[医学]第六章 中药含量测定方法ppt课件

1、第六章 中药含量测定方法一、薄层色谱法1、概述一）薄层色谱法的特点一）薄层色谱法的特点 设备简单，操作方便。广泛地选用各流动相，比气相色谱灵活。 灵敏度较高薄层色谱法适于分析小量样品可以采用多种展开方式：如，双向展开，多次展开，分步展开，连续展开；分离原理是的物理化学原理，例如，吸附色谱，分配色谱，离于交换，薄层电泳，薄层等电聚焦。适于分析热不稳定，难挥发的样品。（二）方法原理原理： 薄层色谱分离法是将固定相吸附剂均匀地涂在玻璃上制成薄层板，试样中的各组分在固定相和作为展开剂的流动相之间不断地发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配过程。不同物质上升的距离不一样而形成相互分开的斑点从而达到分离。

2、（三）固定相（1）硅胶：微酸性极性固定相，适用于酸性、中性物质分离（可以制备成酸度不同或碱性硅胶扩大使用范围） （2）氧化铝：碱性极性固定相，适用于碱性、中性物质分离（可以制备成中性或酸性氧化铝扩大使用范围） （3）聚酰胺：含有酰胺基极性固定相，适用于酚类、醇类化合物的分离 （4）纤维素：含有羟基的极性固定相，适用于分离亲水性物质 根据制备方法不同，吸附剂又可以分为不同的活性，如：硅胶和氧化铝可以分为五级2、薄层色谱-可见分光光度法1）点样：条状，50300ul2）定位：对照的位置，区带的范围紫外、荧光、碘蒸气、对照品定位、紫外扫描3）捕集：4）洗脱：渗漉、多次浸出、加热温浸、索氏回流提取荧光

3、板应洗脱后再比色5）显色及比色显色剂用量反应时间、反应温度显色稳定性空白试剂及固定相最好不显色3、薄层色谱-紫外分光光度法不需加显色剂其他同薄层色谱-可见分光光度法4、薄层色谱扫描法扫描方式：反射法：紫外光区透射法：可见光区波长选择方式：单波长法双波长法：消除背景干扰注意事项样品的前处理：溶剂提取吸附剂的选择：散射系数点样光源的选择：钨灯、氘灯、汞灯、氙灯展开剂的选择显色剂的选择双波长法扫描光束的选择：最大吸收和无吸收点波长扫描方式的选择：线性扫描、锯凿形扫描5、薄层色谱-发光分析法胶束增敏荧光法-环糊精包含增敏作用鲁米诺（Luminol)等化学发光体系二、高效液相色谱GCGC20%20%HP

4、LCHPLC80%80%GCHPLC)k1k()1(N41Rs22COOHNOCOOH2COOHCOOHNO2不同品牌、不同规格色谱柱的比较OCH3NHOHHOOH NHO2CHCHH NNH223SO H3SO HNNH N2HONNCH NH2CONHCHHOOCCH CH22COOHNOHNO2CClNNCH3CH3色谱分离模式的确立NClNHCNHONClNH +2NCONHCNHO用H3PO4调节pH=3H3PO4pH 2.0HAcpH 3.5H=2.0 or 3.5用HClO4调节pH=2.10-2.15HPLC方法总结固定相极性小固定相极性小 如硅胶如硅胶-C18，硅胶硅胶-苯基

5、；苯基； 流动相极性大流动相极性大 甲醇甲醇-水、乙腈水、乙腈-水、水和无机盐的缓冲液。水、水和无机盐的缓冲液。 反相键合色谱法反相键合色谱法 分析对象分析对象 多用于多环芳烃多用于多环芳烃(PAHs)等低极性化合物分离；改变流等低极性化合物分离；改变流动相配比，动相配比，也可分离极性化合物；缓冲液可用于易离也可分离极性化合物；缓冲液可用于易离解的化合物，如有机解的化合物，如有机有机酸、有机酸、有有机机碱和酚碱和酚类类。 固定相极性固定相极性大大 硅胶硅胶-OH(或双或双-OH)，硅胶硅胶-CN 流动相极性流动相极性小小 烃类烃类+适量极性溶剂适量极性溶剂(CHCl3，CH3OH，CH3CN)

6、 正正相键合色谱法相键合色谱法 分析对象分析对象 多用于极性或中等极性化合物的分离。多用于极性或中等极性化合物的分离。还可用于分离还可用于分离异构体、异构体、极性不同的化合物以及不同类型的化合物。极性不同的化合物以及不同类型的化合物。 一一. 正相和反相键合色谱法正相和反相键合色谱法 正相键合色谱中，随流动相极性增加，组分分配比正相键合色谱中，随流动相极性增加，组分分配比k增加。增加。 在在HPLC分析中，有时要在流动相中加入适量的盐分析中，有时要在流动相中加入适量的盐(碳酸铵、四烷基铵盐碳酸铵、四烷基铵盐)或酸，为或酸，为什么？答：都是为防止峰形拖尾。加入盐类是为了减少待测物与键合相表面的残

7、留硅什么？答：都是为防止峰形拖尾。加入盐类是为了减少待测物与键合相表面的残留硅醇基作用；加入酸是抑制酸类待测物的离解，使其以游离酸在柱内分离。醇基作用；加入酸是抑制酸类待测物的离解，使其以游离酸在柱内分离。 何为正相色谱，何为反相色谱？何为正相色谱，何为反相色谱？正相色谱正相色谱低极性流动相低极性流动相反相色谱反相色谱高极性流动相高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间时间时间时间时间待测物极性：待测物极性：ABC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系时间，时间，min固定相：固定相：C1固定相：固定相：C8固定相：固定

8、相：C18硅胶硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。二、离子交换色谱二、离子交换色谱 此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合，测定各类阴、阳离子的此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、氨基酸、分离分析方法。它既适于无机离子，也适于有机物分离，

9、如蛋白质、氨基酸、核酸等。核酸等。1. 原理：利用不同等测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来原理：利用不同等测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来实现分离的。待测离子与离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子发生实现分离的。待测离子与离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子发生可逆交换反应：可逆交换反应： 对阳离子，滞留顺序为：对阳离子，滞留顺序为： Fe3+, Ba2+, Pb2+, Sr2+, Ca2+, Ni2+, Cd2+, Cu2+, Co2+, Zn2+, Mg2+, UO22+, Tl+, Ag+, Cs+, Rb+, K+, NH4+, Na+,

10、H+, Li+ 对阴离子，滞留顺序为：对阴离子，滞留顺序为：柠檬酸根柠檬酸根, SO42-, C2O4, I-, HSO4-, NO3-, CrO42-, Br-, SCN-, Cl-, HCOO-, CH3COO-, OH-, F- 思考：待测阳离子电荷越小、其水合离子的半径越大，则越先出峰？对吗？思考：待测阳离子电荷越小、其水合离子的半径越大，则越先出峰？对吗？ ClXNRRXClNR-R:HMSORMHSO-R:33-3-3阴离子交换阴离子交换阳离子交换阳离子交换2. 固定相固定相 按离子交换剂类型分四种：按离子交换剂类型分四种： 按固定相制作方法可分为：按固定相制作方法可分为： 多孔型

11、离子交换树脂多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型包括微孔型和大孔型)； 表面多孔型表面多孔型(包括薄膜型）离子交换树脂；包括薄膜型）离子交换树脂； 离子交换键合型。离子交换键合型。 类型类型 官官能能团团 强强阳阳离离子子交换交换剂剂 -SO3- 阳阳离离子子交换交换剂剂 弱弱阳阳离离子子交换交换剂剂 -CO2- 强强阴阴离离子子交换交换剂剂 -NR3+ 阴阴离离子子交换交换剂剂 弱弱阴阴离离子子交换交换剂剂 -NH2+ 1）多孔型：聚苯乙烯）多孔型：聚苯乙烯+二乙烯苯交联，二乙烯苯交联，分微孔型和大孔型。交换基团多分微孔型和大孔型。交换基团多交交换容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、换容量大，

12、稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢。柱效低、分析速度慢。2）表面多孔型：）表面多孔型：薄膜型薄膜型=惰性核惰性核+树脂树脂薄层薄层(1-2 m)多孔型多孔型=惰性核惰性核+硅胶微球硅胶微球+树脂薄层。树脂薄层。克服了多孔型离子交换树脂的不足，但克服了多孔型离子交换树脂的不足，但交换容量低，柱子易超负荷。交换容量低，柱子易超负荷。3）离子交换键合相：利用化学反应将离）离子交换键合相：利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。载体子交换基团键合到惰性载体表面。载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。使用后者为载体，可得到性能稳定、粒。使用后者为载体，

13、可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子。耐压、高柱效的柱子。微孔型微孔型 大孔型大孔型微孔微孔微孔微孔薄膜型薄膜型 表面多孔型表面多孔型离子交换层离子交换层惰性核惰性核惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆离子交换剂硅胶层涂覆3. 流动相流动相 离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液(有一定有一定pH和离子强度和离子强度) ，通过改变，通过改变pH、缓、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比k，改变交换剂，改变交换剂的选择性，进而影响样品待测物的分离。的选择性，进而影响样品待测物的分离。pH值：值：

14、影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组分以分子形影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组分以分子形式存在时，则不被保留；离子分数越高，保留值越大。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、式存在时，则不被保留；离子分数越高，保留值越大。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。甲酸盐、乙酸盐和氨水等。离子强度离子强度I：对保留值的影响比对保留值的影响比pH更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳离子将增加它们对增加外加阴或阳离子将增加它们对R+或或R-的竞争能力，使组分保留值减小。通的竞争能力，使组分保留值减小。通

15、过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。有机溶剂：有机溶剂：外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小。常用外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。配离子配离子L：当大量当大量L、组分、组分X随流动相进入柱后，发生配位剂交换：随流动相进入柱后，发生配位剂交换：RM-L+X RM-X+L该法用于分离各种氨基酸或碱类。该法用于分离各种氨基酸或碱类。思考：离子交换色谱

16、法中，流动相常以无机盐的缓冲液为流动相。请问缓冲液的思考：离子交换色谱法中，流动相常以无机盐的缓冲液为流动相。请问缓冲液的pH值及离子强度对分离各有何影响？值及离子强度对分离各有何影响？三、离子色谱三、离子色谱 离子色谱离子色谱(IC)是是70年代发展的新方法。其分离原理与离子交换色谱原理一样，年代发展的新方法。其分离原理与离子交换色谱原理一样，只是流出的各种离子用电导检测器检测。但由于流动相都是强电解质，其电导率比只是流出的各种离子用电导检测器检测。但由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约高待测离子约高2个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。个数量级，这种强背景电导会完全掩盖

17、待测离子信号。 为解决此问题，为解决此问题，1975年年Small提出，在离子交换柱之后，再串结一根抑制柱。提出，在离子交换柱之后，再串结一根抑制柱。该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，从而可用电导检测器柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。检测各种离子的含量。例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换树例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱为高容

18、量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下列反应：脂，则发生下列反应：R+OH + HCl(流动相流动相)R+Cl- + H2O R+OH + MCl(待测物待测物) R+Cl + M+OH-可见，不仅大量酸转化为低电导的水，而且待测离子转化为具有更大淌度的碱。可见，不仅大量酸转化为低电导的水，而且待测离子转化为具有更大淌度的碱。 该法的不足之处在于：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低该法的不足之处在于：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。因此有人提出了使用电导率很低的溶液分离度。因此有人提出了使用电导率很低的溶液(如苯甲酸盐稀溶液如苯甲酸盐稀溶液)作流动相。作流动相

19、。思考：思考：IC分离中，何为抑制柱？分析阴离子时，抑制柱中应填充何种离子交换树脂？分离中，何为抑制柱？分析阴离子时，抑制柱中应填充何种离子交换树脂？四、离子对色谱法（四、离子对色谱法（IPC） 离子色谱对色谱主要用来分离强极性有机酸和有机碱。离子色谱对色谱主要用来分离强极性有机酸和有机碱。1. 原理：将与待测物离子原理：将与待测物离子A电荷相反的离子电荷相反的离子B（称为对离子或反离子）加入到（称为对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子与对离子形成离子对流动相中，使待测离子与对离子形成离子对AB，该，该AB离子对离子对的性质与的性质与A离子离子或或B离子离子的性质不同，即间接改变了待测离

20、子的保留特性。的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动相中加入与待测离子例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动相中加入与待测离子A-有相反电荷的离子有相反电荷的离子B+： 由于离子对由于离子对AB具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子A1，A2，A3.因与因与B离子间的成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使离子间的成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的。得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的。思考：有一强极

21、性有机酸混合物，若用离子对色谱法分离，请问在流动相中应加入阴离思考：有一强极性有机酸混合物，若用离子对色谱法分离，请问在流动相中应加入阴离子还是阳离子来开成离子对？子还是阳离子来开成离子对？ 有机相有机相水相水相水相水相BABA五、尺寸排阻色谱法五、尺寸排阻色谱法 尺寸排阻色谱又称凝胶尺寸排阻色谱又称凝胶(渗透渗透)色谱，主要用于大分子的分子分离。它是基于待色谱，主要用于大分子的分子分离。它是基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分离的。测物分子的尺寸和形状不同来实现分离的。1. 分离原理：固定相为化学惰性的多孔凝胶，它类似于分子筛，但孔径更大。凝胶分离原理：固定相为化学惰性的多孔凝胶，它类似于

22、分子筛，但孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被淋内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被淋洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。即待测物分子按洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。即待测物分子按分子大小分子大小(分子量大小分子量大小)先后从柱中流出。先后从柱中流出。2. 固定相固定相3. 流动相的要求：能溶解样品且与凝胶相似流动相的要求：能溶解样品且与凝胶相似(润湿凝胶润湿凝胶)、粘度小、粘度小(增加扩散速度增加扩散速度)。 类型类型 材料材料 型号型号 特点特点 流动相流动相 葡萄糖凝胶葡萄糖凝胶 Sephadax 水水 软性凝胶软性凝胶 聚苯乙烯聚苯乙烯 Bio-head-S 溶胀溶胀,小分小分子分离子分离 有机溶剂有机溶剂 聚苯乙烯聚苯乙烯 Styragel 有机溶剂有机溶剂 半刚性凝胶半刚性凝胶 聚乙酸酯聚乙酸酯 Emgel(OR) 溶胀溶胀较小较小流速较小流速较小 有机溶剂有机溶剂 玻璃珠玻璃珠 CPG-10 有机溶剂和水有机溶剂和水 刚性凝胶刚性凝胶 多孔硅胶多孔硅胶 Porasil 刚