酶组织化学各论

1、酶组织化学各论酶组织化学各论一、碱性磷酸酶一、碱性磷酸酶 碱性磷酸酶在碱性环境下能催化各种碱性磷酸酶在碱性环境下能催化各种醇和酚的磷酸酯水解。其反应通式如下：醇和酚的磷酸酯水解。其反应通式如下： 1. 1.钙钙- -钴法光镜显示方法钴法光镜显示方法 （1 1）钙）钙- -钴法的原理钴法的原理 碱性磷酸酶将碱性磷酸酶将磷酸盐的底物分解产生磷酸离子为孵育液磷酸盐的底物分解产生磷酸离子为孵育液中的氯化钙捕获生成磷酸钙沉淀，加入硝中的氯化钙捕获生成磷酸钙沉淀，加入硝酸钴，使之转变为磷酸钴沉淀，再通过硫酸钴，使之转变为磷酸钴沉淀，再通过硫化铵处理，形成棕黑色硫化钴颗粒沉淀，化铵处理，形成棕黑色硫化钴颗粒

2、沉淀，以显示酶活性所在部位。以显示酶活性所在部位。 （2 2）孵育液的配制：）孵育液的配制：3 3-甘油磷酸钠甘油磷酸钠 10ml10ml（底物）（底物）2 2巴比妥钠巴比妥钠 10ml10ml（缓冲液）（缓冲液）2 2氯化钙氯化钙 20ml20ml（捕获剂）（捕获剂）5 5硫酸镁硫酸镁 5ml5ml（激活剂）（激活剂）D.W 5mlD.W 5ml孵育液最终孵育液最终pH值值9.4，置于冰箱保存。，置于冰箱保存。 （3 3）操作步骤：）操作步骤：新鲜组织，作冰冻切片（可用新鲜组织，作冰冻切片（可用1010福尔马林福尔马林 固定固定10min10min，或不固定），或不固定）入孵育液，入孵育液，

3、3737孵育孵育 303060min60min （磷酸钙沉淀形成）（磷酸钙沉淀形成）蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗 5min5min置置2 2硝酸钴内硝酸钴内 2min2min（磷酸钴形成）（磷酸钴形成）蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗置置1 1硫化铵溶液内硫化铵溶液内 1min1min（硫化钴形成）（硫化钴形成）蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗甘油明胶封固甘油明胶封固 （非脂溶剂稳定沉淀）（非脂溶剂稳定沉淀） （4 4）结果与评价：碱性磷酸酶活性产）结果与评价：碱性磷酸酶活性产物为棕黑色硫化钴沉淀。该法的反应产物物为棕黑色硫化钴沉淀。该法的反应产物可发生扩散，故定位欠准确。可发生扩散，故定位欠准确。 （5 5）对照：从孵育液

4、中去除底物或用）对照：从孵育液中去除底物或用左旋咪唑等抑制剂的方法。左旋咪唑等抑制剂的方法。 2. 2.偶氮偶氮- -偶联法光镜显示方法偶联法光镜显示方法 （1 1）偶氮色素法的原理）偶氮色素法的原理 偶氮色素法偶氮色素法是捕捉与磷酸同时释放出的醇或酚，以偶是捕捉与磷酸同时释放出的醇或酚，以偶氮色素的形式产生沉淀的方法。如底物使氮色素的形式产生沉淀的方法。如底物使用用磷酸萘酯，通过酶的作用，水解生磷酸萘酯，通过酶的作用，水解生成的成的萘酚，后者为重氮盐捕捉，生成萘酚，后者为重氮盐捕捉，生成红色的偶氮色素沉淀。红色的偶氮色素沉淀。 （2 2）孵育液的配制：）孵育液的配制：萘酚萘酚ASAS（或萘酚

5、（或萘酚AS-MXAS-MX）101025mg25mg（底物）（底物）N N，N-N-二甲基甲酰胺液二甲基甲酰胺液 0.5ml0.5ml（促溶剂）（促溶剂）0.2mol/L Tris0.2mol/L Tris盐酸（盐酸（pH9.2pH9.2） 50ml50ml（缓冲液）（缓冲液）坚牢蓝坚牢蓝B B 50mg 50mg（捕获剂）（捕获剂） 以上混合和过滤，必要时可用氢氧化以上混合和过滤，必要时可用氢氧化钠调整钠调整pH9.09.2值。值。 （3 3）操作步骤：）操作步骤：新鲜组织，作冰冻切片；新鲜组织，作冰冻切片；入孵育液，入孵育液，3737或室温或室温 5 560min 60min （有色沉淀

6、形成）（有色沉淀形成）双蒸馏水冲洗双蒸馏水冲洗 3 35min5min4 4甲醛，室温下固定甲醛，室温下固定 101050min50min蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗 3 35min5min甘油明胶封固。甘油明胶封固。 （脂溶性沉淀）（脂溶性沉淀） （4 4）结果与评价：采用不同的重氮）结果与评价：采用不同的重氮盐，酶的活性显色也不同盐，酶的活性显色也不同 萘酚法有三个优点：萘酚法有三个优点：反应产物溶解反应产物溶解度小，局部比较明显；度小，局部比较明显；萘酚化合物能比萘酚化合物能比较快地被水解，可缩短孵育的时间；较快地被水解，可缩短孵育的时间；反反应产物立即可见，并显示出颜色。应产物立即可见，并显示

7、出颜色。 3. 3.柠檬酸铅电镜显示法柠檬酸铅电镜显示法 （1 1）预处理：）预处理： 固定：固定：2 2戊二醛（戊二醛（0.1mol0.1molL L二甲二甲胂酸缓冲液，胂酸缓冲液，8 8蔗糖，蔗糖，PH7.2PH7.27.47.4），），固定固定60min60min；或；或4 4多聚甲醛固定数小时至多聚甲醛固定数小时至12h12h。 切片：冰冻切片机或振动切片机切切片：冰冻切片机或振动切片机切片片404050um50um。 （2 2）孵育液的配制：）孵育液的配制：0.2mol0.2molL Tris-HClL Tris-HCl（pH8.5pH8.5） 1.4ml1.4ml（缓冲液）（缓冲液

8、）3 3-甘油磷酸钠甘油磷酸钠 2.0ml2.0ml（底物）（底物）0.015mol0.015molL MgSOL MgSO4 4液液 2.6ml2.6ml（激活剂）（激活剂）蔗糖蔗糖 0.5g 0.5g （和缓剂）（和缓剂）0.50.5柠檬酸铅柠檬酸铅 4.0ml4.0ml（捕获剂）（捕获剂） 共计共计 10ml10ml（pH9.0pH9.09.49.4） （3 3）方法与步骤：）方法与步骤：新鲜组织，或甲醛固定并作冰冻切片新鲜组织，或甲醛固定并作冰冻切片40um40um；入孵育液，入孵育液，3737，孵育，孵育 151530min30min；蒸馏水洗；蒸馏水洗；冷冷1 1锇酸（锇酸（OsO

9、OsO4 4），），30min30min；蒸馏水洗；蒸馏水洗；梯级酒精脱水；梯级酒精脱水；环氧树脂包埋，超薄切片，电子染色；环氧树脂包埋，超薄切片，电子染色；电子显微镜观察。电子显微镜观察。 （4 4）结果与评价：磷酸铅呈现高电）结果与评价：磷酸铅呈现高电子密度颗粒，主要分布在细胞膜上。子密度颗粒，主要分布在细胞膜上。 （5 5）对照：孵育液中去除底物或加）对照：孵育液中去除底物或加入抑制剂（如入抑制剂（如苯丙氨酸或四唑或溴四苯丙氨酸或四唑或溴四唑），则酶活性为阴性。唑），则酶活性为阴性。二、酸性磷酸酶二、酸性磷酸酶 酸性磷酸酶是一种在酸性环境下能水酸性磷酸酶是一种在酸性环境下能水解磷酸单酯的

10、酶。其反应通式与碱性磷酸解磷酸单酯的酶。其反应通式与碱性磷酸酶相同。酶相同。 酸性磷酸酶活性的检查法一般可分为酸性磷酸酶活性的检查法一般可分为金属盐法和偶氮色素法。金属盐法和偶氮色素法。 1. 1.金属盐光镜显示方法金属盐光镜显示方法 （1 1）显示原理）显示原理 显示酸性磷酸酶的铅法其基本机制类显示酸性磷酸酶的铅法其基本机制类似于显示碱性磷酸酶的钙似于显示碱性磷酸酶的钙- -钴法，但因磷钴法，但因磷酸钙在酸性溶液中是可溶性化合物，故改酸钙在酸性溶液中是可溶性化合物，故改用硝酸铅作捕获剂，最后与硫化铵作用生用硝酸铅作捕获剂，最后与硫化铵作用生成棕色硫化铅沉淀。成棕色硫化铅沉淀。 （2 2）孵育

11、液的配制：）孵育液的配制：3 3-甘油磷酸钠甘油磷酸钠 1ml1ml（底物）（底物） 0.05mol0.05mol醋酸盐缓冲液（醋酸盐缓冲液（pH5.0pH5.0） 10ml10ml（缓冲液）（缓冲液）蔗糖蔗糖 0.8mg0.8mg（和缓剂）（和缓剂）硝酸铅硝酸铅 10mg10mg（捕获剂）（捕获剂） 孵育液最终孵育液最终pHpH值值5.05.0，新鲜配制尽快，新鲜配制尽快使用。使用。 （3 3）操作步骤：）操作步骤：新鲜组织，作冰冻切片或石蜡切片新鲜组织，作冰冻切片或石蜡切片1010福尔马林固定福尔马林固定 10min10min蒸馏水洗蒸馏水洗入孵育液，入孵育液，37 237 24h4h（磷

12、酸铅形成）（磷酸铅形成）双蒸馏水洗双蒸馏水洗 2 23min3min入入1 1硫化铵液（新鲜配制）硫化铵液（新鲜配制） 1 12min2min （硫化铅形成）（硫化铅形成）蒸馏水冲洗；蒸馏水冲洗；甘油明胶封固。甘油明胶封固。 （非脂溶剂稳定沉淀）（非脂溶剂稳定沉淀） （4 4）结果与评价：反应阳性部位呈）结果与评价：反应阳性部位呈棕褐色硫化铅颗粒。该酶是可溶性酶，棕褐色硫化铅颗粒。该酶是可溶性酶，以冷固定后结果较满意。以冷固定后结果较满意。 （5 5）对照：）对照：去底物对照；去底物对照；抑制抑制剂对照：特异性酶抑制剂是氟化钠（剂对照：特异性酶抑制剂是氟化钠（NaFNaF，4.2mg4.2mg

13、10ml10ml）。）。 2. 2.偶氮色素光镜显示方法偶氮色素光镜显示方法 （1 1）显示原理）显示原理 酸性磷酸酶是使底物的醇部分脱磷酸酸性磷酸酶是使底物的醇部分脱磷酸化，以偶氮色素的形式捕捉。以萘酚或其化，以偶氮色素的形式捕捉。以萘酚或其衍生物磷酸酯作为底物，经酶作用游离出衍生物磷酸酯作为底物，经酶作用游离出萘酚或其衍生物，与重氮盐作用形成偶氮萘酚或其衍生物，与重氮盐作用形成偶氮色素，显色于酶活性部位。色素，显色于酶活性部位。 （2 2）孵育液的配制：）孵育液的配制：萘酚萘酚AS-BIAS-BI磷酸盐磷酸盐 5mg5mg（底物）（底物）溶于二甲基甲酰胺液溶于二甲基甲酰胺液 0.25ml0

14、.25ml（促溶剂）（促溶剂）1010氯化镁氯化镁 2 2滴（激活剂）滴（激活剂）蒸馏水蒸馏水 25ml25ml0.2mol0.2mol醋酸盐缓冲液（醋酸盐缓冲液（pH5.2pH5.25.65.6） 25ml25ml（缓冲液）（缓冲液）红紫罗兰红紫罗兰IBIB盐盐 30mg30mg（捕获剂）（捕获剂） （或其他重氮盐）（或其他重氮盐） 以上充分搅拌、溶解、过滤后使用。以上充分搅拌、溶解、过滤后使用。 （3 3）操作步骤：）操作步骤：新鲜组织，甲醛钙固定新鲜组织，甲醛钙固定 10min10min冰冻切片或石蜡切片冰冻切片或石蜡切片蒸馏水洗蒸馏水洗 1 12min2min入孵育液，入孵育液，37

15、1037 1060min60min（有色沉淀形成）（有色沉淀形成）双蒸馏水漂洗双蒸馏水漂洗 2 23min3minl l甲基绿甲基绿 1 12min2min（复染细胞核）（复染细胞核） 蒸馏水漂洗蒸馏水漂洗 1 12min2min甘油明胶封固。甘油明胶封固。 （脂溶性沉淀）（脂溶性沉淀） （4 4）结果与评价：红色颗粒为酶活）结果与评价：红色颗粒为酶活性部位。性部位。 （5 5）对照：采用去底物实验。）对照：采用去底物实验。 3. 3.电镜显示法电镜显示法 （1 1）预处理：）预处理：固定：固定：2 2戊二醛（戊二醛（0.1mol/L0.1mol/L二甲胂酸二甲胂酸盐缓冲液，盐缓冲液，8 8蔗

16、糖，蔗糖，pH7.2pH7.27.47.4）固定）固定60min60min；切片：冰冻切片机切片或振动切片机切片：冰冻切片机切片或振动切片机切片切片404050um50um。 （2 2）孵育液的配制：）孵育液的配制：醋酸盐缓冲液醋酸盐缓冲液 0.1mol0.1molL L（缓冲液）（缓冲液）对硝基酚磷酸钠对硝基酚磷酸钠 3.0mmol3.0mmolL L（底物）（底物）硝酸铅硝酸铅 3.6mmol3.6mmolL L（捕获剂）（捕获剂） （3 3）方法与步骤：）方法与步骤：新鲜组织，预固定并作冰冻切片新鲜组织，预固定并作冰冻切片40um40um；入孵育液，入孵育液，3737，101020nim

17、20nim（磷酸铅沉淀（磷酸铅沉淀形成）形成）冷冷1 1四氧化锇液后固定；四氧化锇液后固定；9595乙醇脱水；乙醇脱水；环氧树脂包理；超薄切片；电子染色；环氧树脂包理；超薄切片；电子染色； 电子显微镜观察。电子显微镜观察。 （4 4）结果与评价：阳性沉集物为高电）结果与评价：阳性沉集物为高电子密度颗粒。子密度颗粒。 （5 5）对照：去底物对照，抑制剂对照，）对照：去底物对照，抑制剂对照，硝基酚磷酸钠。硝基酚磷酸钠。 5.5.酸性磷酸酶的生物学意义酸性磷酸酶的生物学意义 酸性磷酸酶广泛分布于生物体内，一酸性磷酸酶广泛分布于生物体内，一般认为酸性磷酸酶位于溶酶体，是溶酶体般认为酸性磷酸酶位于溶酶体

18、，是溶酶体的标志酶。的标志酶。三、三磷酸腺苷酶三、三磷酸腺苷酶 ATPATP酶为水解酶为水解ATPATP产生产生ADPADP和磷酸的酶。和磷酸的酶。ATPATP酶种类繁多，重要的酶种类繁多，重要的ATPATP酶有：酶有： （1 1）细胞膜）细胞膜ATPATP酶酶 NaNa+ +、K K+ +-ATP-ATP酶和酶和CaCa2+2+、MgMg2+2+-ATP-ATP酶。酶。 （2 2）肌球蛋白）肌球蛋白ATPATP酶酶 因它可被因它可被CaCa2+2+激活，故又称为激活，故又称为CaCa2+2+-ATP-ATP酶。酶。 （3 3）线粒体）线粒体ATPATP酶酶 MgMg2+2+-ATP-ATP酶

19、可被酶可被MgMg2+2+所激活。所激活。 （4 4）溶酶体膜）溶酶体膜ATPATP酶酶 H H+ +、K K+ +-ATP-ATP酶。酶。 硝酸铅法显示硝酸铅法显示Mg2+激活的三磷酸腺苷酶激活的三磷酸腺苷酶（Mg2+-ATPase） （1）原理：）原理：ATPase水解磷酸之间的高能键，水解磷酸之间的高能键，释放大量能量，而不能水解磷酸与碳之间的键。释放大量能量，而不能水解磷酸与碳之间的键。释放出来的磷酸离子被铅离子捕获，经硫化铵释放出来的磷酸离子被铅离子捕获，经硫化铵处理形成硫化铅沉淀显色。处理形成硫化铅沉淀显色。 （2 2）孵育液的配制：）孵育液的配制：三磷酸腺苷二钠三磷酸腺苷二钠 1

20、0mg10mg（底物）（底物）0.2mol/L Tris-HCl0.2mol/L Tris-HCl（pH7.2pH7.2） 10ml10ml（缓冲液）（缓冲液）0.1mol/L MgSO0.1mol/L MgSO4 4 2.5ml 2.5ml（激活剂）（激活剂）2 2Pb(NOPb(NO3 3) )2 2 1.5ml 1.5ml（捕获剂）（捕获剂）蔗糖蔗糖 1.8g1.8g（和缓剂）（和缓剂）双蒸馏水双蒸馏水 加至加至25ml25ml 配制时配制时Pb(NOPb(NO3 3) )2 2要逐滴加入，并随时搅拌，要逐滴加入，并随时搅拌，使充分混合至无色透明或过滤后使用。使充分混合至无色透明或过滤后

21、使用。 （3 3）操作步骤：）操作步骤：1 1）新鲜组织，冰冻切片；）新鲜组织，冰冻切片；2 2）冷）冷1010福尔马林固定福尔马林固定 101020min20min3 3）蒸馏水冲洗）蒸馏水冲洗 2 23min3min4 4）入孵育液，）入孵育液，3737，孵育，孵育 101060min60min （磷酸铅沉淀形成）（磷酸铅沉淀形成）5 5）蒸馏水洗）蒸馏水洗 2 23min3min6 6）入）入1 1硫化铵硫化铵 1min1min（硫化铅沉淀形成）（硫化铅沉淀形成）7 7）蒸馏水洗；）蒸馏水洗；8 8）甘油明胶封固。（非脂溶剂稳定沉淀）甘油明胶封固。（非脂溶剂稳定沉淀） （4 4）结果与评

22、价：酶活性处呈棕黑色）结果与评价：酶活性处呈棕黑色硫化铅沉淀。电镜下阳性沉集物为高电子硫化铅沉淀。电镜下阳性沉集物为高电子密度颗粒。密度颗粒。 （5 5）对照：）对照： 除去底物，则反应为阴性；除去底物，则反应为阴性； 以以-甘油磷酸钠代替底物，显示染甘油磷酸钠代替底物，显示染色反应为碱性磷酸酶的定位。色反应为碱性磷酸酶的定位。四、非特异性酯酶四、非特异性酯酶 1 1反应原理反应原理 （1 1）偶氮色素法）偶氮色素法 在酶的作用下，从在酶的作用下，从底物游离出来的底物游离出来的-萘酚（或萘酚（或-萘酚、萘萘酚、萘酚酚ASAS衍生物）与重氮盐偶联形成偶氮色素，衍生物）与重氮盐偶联形成偶氮色素，同

23、时沉着于酶的存在部位，通过偶氮色素同时沉着于酶的存在部位，通过偶氮色素的显色，可以证明酶的存在部位。的显色，可以证明酶的存在部位。 （2）嗜锇性硫酯法）嗜锇性硫酯法 在酶作用下，底在酶作用下，底物硫酯被水解后，游离出的硫酚（含物硫酯被水解后，游离出的硫酚（含-SH）立即与坚牢蓝）立即与坚牢蓝BBN相偶联，形成嗜相偶联，形成嗜锇酸性偶氮硫醚。经锇处理偶氮硫醚即锇酸性偶氮硫醚。经锇处理偶氮硫醚即形成电子密度高的锇黑。形成电子密度高的锇黑。S-乙酰基乙酰基-2-巯基苯酰替苯胺（巯基苯酰替苯胺（TAB） （3 3）硫代乙酸法）硫代乙酸法 在酶的作用下，底在酶的作用下，底物硫代乙酸游离出的硫化氢与铅反应

24、成为物硫代乙酸游离出的硫化氢与铅反应成为硫化铅而沉着。此法的原理也应用于电镜硫化铅而沉着。此法的原理也应用于电镜证明法。反应原理如下：证明法。反应原理如下： 酯酶酯酶 Pb(NOPb(NO3 3) )2 2 CHCH3 3COSH CHCOSH CH3 3COOH + HCOOH + H2 2S PbSS PbS 2 2-萘基乙酸酯法萘基乙酸酯法 1 1）孵育液的配制：）孵育液的配制：-萘基乙酸酯萘基乙酸酯 10mg10mg（底物）（底物）丙酮丙酮 0.25ml0.25ml（促溶剂）（促溶剂）0.1mol0.1molL L磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（pH7.4pH7.4） 20ml20ml（缓

25、冲液）（缓冲液）坚牢蓝坚牢蓝B B盐盐 5050100mg100mg（捕获剂）（捕获剂） 搅拌过滤使用。搅拌过滤使用。 2 2）操作步骤：）操作步骤：新鲜组织恒冷箱切片，福尔马林固定；新鲜组织恒冷箱切片，福尔马林固定；入孵育液，室温或入孵育液，室温或37 1037 1020min20min （有色沉淀形成）（有色沉淀形成）流水洗流水洗 3 35min5minMayerMayer苏木精染色苏木精染色 4 46min6min（核复染）（核复染）流水冲洗流水冲洗 5 56min6min甘油明胶封固。甘油明胶封固。 （脂溶性沉淀）（脂溶性沉淀） 3 3）结果与评价：酶活性部位呈黑）结果与评价：酶活性部

26、位呈黑色，胞核呈暗褐色。色，胞核呈暗褐色。 4. 4.非特异性酯前的生物学意义非特异性酯前的生物学意义 非特异性非特异性酯酶主要定位于内质网和溶酶体，也可能有少酯酶主要定位于内质网和溶酶体，也可能有少量存在于线粒体和胞液内。因此，光镜下整个量存在于线粒体和胞液内。因此，光镜下整个细胞质显示了酶活性的染色反应。非特异性酯细胞质显示了酶活性的染色反应。非特异性酯酶生理功能尚不清楚，目前认为主要参与酯类酶生理功能尚不清楚，目前认为主要参与酯类物质代谢，也与蛋白质代谢活动有关系。物质代谢，也与蛋白质代谢活动有关系。 适用于：睾丸，卵巢，肾上腺，巨噬细胞适用于：睾丸，卵巢，肾上腺，巨噬细胞等的研究。等的

27、研究。五、碳酸酐酶五、碳酸酐酶 1 1反应原理反应原理 目前，组织化学中显示碳酸酐酶的方目前，组织化学中显示碳酸酐酶的方法有三种：法有三种： 1 1）用同位素标记的抑制剂与酶相结）用同位素标记的抑制剂与酶相结合的放射自显影术；合的放射自显影术； 2 2）应用抗体的免疫组织化学法；）应用抗体的免疫组织化学法； 3 3）酶反应物的金属盐沉淀法。）酶反应物的金属盐沉淀法。现在最常用的是金属盐反应法。现在最常用的是金属盐反应法。 2 2光镜显示法光镜显示法 （1 1）孵育液的配制：）孵育液的配制：溶液溶液：0.1mol0.1molL CoSOL CoSO4 4 0.5 0.55ml5ml（捕获剂）（捕

28、获剂）0.5mol0.5molL HL H2 2SOSO4 4 3ml 3ml（中和剂）（中和剂）0.067mol0.067molL KHL KH2 2POPO4 4 0.5ml 0.5ml（缓冲液）（缓冲液）蒸馏水加至总量蒸馏水加至总量 8.5ml 8.5ml 溶液溶液：NaHCONaHCO3 3 380mg 380mg（底物）（底物） 溶于双蒸馏水溶于双蒸馏水20ml20ml中中 （使用前新鲜配制）（使用前新鲜配制） 临用前将溶液临用前将溶液与溶液与溶液混合，搅混合，搅拌拌4min4min，再静置，再静置4min4min，然后移至玻璃培，然后移至玻璃培养皿中待用。注意搅拌时间需一致，以养皿

29、中待用。注意搅拌时间需一致，以保反应结果稳定。保反应结果稳定。 （2 2）步骤：）步骤：取材：新鲜冰冻切片；取材：新鲜冰冻切片；固定：可用多聚甲醛或戊二醛，如：固定：可用多聚甲醛或戊二醛，如：1 12 2戊二醛二甲胂酸钠缓冲液中固定戊二醛二甲胂酸钠缓冲液中固定1 12h2h再分别以再分别以8 8、1010、2424蔗糖溶液蔗糖溶液泡过夜，然后洗净（未经固定的组织，其泡过夜，然后洗净（未经固定的组织，其CAHCAH活力可减低活力可减低5 51010）；）；切片：新鲜组织或经固定的组织块用恒切片：新鲜组织或经固定的组织块用恒冷切片机切片，冷切片机切片，101020um20um孵育：孵液中漂浮，室温

30、下孵育：孵液中漂浮，室温下4 412min12min （无色氢氧化钴沉淀形成）（无色氢氧化钴沉淀形成）洗涤：蒸馏水洗，再以洗涤：蒸馏水洗，再以0.01mol Na0.01mol Na2 2HPOHPO3 3或或 K K2 2HPOHPO3 3洗洗 1 13min3min2 2硫化铵硫化铵 1 12min2min（有色沉淀形成）（有色沉淀形成）洗涤：先用蒸馏水，再用洗涤：先用蒸馏水，再用 0.01mol0.01molL L pH4.3pH4.3的醋酸水溶液轻洗切片；的醋酸水溶液轻洗切片；甘油明胶封片，光镜镜检。（非脂溶剂甘油明胶封片，光镜镜检。（非脂溶剂稳定沉淀）稳定沉淀） 4. 4.生物学意义

31、生物学意义 碳酸酐酶是催化碳酸酐酶是催化COCO2 2水合反应和碳酸脱水反应的酶。此酶多见水合反应和碳酸脱水反应的酶。此酶多见于胃腺的壁细胞、主细胞、肾小管（近曲于胃腺的壁细胞、主细胞、肾小管（近曲小管基底部和管腔面刷状缘、远曲小管基小管基底部和管腔面刷状缘、远曲小管基底部）、集合小管、小肠吸收上皮、红细底部）、集合小管、小肠吸收上皮、红细胞、破骨细胞中，在哺乳动物的神经胶质胞、破骨细胞中，在哺乳动物的神经胶质细胞中，该酶与神经冲动的传导有关。细胞中，该酶与神经冲动的传导有关。六、过氧化物酶六、过氧化物酶 1.1.反应原理反应原理 过氧化物酶催化的反应中有两种底物，过氧化物酶催化的反应中有两种

32、底物，即受氢体和供氢体。前者的代表为过氧化即受氢体和供氢体。前者的代表为过氧化氢，后者的代表为联苯胺系列的试剂，其氢，后者的代表为联苯胺系列的试剂，其反应的通式如下：反应的通式如下： AHAH2 2 H H2 2O O2 2 HA HA 2H2H2 2O O 供氢体供氢体 供氢体的氧化物供氢体的氧化物 当最后形成供氢体的氧化物时，一当最后形成供氢体的氧化物时，一些供氢体的氧化物会呈色，主要是外源些供氢体的氧化物会呈色，主要是外源性供氢体，如性供氢体，如DABDAB、TMBTMB。供氢体因氧化。供氢体因氧化而显色。目前多采用联苯胺系列的试剂而显色。目前多采用联苯胺系列的试剂作为供氢体，如作为供氢

33、体，如DABDAB、TMBTMB等。等。 2 2显示方法显示方法 （1 1）孵育液的配制：）孵育液的配制：孵育液孵育液：DAB4HCl 10mgDAB4HCl 10mg（底物显色剂）（底物显色剂）溶于蒸馏水溶于蒸馏水 5ml5ml0.2mol0.2molL L磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH6.5pH6.57.07.0） 5ml 5ml l lH H2 2O O2 2 0.1ml 0.1ml（底物）（底物）此种孵育液特别适于组织过氧化物酶的显示此种孵育液特别适于组织过氧化物酶的显示孵育液孵育液：DAB4HCl 5mgDAB4HCl 5mg（底物显色剂）（底物显色剂）0.05mol0.05molL

34、Tris-HClL Tris-HCl（pH7.6pH7.6） 10ml10ml1 1H H2 2O O2 2 0.1ml 0.1ml（底物）（底物）此种孵育液特别适于辣根过氧化物酶的显示此种孵育液特别适于辣根过氧化物酶的显示 （2 2）步骤：）步骤： 1 1）固定：）固定：44下，下，30min30min（3 3戊二醛戊二醛固定液：固定液：2020戊二醛戊二醛15ml15ml或或2525戊二醛戊二醛12ml12ml，0.2mol0.2molL L磷酸缓冲液或二甲胂酸磷酸缓冲液或二甲胂酸缓冲液缓冲液50ml50ml，蒸馏水加至，蒸馏水加至 100ml100ml）。）。 2 2）浸洗：用固定液中使

35、用的缓冲液）浸洗：用固定液中使用的缓冲液浸洗三次以上，每次浸洗三次以上，每次15min15min，或浸洗过夜；，或浸洗过夜； 3 3）冰冻切片，厚度为）冰冻切片，厚度为5 510um10um； 4 4）预孵育：室温下）预孵育：室温下101030min30min； 5 5）孵育液，室温，）孵育液，室温， 5 560min60min； 6 6）蒸馏水漂洗，亚甲蓝染核；）蒸馏水漂洗，亚甲蓝染核； 7 7）甘油明胶封片。）甘油明胶封片。 2. 2.结果与评价：一般结果与评价：一般DABDAB法酶活性阳法酶活性阳性部位呈棕褐色，性部位呈棕褐色，TMBTMB法反应呈深蓝色。法反应呈深蓝色。 3.3.对照：

36、去对照：去H H2 2O O2 2。 4. 4.生物学意义生物学意义 过氧化物酶是一种氧过氧化物酶是一种氧化还原酶。与过氧化氢酶、细胞色素氧化化还原酶。与过氧化氢酶、细胞色素氧化酶有相似的化学本质，即都属于血红素类酶有相似的化学本质，即都属于血红素类蛋白质，它们都有相同的辅基，即铁卟啉。蛋白质，它们都有相同的辅基，即铁卟啉。过氧化物酶和过氧化氢酶的催化机制是相过氧化物酶和过氧化氢酶的催化机制是相似的，都可使过氧化氢分解，且两者都存似的，都可使过氧化氢分解，且两者都存在于过氧化物酶体之中。在于过氧化物酶体之中。 但两者也有差别：但两者也有差别： 过氧化氢酶：过氧化氢酶：催化催化H H2 2O O

37、2 2，生成水，并，生成水，并释放出释放出O O2 2，实际上是一种氧化还原反应，实际上是一种氧化还原反应，供氢体和受氢体都是过氧化氢。即一分子供氢体和受氢体都是过氧化氢。即一分子H H2 2O O2 2被氛化成被氛化成O O2 2，而另一分子，而另一分子H H2 2O O2 2 则被还则被还原成水：原成水： 过氧化氢酶过氧化氢酶 H H2 2O O2 2 + H + H2 2O O2 2 2H 2H2 2O + 2OO + 2O2 2 过氧化物酶：过氧化物酶：H H2 2O O2 2还原，并直接氧化还原，并直接氧化酚类和胺类等作用物：酚类和胺类等作用物： 过氧化物酶过氧化物酶 R + HR

38、+ H2 2O O2 2 RO + H RO + H2 2O O 过氧化物酶过氧化物酶 RHRH2 2 + H + H2 2O O2 2 R + 2H R + 2H2 2O O 供氢体供氢体 受氢体受氢体 被氧化被氧化 还原成水还原成水七、琥珀酸脱氢酶七、琥珀酸脱氢酶 在生物代谢过程中，氧化还原反应主在生物代谢过程中，氧化还原反应主要是由氧化还原酶或脱氢酶催化的。这种要是由氧化还原酶或脱氢酶催化的。这种氧化还原反应主要是由氢的供体把氢原子氧化还原反应主要是由氢的供体把氢原子转移到氢的受氢体的酶促反应，即称脱氢转移到氢的受氢体的酶促反应，即称脱氢酶反应。酶反应。 1. 1.四唑盐法证明法四唑盐法

39、证明法 四唑盐法是色素法的一种。四唑盐为四唑盐法是色素法的一种。四唑盐为水溶性物质，易溶于水，具淡黄色或褐色，水溶性物质，易溶于水，具淡黄色或褐色，当其被酶作用而还原后，则变成难溶于水当其被酶作用而还原后，则变成难溶于水的蓝色或紫蓝色的甲的蓝色或紫蓝色的甲 或二甲或二甲 。 四唑盐作为脱氢酶反应中的受氢体，四唑盐作为脱氢酶反应中的受氢体，反应中由脱氢酶将底物的氢原子，经过黄反应中由脱氢酶将底物的氢原子，经过黄素系的吩嗪甲基硫酸酯（素系的吩嗪甲基硫酸酯（PMSPMS）和辅酶）和辅酶Q Q等等中间递体，转移到四唑，而形成有色的中间递体，转移到四唑，而形成有色的甲甲 ，沉积于酶所在部位。，沉积于酶所

40、在部位。 （1 1）孵育液的配制）孵育液的配制0.05mol0.05mol琥珀酸钠琥珀酸钠 1.0ml1.0ml（底物）（底物）0.02mol0.02mol磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH7.4pH7.4） 1.0ml1.0ml（缓冲液）（缓冲液）0.20.2NBT 2.5mlNBT 2.5ml （捕获剂，受氢体）（捕获剂，受氢体）蒸馏水蒸馏水 0.5ml0.5ml （2 2）方法与步骤）方法与步骤1 1）固定：琥珀酸脱氢酶对固定剂的耐受性）固定：琥珀酸脱氢酶对固定剂的耐受性甚弱；预冷的甚弱；预冷的2 2甲醛固定甲醛固定5min5min后进行冰冻后进行冰冻切片；切片；2 2）固定后需充分洗涤；）固

41、定后需充分洗涤；3 3）孵育液中在暗处进行孵育，固定后的组）孵育液中在暗处进行孵育，固定后的组织在室温下孵育织在室温下孵育101040min40min，末固定的组织，末固定的组织则在则在44下孵育下孵育1 12h2h；4 4）孵育后的处理：水洗，晾干，观察。）孵育后的处理：水洗，晾干，观察。 （3 3）结果与评价）结果与评价 阳性反应产物呈阳性反应产物呈细小的紫蓝色颗粒，见于胞质，定位于细小的紫蓝色颗粒，见于胞质，定位于线粒体。线粒体。 （4 4）对照）对照 反应液中去除琥珀酸，反应液中去除琥珀酸，反应为阴性，或在反应液中加入丙二酸反应为阴性，或在反应液中加入丙二酸盐（盐（101040um40

42、um），则），则SDHSDH可受到特异性抑可受到特异性抑制。制。 2. 2.铁氰化物还原法铁氰化物还原法 是在含有铁氰化是在含有铁氰化物的底物混合液中，铁氰化物接受由脱氢物的底物混合液中，铁氰化物接受由脱氢酶作用而游离出来的氢，并与之结合而形酶作用而游离出来的氢，并与之结合而形成亚铁氰化物，该物不溶于水，并以高电成亚铁氰化物，该物不溶于水，并以高电子密度的亚铁氰化铜沉着于酶活性所在部子密度的亚铁氰化铜沉着于酶活性所在部位。位。 琥珀酸琥珀酸 延胡索酸延胡索酸 琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶 CuCu2+2+Fe(CN)Fe(CN)6 63-3- Fe(CN) Fe(CN)6 64-4- Cu Cu2

43、 2Fe(CN)Fe(CN)6 6高铁氰化物高铁氰化物 亚铁氰化物亚铁氰化物 亚铁氰化物亚铁氰化物 （1 1）孵育液的配制）孵育液的配制琥珀酸钠琥珀酸钠 100mg100mg（底物）（底物）0.1mol0.1mol磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（Ph7.0Ph7.0）13ml13ml（缓冲液）（缓冲液）0.1mol0.1molL L柠檬酸钠柠檬酸钠 0.6ml0.6ml（螯合剂）（螯合剂）30mmol30mmolL L硫酸铜硫酸铜 2ml2ml（捕获剂）（捕获剂）5mmol5mmolL L铁氰化钾铁氰化钾 2ml2ml（受电子体）（受电子体）蔗糖蔗糖 2 23g3g（和缓剂）（和缓剂）DMSO 1.5

44、mlDMSO 1.5ml（促溶剂）（促溶剂）蒸馏水加至（蒸馏水加至（pH7.0pH7.0） 20ml20ml（pH7.0pH7.0） （2 2）方法与步骤：）方法与步骤：1 1）固定、洗涤及切片：与光镜相同；）固定、洗涤及切片：与光镜相同；2 2）孵育：室温）孵育：室温 303045min45min；3 3）预冷缓冲液洗涤）预冷缓冲液洗涤30min30min左右；左右；4 4）四氧化锇后固定）四氧化锇后固定10min10min；5 5）脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，铅）脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，铅染色，电镜观察。染色，电镜观察。 （3 3）结果与评价：亚铁氰化铜沉着）结果与评价：亚铁氰化铜

45、沉着处呈高电子密度。为了增强酶反应和缩处呈高电子密度。为了增强酶反应和缩短反应时间，可在孵育液中加入短反应时间，可在孵育液中加入 3 35 5DMSODMSO。八、乳酸脱氢酶八、乳酸脱氢酶 LDHLDH NAD NAD+ +乳酸乳酸NADHNADHH H+ +丙酮酸丙酮酸 1. 1.光镜显示光镜显示LDHLDH的四唑盐法的四唑盐法 （1 1）原理）原理 氢从反应生成的氢从反应生成的NADHNADH，通，通过受氢体过受氢体 PMSPMS供给四唑盐，被还原的四唑供给四唑盐，被还原的四唑盐形成不溶性甲盐形成不溶性甲 ，可进行观察。，可进行观察。 （2 2）孵育液的配制）孵育液的配制0.20.2NBT

46、 1mlNBT 1ml（捕获剂，受氢体）（捕获剂，受氢体）0.70.7NAD+ 1mlNAD+ 1ml（递电子体）（递电子体）0.270.27PMS 1mlPMS 1ml（递电子体）（递电子体）19.219.2乳酸锂乳酸锂 1ml1ml（底物）（底物）0.1mol Tris0.1mol Tris盐酸盐酸 1ml1ml（缓冲液）（缓冲液）蒸馏水蒸馏水 4ml4ml （3 3）方法与步骤）方法与步骤l l）预冷的）预冷的 2 2多聚甲醛（多聚甲醛（0.1mol PBS0.1mol PBS缓冲，缓冲，pH7.4pH7.4）灌注固定灌注固定 5min5min；2 2）冷）冷PBSPBS灌流冲洗固定液；

47、灌流冲洗固定液；3 3）取所需的脏器，如肝组织切成）取所需的脏器，如肝组织切成3mm3mm3mm3mm3mm3mm，用，用PBSPBS洗三次；洗三次；4 4）振荡切片机或冷冻切片机切成）振荡切片机或冷冻切片机切成5um5um切片，贴于涂有切片，贴于涂有卵蛋白的载玻片上；卵蛋白的载玻片上；5 5）在上述孵育液中，于暗处反应）在上述孵育液中，于暗处反应30min30min，室温；，室温；6 6）常规处理：洗涤、脱水、甘油明胶封固、镜检。）常规处理：洗涤、脱水、甘油明胶封固、镜检。 （4 4）结果与评价）结果与评价 酶反应阳性部位酶反应阳性部位被染成蓝色（被染成蓝色（NBTNBT法）。法）。LDHL

48、DH分布在所有分布在所有肝细胞胞质内呈弥散状。肝细胞胞质内呈弥散状。 LDHLDH对固定剂对固定剂的耐受性较好，因此，采用先固定后孵的耐受性较好，因此，采用先固定后孵育的方法，达到既保存结构，又防止酶育的方法，达到既保存结构，又防止酶扩散的目的。扩散的目的。 2 2电镜镜显示方法电镜镜显示方法 （1 1）孵育液的配制）孵育液的配制0.1mol0.1mol磷酸缓冲液磷酸缓冲液PH7.4 1.6mlPH7.4 1.6ml（缓冲液）（缓冲液）0.5M0.5M酒石酸钾钠酒石酸钾钠 6ml6ml（螯合剂）（螯合剂）7.57.5硫酸铜硫酸铜 0.7ml 0.7ml 一滴滴加入（捕获剂）一滴滴加入（捕获剂）5M5M乳酸钠乳酸钠 1ml1ml（底物）（底物）NADNAD+ + 5mg 5mg（递电子体）（递电子体）DMSO 1.5mlDMSO 1.5ml（促溶剂）（促溶剂）用用1