保留值低。对酸性、碱性样品可获得对称的色谱峰。对含双键的异构体或双键环酸性、碱性样品可获得对称的色谱峰。对含双键的异构体或双键环状化合物具有良好的分离能力。对溶质的状化合物

24、具有良好的分离能力。对溶质的 k 比氨基键合相小。比氨基键合相小。 使用化学键合相应注意的问题使用化学键合相应注意的问题:1、硅胶键合相的稳定性、硅胶键合相的稳定性u有机官能团在硅胶表面的覆盖程度，覆盖量大或呈多分有机官能团在硅胶表面的覆盖程度，覆盖量大或呈多分子覆盖，稳定性增加。反相键合相正相键合相。子覆盖，稳定性增加。反相键合相正相键合相。u流动相的流动相的pH值影响，通常值影响，通常pH应保持在应保持在28，pH 8.5会会引起载体硅胶的溶解，引起载体硅胶的溶解，pH1.0，键合的硅烷会被水解从，键合的硅烷会被水解从柱中洗脱下来。柱中洗脱下来。2、减小残留硅醇基对色谱峰分离的不良影响（见

25、第六节）、减小残留硅醇基对色谱峰分离的不良影响（见第六节）3、键合相色谱分离的重现性、键合相色谱分离的重现性 同一种类型的键合相，由于生产厂家不同一种类型的键合相，由于生产厂家不同，或生产批号不同，而表现出不同的色谱分同，或生产批号不同，而表现出不同的色谱分离特性，是因为键合相制备过程中选用载体硅离特性，是因为键合相制备过程中选用载体硅胶特性的差别，以及有机官能团覆盖量的不胶特性的差别，以及有机官能团覆盖量的不同，产生的同，产生的“载体诱导选择性的变化载体诱导选择性的变化”而致。而致。4、键合相色谱柱的再生、键合相色谱柱的再生化学键合相填料新进展化学键合相填料新进展:空间保护键合固定相：空间保

26、护键合固定相：在C18烷基侧链引入较大的官能团及立体效应，如异丙基或二丁基，可阻碍硅醇基与分析物的相互作用，保护Si-O键，防止低pH值条件下的水解作用发生，提高稳定性和延长使用寿命。（如Agilengt SB-C18、 SB-Phenyl、 SB-CN等）双齿键合固定相：双齿键合固定相：这种固定相的每个硅烷化试剂分子中含有两个硅原子，每个硅原子含有一个长链硅烷基官能团，两个硅原子之间以-O-或-CH2- CH2-等基团相连，无论在低pH值还是在高pH值条件下均显示较高的稳定性和良好的色谱分离特性，可有效防止硅胶载体在高pH时的溶解。（如Agilengt Extend-C18，耐受pH达11.

27、5，特别适合分离游离的强碱性化合物）内嵌极性基团键合固定相：内嵌极性基团键合固定相：常见的内嵌极性官能团有氨基甲酸酯、脲基、氨基、醚基、磺胺基等。这种技术可改善固定相和水溶液的兼容能力（甚至100%水流动相），提高水润湿性，适宜分离极性化合物，还防止碱性化合物与硅胶表面残留硅醇基的作用，减少拖尾。烷基胺烷基酰胺烷基季胺氨基甲酸酯如Waters的Symmetry Shield RP色谱柱：内嵌氨基甲酸酯，可阻止疏水塌陷现象发生；Agilengt Zorbax Bonus-RP：内嵌酰胺基团，三封端 ，二异丙基立体保护，分离极性化合物峰形好，避免酸水解延长柱寿命；Phenomenex的Synerg

28、i Fusion-RP极性内嵌C18柱：采用极性嵌合及疏水链达到双相选择性，特别适用于分析含有极性和非极性化合物的混合物。化学键合相填料新进展化学键合相填料新进展:硅碳杂化硅胶：硅碳杂化硅胶： Waters公司发明的一种“杂交颗粒技术”，制成Xterra色谱柱填料（甲基聚乙氧基硅胶全多孔球形填料），发挥了硅胶与聚合物基质填料在分离速度、分离度、pH选择性，柱寿命及上样量的强大优势。如：Xterra MS C18或C8：峰形尖锐，三齿键合，柱寿命长，耐受pH1-12； Xterra RP 18或RP8：对碱性化合物峰形最佳，屏蔽技术（内嵌极性基团），可承受100%水溶液流动相，耐受pH2-12；

29、 Xterra Phenyl：对所有化合物峰形优异，双齿键合，耐受pH1-12，特别适合于分离带有芳香环的化合物。苯基丙胺键合固定相（苯基丙胺键合固定相（PhA-silica）：）： PhA-silica分子中含有仲胺基、苯环以及烷烃链。尤其适合于分离酚类化合物。以氧化锆为基质的键合固定相：以氧化锆为基质的键合固定相：商品化的色谱柱有Supelco公司的Discovery Zr系列色谱柱。 优点：与硅胶和氧化铝相比，氧化锆耐酸碱稳定性好（pH可达1-14），热稳定性好，对离子型化合物有独特的选择性，对碱性化合物显示高度的峰对称性； 与聚合物填料相比，当温度、离子强度、有机溶剂浓度等条件改变时，

30、氧化锆有不溶胀、不收缩，机械强度高等优点。如Discovery Zr-Carbon C18色谱柱，适合于分离酸、碱和中性化合物，防止固定相水解， pH1-14，耐受温度100。第六节第六节 流流 动动 相相 一、一、HPLC分析流动相选择的一般要求分析流动相选择的一般要求 1. 化学惰性好，用作流动相的溶剂应与固定相不互溶，化学惰性好，用作流动相的溶剂应与固定相不互溶， 并能保持色谱柱的稳定性；所用溶剂应有高纯度，以并能保持色谱柱的稳定性；所用溶剂应有高纯度，以 防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。 2. 选用的溶剂性能应与所使用的检测器相匹

31、配。选用的溶剂性能应与所使用的检测器相匹配。 3. 溶剂对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏度，溶剂对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏度， 同时避免在柱头产生沉淀。同时避免在柱头产生沉淀。 4. 选择的溶剂应具有低的黏度和适当低的沸点。选择的溶剂应具有低的黏度和适当低的沸点。 5. 应尽量避免使用具有显著毒性的溶剂，以保证操作人应尽量避免使用具有显著毒性的溶剂，以保证操作人 员的安全。员的安全。 二、表征溶剂特性的重要参数二、表征溶剂特性的重要参数 （一）溶剂强度参数（一）溶剂强度参数0 由由Snyder提出的，表示溶剂的洗脱强度，提出的，表示溶剂的洗脱强度，即溶剂分子在即溶剂分子在

32、单位吸附剂表面积单位吸附剂表面积A上的上的吸附自由能吸附自由能Ea，表征了溶剂分子对，表征了溶剂分子对吸附剂的亲和程度吸附剂的亲和程度。（液固色谱常用）（液固色谱常用） 对对Al2O3吸附剂，吸附剂， 0（ Al2O3）= Ea/A并规定戊烷在并规定戊烷在Al2O3吸附剂上的吸附剂上的0（ Al2O3）= 0对硅胶吸附剂，对硅胶吸附剂， 0（ SiO2）= 0.77 0（ Al2O3） 0 数值越大，表明溶剂与吸附剂的亲和能力越强，越数值越大，表明溶剂与吸附剂的亲和能力越强，越容易从吸附剂上将被吸附的溶质洗脱下来，使溶质容易从吸附剂上将被吸附的溶质洗脱下来，使溶质k 。 在液固色谱中需采用二元

33、混合溶剂体系来提高分离的在液固色谱中需采用二元混合溶剂体系来提高分离的选择性，由选择性，由A、B构成的二元混合溶剂的溶剂强度参数构成的二元混合溶剂的溶剂强度参数用下式计算：用下式计算： 选择适当的选择适当的0值，使被分析样品中组分的容量因子值，使被分析样品中组分的容量因子k值保持在值保持在110之间。溶剂的优化，选择性之间。溶剂的优化，选择性的改变的改变，在溶剂强度参数，在溶剂强度参数0值不变下进行值不变下进行。BBnBAABnNNABB)1 (10lg)(0000kknR114NB-溶剂B的摩尔分数nB-吸附剂吸附一个B分子所占的面积， 假设nB = nA-吸附剂的活性，在0.61.0，表示

34、吸 附剂表面未被水分子覆盖的硅羟基的多少 （二）溶解度参数（二）溶解度参数 由由Hilderbrand提出，提出，液液色谱中常用溶解度参数液液色谱中常用溶解度参数表示溶剂的表示溶剂的极性，极性，是从分子间作用力角度来考虑。表示是从分子间作用力角度来考虑。表示1mol理想气体冷却转变成理想气体冷却转变成液体时所释放的凝聚能液体时所释放的凝聚能Ec与液体摩尔体积与液体摩尔体积Vm比值的平方根：比值的平方根： 溶解度参数溶解度参数是溶剂与溶质分子间作用力的总量度，是分子间存是溶剂与溶质分子间作用力的总量度，是分子间存在的在的4种作用力的总和：种作用力的总和： )2321mJVEmc（单位为haodd

35、 色散溶解度参数，是溶剂和溶质分子间色散力相互作用能力的量度。o 偶极取向溶解度参数，是溶剂和溶质分子间偶极取向相互作用能力的量度。a 接受质子溶解度参数，是溶剂作为质子接受体与溶质相互作用能力的量度。h 给予质子溶解度参数，是溶剂作为质子给予体与溶质相互作用能力的量度。 在正相色谱中，在正相色谱中，溶剂的溶剂的值值，其洗脱强度，其洗脱强度，会使溶质，会使溶质在固定相的容量因子在固定相的容量因子k值值；在反相色谱中，在反相色谱中，溶剂的溶剂的值值，其洗脱强度其洗脱强度，会使溶质在固定相的容量因子，会使溶质在固定相的容量因子k值值。 色谱分析中在确定了选用溶剂的色谱分析中在确定了选用溶剂的值，使

36、溶质的容量因值，使溶质的容量因子子k值保持在值保持在110之间后，可通过选用之间后，可通过选用值相近，但值相近，但d、o、a、h不同的另一种溶剂来改善分离的选择性。不同的另一种溶剂来改善分离的选择性。 对于多元混合溶剂的溶解度参数：对于多元混合溶剂的溶解度参数：积分数和溶解度参数。分别为每种纯溶剂的体和iiiniimix1 （三）极性参数（三）极性参数P（又叫极性指数）（又叫极性指数） 由由Snyder使用溶解度数据推导出来，表示每种溶剂与使用溶解度数据推导出来，表示每种溶剂与乙醇（乙醇（e）、对二氧六环（）、对二氧六环（d）和硝基甲烷（）和硝基甲烷（n）三种极性）三种极性物质相互作用的量度。

37、并将物质相互作用的量度。并将Rohrschneider 提供的极性分提供的极性分配系数配系数 以对数形式表示，以对数形式表示，忽略了色散力的影响推导：忽略了色散力的影响推导： 式中，用乙醇、对二氧六烷和硝基甲烷三种标准物质式中，用乙醇、对二氧六烷和硝基甲烷三种标准物质表达每种溶剂的接受质子、给予质子和偶极作用的能力，表达每种溶剂的接受质子、给予质子和偶极作用的能力， P既表示了每种溶剂洗脱强度的大小，又能反应每种既表示了每种溶剂洗脱强度的大小，又能反应每种溶剂的选择性。溶剂的选择性。ngdgegKKK)lg()lg()lg( gK 在分配色谱中，样品组分在固定相和流动相中的溶解度在分配色谱中，

38、样品组分在固定相和流动相中的溶解度是决定其容量因子是决定其容量因子k值的关键因素，值的关键因素，P值可作为判定溶剂洗值可作为判定溶剂洗脱强度的依据，通过改变洗脱溶剂的脱强度的依据，通过改变洗脱溶剂的P值改变分离的选择值改变分离的选择性性 ：正相色谱中正相色谱中，P值值，洗脱强度，洗脱强度，被洗脱溶质，被洗脱溶质k ；反相色谱中，反相色谱中，P值值，洗脱强度，洗脱强度，被洗脱溶质，被洗脱溶质k 。 对于多元混合溶剂的极性参数值：对于多元混合溶剂的极性参数值：积分数和极性参数分别为每种纯溶剂的体和iiiniimix1 /)lg(egeKx 反映了溶剂作为质子接受体的能力（与a 相当） /)lg(d

39、gdKx 反映了溶剂作为质子给予体的能力（与h 相当） /)lg(ngnKx 反映了溶剂作为强偶极子之间相互作用的能力（与o 相当） 1. 溶剂的选择性分组溶剂的选择性分组Snyder规定了每种溶剂的选择性参数：规定了每种溶剂的选择性参数： 当将每种溶剂的三种当将每种溶剂的三种x xe e、x xd d和和x xn n值组成一个三角形坐值组成一个三角形坐标时，就可以发现选择性相似的溶剂分布在三角形平面中标时，就可以发现选择性相似的溶剂分布在三角形平面中的一定区域，从而构成选择性不同的溶剂分组。如下图：的一定区域，从而构成选择性不同的溶剂分组。如下图： 同一组溶剂在分离中具有相似的选择性，不同组

40、别的同一组溶剂在分离中具有相似的选择性，不同组别的溶剂，其选择性差别较大。采用不同组别的溶剂，可显著溶剂，其选择性差别较大。采用不同组别的溶剂，可显著改变溶剂的选择性。改变溶剂的选择性。表表 溶剂的选择性分组溶剂的选择性分组 2. 选择流动相的一般原则选择流动相的一般原则 在正相色谱中在正相色谱中，流动相的主体为己烷（或庚烷），为流动相的主体为己烷（或庚烷），为改善分离的选择性，常加入的优化溶剂为质子接受体乙醚改善分离的选择性，常加入的优化溶剂为质子接受体乙醚或甲基叔丁基醚（第或甲基叔丁基醚（第组）、质子给予体氯仿（第组）、质子给予体氯仿（第组）组）、偶极溶剂二氯甲烷（第、偶极溶剂二氯甲烷（第

41、组）。组）。 在反相色谱中在反相色谱中，流动相主体流动相主体为水，为改善分离的选择性，常为水，为改善分离的选择性，常加入的优化溶剂为质子接受体加入的优化溶剂为质子接受体甲醇（第甲醇（第组）组） 、质子给予体、质子给予体乙腈（第乙腈（第b组）、偶极溶剂四组）、偶极溶剂四氢呋喃（第氢呋喃（第组）。组）。 在分配色谱中常采用二元混合溶剂作为流动相，混合在分配色谱中常采用二元混合溶剂作为流动相，混合溶剂的极性参数：溶剂的极性参数： PAB APA BPB如：如：40%甲醇甲醇-水溶液的极性参数为：水溶液的极性参数为： PAB=0.45.1+0.610.2=8.160 46%乙腈乙腈-水溶液的极性参数为

42、：水溶液的极性参数为： PAB=0.465.8+0.5410.2=8.176 33%四氢呋喃四氢呋喃-水溶液的极性参数为：水溶液的极性参数为： PAB=0.334.0+0.6710.2=8.154 在反相分配色谱分析中，对于同一被测溶质，一般在反相分配色谱分析中，对于同一被测溶质，一般可利用以下可利用以下规律规律：当流动相中优选溶剂（或称改性剂）当流动相中优选溶剂（或称改性剂）部分改变部分改变10%，则溶质的容量因子，则溶质的容量因子k值将变化值将变化2倍，溶质倍，溶质的保留时间的保留时间tR将变化将变化3倍倍，以此可粗略预测分离实验的最，以此可粗略预测分离实验的最终结果。终结果。3. 改善色

43、谱分离选择性的方法改善色谱分离选择性的方法（1）调节流动相极性）调节流动相极性P值，目的是使样品组分的容量，值，目的是使样品组分的容量， 因子因子1 k 10 ，在P值不变的前提下，优选溶剂，值不变的前提下，优选溶剂，改善分离的选择性。改善分离的选择性。对正相色谱，对正相色谱，k值与值与P值有如下关系为值有如下关系为 对反相色谱，对反相色谱， k值与值与P值有如下关系为值有如下关系为 P值改变值改变2个单位，个单位，k就改变就改变10倍倍 2/122110PPkk2/121210PPkk 对正相色谱中，对正相色谱中，初始流动相为正己烷初始流动相为正己烷H/A混合溶剂，混合溶剂， 在在PHA下，

44、有较好下，有较好k值（值（110之间），为改善分离选之间），为改善分离选择性，用择性，用B代替代替A，重新组成，重新组成H/B混合流动相，以达到较混合流动相，以达到较好的分离效果，则：好的分离效果，则： HPH APA HPH BPB由于PH1，可近似认为，可近似认为 APA BPB BAAB 对反相色谱中，对反相色谱中，初始流动相为水初始流动相为水R/M混合溶剂，在混合溶剂，在PRM下，有较好下，有较好k值（值（110之间），为改善分离选择之间），为改善分离选择性，用性，用T代替代替M，重新组成，重新组成R/T混合流动相，以达到较好混合流动相，以达到较好的分离效果，则：的分离效果，则： RP

45、R MPM RPR TPT （1-M） PR MPM （1-T）PR TPT TRMRMT（2 2）向流动相中加入改性剂）向流动相中加入改性剂 离子抑制法离子抑制法 在反相色谱中常向含水流动相中加入酸、碱或缓在反相色谱中常向含水流动相中加入酸、碱或缓冲溶液，以使流动相的冲溶液，以使流动相的pH值控制一定数值，抑制溶质的离子化，值控制一定数值，抑制溶质的离子化，减少谱带拖尾、改善峰形，提高分离的选择性。如分析有机弱酸，减少谱带拖尾、改善峰形，提高分离的选择性。如分析有机弱酸，常加常加1%左右的甲酸或乙酸、磷酸等，获得对称峰；分析弱碱样左右的甲酸或乙酸、磷酸等，获得对称峰；分析弱碱样品，常加品，常

46、加1%左右的三乙胺，改善峰拖尾。左右的三乙胺，改善峰拖尾。 离子强度调节法离子强度调节法 在反相色谱中，分析易解离的碱性有机物时，在反相色谱中，分析易解离的碱性有机物时，随流动相随流动相pH值的增加，键合相残留硅醇基与碱的阴离子亲和力值的增加，键合相残留硅醇基与碱的阴离子亲和力增加，峰拖尾，加入增加，峰拖尾，加入0.11%的乙酸盐或硫酸盐、硼酸盐，利用的乙酸盐或硫酸盐、硼酸盐，利用盐效应减弱残留硅醇基的影响，可改善分离效果。盐效应减弱残留硅醇基的影响，可改善分离效果。但应注意磷酸但应注意磷酸盐或卤化物的经常使用会引起硅烷化固定相降解。盐或卤化物的经常使用会引起硅烷化固定相降解。 4. 多元混合

47、溶剂的多重选择性多元混合溶剂的多重选择性 溶剂选择性三角形不仅可表示各种溶剂的选择性分组，溶剂选择性三角形不仅可表示各种溶剂的选择性分组，还可用来表达多元混合溶剂的多重选择性。（反相色谱）还可用来表达多元混合溶剂的多重选择性。（反相色谱）A点：点：即即的组成为的组成为40%甲醇甲醇-水水 溶液，溶液， P=8.160B点：点：即即的组成为的组成为46%乙腈乙腈-水水 溶液，溶液， P=8.176C点：点：即即的组成为的组成为33%四氢呋四氢呋 喃喃-水溶液，水溶液，P=8.154 上述三个顶点的二元混合溶剂上述三个顶点的二元混合溶剂流动相可对某一确定的分离任务，流动相可对某一确定的分离任务，提

48、供各不相同的分离选择性。提供各不相同的分离选择性。 三角形三角形ABC的三个边的三个边AB、BC、CA上的任何一点，都上的任何一点，都可组成三元混合溶剂流动相。如在可组成三元混合溶剂流动相。如在AB边的中间点边的中间点，其溶，其溶剂的体积分数剂的体积分数0.5/0.5/0对应于对应于A、B、C三个顶点的组成，三个顶点的组成，即即甲醇甲醇：乙腈乙腈：四氢呋喃四氢呋喃=0.5：0.5：0，点不含四氢呋点不含四氢呋喃，但仍然含有水，在此点：喃，但仍然含有水，在此点： 甲醇的体积分数为甲醇的体积分数为40%0.5=20% 乙腈的体积分数为乙腈的体积分数为46%0.5=23% 点构成的三元混合溶剂的组成

49、为：点构成的三元混合溶剂的组成为： 甲醇甲醇：乙腈乙腈：水水=20：23：57同理可知：同理可知：BC边中间点边中间点构成的三元混合溶剂的组成为：构成的三元混合溶剂的组成为： 乙腈乙腈：四氢呋喃四氢呋喃：水水=23：16.5：60.5CA边中间点边中间点构成的三元混合溶剂的组成为：构成的三元混合溶剂的组成为： 四氢呋喃四氢呋喃：甲醇甲醇：水水=16.5：20：63.5 三角形三角形ABC以内的任何一点，都可组成四元混合以内的任何一点，都可组成四元混合 溶剂流动相。如在三角形内溶剂流动相。如在三角形内，其溶剂的体积分数，其溶剂的体积分数0.33/0.33/0.33对应于对应于A、B、C三个顶点的

50、组成，三个顶点的组成，即即甲醇甲醇：乙腈乙腈：四氢呋喃四氢呋喃=0.33：0.33：0.33，点还含点还含有水，在此点：有水，在此点： 甲醇的体积分数为甲醇的体积分数为40%0.33=13.2% 乙腈的体积分数为乙腈的体积分数为46%0.33=15.2% 四氢呋喃的体积分数为四氢呋喃的体积分数为33%0.33=10.9%点构成的四元混合溶剂的组成为：点构成的四元混合溶剂的组成为： 甲醇甲醇：乙腈乙腈： 四氢呋喃四氢呋喃： 水水=13.2：15.2：10.9：60.7同理可知：同理可知：点点构成的四元混合溶剂的组成为：构成的四元混合溶剂的组成为： 甲醇甲醇：乙腈乙腈： 四氢呋喃四氢呋喃： 水水=

51、26.8：7.4：5.3：60.5 点构成的四元混合溶剂的组成为：点构成的四元混合溶剂的组成为： 甲醇甲醇：乙腈乙腈： 四氢呋喃四氢呋喃： 水水=6.4：30.8：5.3：57.5点构成的四元混合溶剂的组成为：点构成的四元混合溶剂的组成为： 甲醇甲醇：乙腈乙腈： 四氢呋喃四氢呋喃： 水水=6.4：7.4：22.1：64.1 所以，在溶剂选择性三角形所以，在溶剂选择性三角形ABC的的任何一点，都对应一种具有确定组成的混任何一点，都对应一种具有确定组成的混合溶剂流动相，就某一确定的分离任务，合溶剂流动相，就某一确定的分离任务，都可提供一个特定的分离选择性，实现分都可提供一个特定的分离选择性，实现分

52、离所需的最优化的流动相组成。离所需的最优化的流动相组成。（四）黏度（四）黏度（） 在高效液相色谱分析中，溶剂的黏度是影响色谱分离在高效液相色谱分析中，溶剂的黏度是影响色谱分离的重要参数，的重要参数， 当溶剂当溶剂时，会降低溶质在流动相中的扩时，会降低溶质在流动相中的扩散系数和在两相间传质速度，并降低了柱子的渗透性，导散系数和在两相间传质速度，并降低了柱子的渗透性，导致柱效致柱效 ，tR。采用混合溶剂。采用混合溶剂 ， ，传质速率，传质速率，H ，柱效，柱效 。 当两种黏度不同的溶当两种黏度不同的溶剂混合时，其黏度变化不剂混合时，其黏度变化不呈现线性，如图：呈现线性，如图：甲醇甲醇:水水（40:

53、60）时黏度最大。）时黏度最大。 三、流动相三、流动相溶剂的处理溶剂的处理（1）溶剂的纯化）溶剂的纯化（2）流动相的脱气（略）流动相的脱气（略）（3）流动相的过滤（略）流动相的过滤（略）第七节第七节 超高效液相色谱超高效液相色谱 超高效液相色谱超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography，UPLC)，系指一种采用小颗粒填料色，系指一种采用小颗粒填料色谱柱谱柱(粒径为粒径为1.7m)和超高压系统和超高压系统(压力大于压力大于140MPa)的的新型液相色谱技术，柱效达新型液相色谱技术，柱效达20万块万块/m理论塔板数，同时理论塔板数，同时大大缩短分

54、析周期，因此特别适用于微量复杂混合物的大大缩短分析周期，因此特别适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究。分离和高通量研究。（2004年年3月月Waters公司首推）公司首推） 一、一、 UPLC的基本原理的基本原理 UPLC仍保持仍保持HPLC的基本原理，的基本原理， 理论基础为范氏理论基础为范氏方程方程(Van Deemeter) ，如果仅考虑固定相的粒度如果仅考虑固定相的粒度dp对对H的影响，的影响，方程式可简化为：方程式可简化为： A项项 B项项 C项项 由该方程可知，随着色谱柱由该方程可知，随着色谱柱固定相粒度固定相粒度dp的减小，色谱柱的的减小，色谱柱的H也越小，柱效越高，因此，固也

55、越小，柱效越高，因此，固定相粒度是对色谱柱性能产生影定相粒度是对色谱柱性能产生影响的最重要因素。响的最重要因素。ucdubadHpp2/Dp/m 10 5 3.5 2.5 1.7u/(mm/s) 0.79 1.20 1.47 2.78 4.32 不同粒度固定相的色谱柱，都对应有各自的最佳的流不同粒度固定相的色谱柱，都对应有各自的最佳的流动相线流速，填料粒度的减小使动相线流速，填料粒度的减小使H-u曲线中所示的最佳柱曲线中所示的最佳柱效点向更高的流速区方向移动，而且有更宽的线速度范围。效点向更高的流速区方向移动，而且有更宽的线速度范围。所以，降低填料的粒度不但提高柱效，同时也提高速度所以，降低填

56、料的粒度不但提高柱效，同时也提高速度。 （一）一）比比HPLC更高的分离度更高的分离度 ：随着：随着dp的降低，的降低，n值会增值会增加，则加，则R值增加，值增加， 1.7m颗粒提供的柱效比颗粒提供的柱效比5m颗粒提颗粒提高了高了3倍，因此，倍，因此，1.7m颗粒的分离度比颗粒的分离度比5m颗粒提高颗粒提高了了70%。如图示分离能力可用峰容量衡量，。如图示分离能力可用峰容量衡量，UPLC用用1.7m颗粒提高了分离能力，不仅峰容量增加，而且提颗粒提高了分离能力，不仅峰容量增加，而且提高了方法的灵敏度。高了方法的灵敏度。 （二）比（二）比HPLC更高的分析速度更高的分析速度 由于由于UPLC采用采

57、用1.7m颗粒，颗粒，柱长则可以缩短至柱长则可以缩短至5m颗粒的色颗粒的色谱柱的三分之一而保持柱效不谱柱的三分之一而保持柱效不变，而且使分离在高变，而且使分离在高3倍的流速倍的流速下进行，结果使分离时间缩短下进行，结果使分离时间缩短而分离度保持不变。而分离度保持不变。 （三）比（三）比HPLC更高的灵敏度更高的灵敏度 UPLC使用小颗粒填料，获得更高的柱效，使使用小颗粒填料，获得更高的柱效，使色谱峰变得更窄，信噪比色谱峰变得更窄，信噪比(S/N)增大，灵敏度得到增大，灵敏度得到大大的提高，是大大的提高，是HPLC的的3倍。倍。 二、二、UPLC的方法优化的方法优化从普通HPLC方法转换为UPL

58、C方法时，对于延长柱子的寿命来说，增加流动相强度要比提高流速好，因为对于任何柱子，经常在80%最大流速压力下运行都会减少色谱柱的寿命。同时还可以减少溶剂的损耗。 UPLC 一般最大允许进样体积为5ul，一般采用1-3ul。因为过量的强溶剂加到色谱柱头时，色谱峰会分叉，峰形不好。尽量先试用部分定量环进样方式。可减少洗针硬件的磨损和样品颗粒析出的可能性，从而影响仪器的寿命。选择合适的弱洗针液及其用量，防止样品扩散，可以得到更窄的色谱峰形。 三、三、UPLC的应用的应用 UPLC已在中药成分、化学药品、生化药品、化学药品代谢产物及中药代谢产物的分析中得到较好的应用。 例如人参药材的几个皂苷类成分测定

59、，药典标准用HPLC测定需要100min完成检测，而转换为UPLC测定只需要10min左右就能完成检测，等等。虎杖虎杖5个成分：个成分：12min检测检测桂枝5个成分：6min检测制剂8个成分：12min完成检测第八节第八节 高效液相色谱分析方法建立的一般步骤高效液相色谱分析方法建立的一般步骤 一、了解样品的基本情况一、了解样品的基本情况 主要包括样品所含化合物的数目、种类（官能团）、主要包括样品所含化合物的数目、种类（官能团）、分子量、分子量、pKa值、值、UV光谱图以及样品基体的性质（溶光谱图以及样品基体的性质（溶剂、填充物等）、化合物在有关样品中的浓度范围、样品剂、填充物等）、化合物在有

60、关样品中的浓度范围、样品的溶解度等。的溶解度等。二、明确分离目的二、明确分离目的（1 1）主要目的是分析还是制备样品组分？）主要目的是分析还是制备样品组分？（2 2）是否已知样品所有成分的化学特性，或是否需做定性分析？）是否已知样品所有成分的化学特性，或是否需做定性分析？（3 3）是否有必要解析出样品的所有成分（比如对映体、非对映体、）是否有必要解析出样品的所有成分（比如对映体、非对映体、 同系物、痕量杂质）？同系物、痕量杂质）？（4 4）如需做定量分析，精密度需多高？）如需做定量分析，精密度需多高？（5 5）本法将适用几种样品分析还是很多种样品分析？）本法将适用几种样品分析还是很多种样品分析