Sephadex LH-20

1、葡聚糖凝胶柱使用及注意事项1 SephadexG型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，SephadexG-25丙化后就是SephadexLH-20o其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之2 SephadexLH20的原理。SephadexLH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱，Sephadex

2、LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。3 SephadexLH20洗脱溶剂。看完第2点后，就应该清楚SephadexLH20洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇一一水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100%甲醇冲柱。正相系统以氯仿一一甲醇最为常见，先用50%氯仿一一甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100%甲醇冲柱。4 SephadexLH20样品的处理和洗脱溶剂的选择。如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇一一水），样品用最少体积的

3、甲醇一一水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把SephadexLH20堵啦，就得将SephadexLH20的柱头部分弃去，很心痛呀)。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱(氯仿一一甲醇)，样品用最少体积的氯仿一一甲醇溶解，过滤后，湿法上样。5 SephadexLH-20的步骤。选择条件：梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。(2) 饱和层析柱:用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防

4、止气泡留在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。(3) 样品处理:用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。(4) 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。洗脱：控制流速，一般ldrop/s以下，可参见厂家的一些参数;必要时更改极性(很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕)。再生以备下次使用。6分离的技巧，最后说说我的使用心得(1) 流速不可太快，切切不可新急，所谓欲速则不达。(2) 柱子尽可能长，SephadexLH20柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力，打击敌人。（3）憎分一定要接

5、的细，可1/10,或1/20个保留体积接成一憎分。（4）洗脱体积一般为23个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。（5）隸质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用SephadexLH20分革柔质（6）SephadexLH20对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量文献参考。（7）填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用。SephadexLH-20是由葡聚糖G25疑丙基化加工而成，属于分子筛凝胶，尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化。例如：类固醇、祜类、脂类以及小分子多肽等，PharmadexLH-20同时适用于分子类别非

6、常相似的物质的分离和工业规模的制备，既可用于初步纯化步骤，也可用于最终精制步骤，如非对映同分异构体的分离。1 装柱装填的重要原则之一就是需要形成一个稳定均一的柱床。胶颗粒越均一（粒径分布越窄）,越容易获得稳定均一的柱床。但是对于SephadexLH-20而言，25100|im的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言，不能说分布均一，也就是说其粒径分布较宽。然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床。这对于长柱（最高至250cm）而言也是同样的。在装柱前，层析柱和储槽都必须进行彻底的清洗。SephadexLH-20在使用之前必须进行溶胀。在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒，且要

7、避免使用磁力搅拌器。在室温下，将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时，溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统，请参考后页之干胶溶胀表计算特定柱体积所需要干胶的量。使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75%,上层溶剂占25%,这时，悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内，在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱，反压不要超过1.5bao2 平衡上样前，用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止，如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质，并根据性质确定柱高调节器的位置，如使用相同的溶剂，在以后的层析中柱平衡可以省略。3 洗脱液为确保延长层析柱的

8、使用寿命，所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质。4样品样品体积应该占柱总体积的2%,同样在使用之前样品应该离心或经过0.45um的膜过滤。5 洗脱洗脱流速应根据情况而定，最大线性流速约12cm/min（反压1.5ba）,建议流速为l-10cm/h。总体来说，较低的流速，具有较高的分辩率。6 再生凝胶再生通常是先用23个柱体积的洗脱液进行清洗，如更换洗脱液，则需要重新平衡。7 体积流速与线性流速的关系线性流速=体积流速/横截面积8 溶胀体积由于SephadexLH-20的溶胀体积依赖于溶剂，所以对于不同直径的柱可根据比例增加或减少旧柱体积以便计算出新体积。4/9新体积二旧体

9、积X（新柱体积/旧柱体积）9 胶的性质SephadexLH-20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。10.排阻极限4-5KD（与所用溶剂有关）11 .上样量吸附模式取决于所需分辩率分子量大小小于总体积的20%正相分配小于总体积的1%12 其他胶粒形状球形，多孔颗粒大小（干）（直径）颗粒大小中间值（干）70um（直径）干胶溶涨表溶剂溶胀体积（ml/g干胶）二甲亚砚4.24.4毗噪4.0-4.3水3.8-4.2甲醇3.7-4.2二氯乙烷3.5-4.0丙醇3.4-3.8乙醇3.2-3.6异丙醇3.1-3.5四氢咲喃3.1-3.5甲苯1.5-1.61.Sephade

10、xLH-20简介疑丙基葡聚糖凝胶LH-20是一种SephadexG-25的疑丙基衍生物，字母LH的含义是这种凝胶骨架在亲脂溶剂中或在水溶剂中都能溶胀。在G-25分子中引入疑丙基以代替分子中疑基上的氢，葡聚糖凝胶分子的葡萄糖部分将与耗丙基形成醛键连接：R-OHR-O-CH2CH2CH20H与SephadexG相比,SephadexLH-20分了中0H总数虽无改变，但碳原子所占比例却相对增加了，从而使葡聚糖的亲脂性增大。这种凝胶既有亲水性，又有亲脂性，不仅可在水中应用，也可在极性有机溶剂或它们与水组成的混合溶剂中膨润使用，如丁醇、氯仿、四氢咲喃、二氧六坏等，应用范围增大，对黄酮、蔥醍、香豆素等成分

11、也能分离。SephadexLH-20除保留有SephadexG-25原有的分子筛特性，可按分子量大小分离物质外，在有极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中常常起到反相分配色谱的效果，适用于不同类型有机物的分离，在天然药物分离中得到了越来越广泛的应用。使用注意事项：疑丙基葡聚糖凝胶SephadexLH-20虽然是一种两性凝胶，但由于在不同溶剂中的溶胀因子各不相同（见表1）,因此在柱中直接更换溶剂是不允许的，床体积在2.5mL/g干胶以下的不能用于GPC分析。这种凝胶在有机溶剂中分离较小分子量的脂溶性化合物是十分有效的。但在使用时不允许有氧化剂存在。再生与保存：SephadexLH-20价格比较昂贵。用

12、过的SephadexLH-20可以反复再生使用，而且柱子的洗脱过程往往就是柱子的再生过程。短期不用时可以水洗T含水醇洗（醇的浓度逐步递增）9醇洗，最后泡在醇中贮于磨口瓶中备用。如长期不用时，可在以上处理基础上，减压抽干，再用少量乙醯洗净抽干，室温充分挥散至无醯味后，6080°C干燥后保存。SephadexLH-20不仅具有亲水性能，可以吸水膨胀，而且也有一定的亲脂性，可以吸收有机溶剂而膨胀。在不同的溶剂中，其色谱特性也不同。表1列举了它在不同溶剂中浸泡后吸收溶剂而膨胀的体积。表1葡聚糖凝胶LH-20在各种溶剂中的膨胀体积和吸收溶剂的能力溶胀后的体积溶剂吸收率溶剂（mL/g干凝胶）（mL/g干