生物化学原理杨荣武蛋白质的结构与功能-第5部分ppt课件

1、蛋白质的性质及研讨方法蛋白质的性质及研讨方法肌红蛋白晶体蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质紫外吸收：最大吸收峰为280nm两性解离：蛋白质的pI值不能直接计算，只能运用等电聚焦等方法进展测定胶体性质沉淀反响：盐析、pI 沉淀、有机溶剂引起的沉淀和重金属盐作用呵斥的沉淀变性、复性水解颜色反响蛋白量变性L 蛋白质遭到某些理化要素的作用，其高级构造遭到破坏、生物活性随之丧失的景象。L 导致蛋白量变性的物理要素有：加热、冷却、机械作用、流体压力和辐射；化学要素有强酸、强碱、高浓度盐、尿素、重金属盐、疏水分子和有机溶剂。L 蛋白量变性以后，其理化性质发生一系列的变化。这些变化可以作为检测蛋白量变性的目的。

2、主要的变化包括：1溶解度降低。2粘度添加。3生物活性丧失。4更容易被水解。5结晶行为发生变化。蛋白质的水解L 蛋白质在强酸、强碱或蛋白酶的催化下均可以发生水解。但需求留意的是，酸水解会破坏几种氨基酸，特别是Trp几乎全部被破坏，其次是三种羟基氨基酸。另外Gln和Asn在酸性条件下，容易水解成Glu和Asp。酸水解常用硫酸或盐酸，运用最广泛的是盐酸；碱水解会导致多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且产生消旋景象，但不会破坏Trp；酶水解效率高、不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，但由于不同的蛋白酶对肽键特异性不一样，因此，由一种酶水解获得的通常是蛋白质的部分水解产物。四种羧肽酶来源和特异性四种羧肽酶来源

3、和特异性几种蛋白酶特异性的比较几种蛋白酶特异性的比较反应名称反应试剂颜色用处双缩脲反应硫酸铜，碱性溶液紫红色（540nm）定量测定蛋白质黄色反应硝酸先产生白色沉淀，加热变黄，再加碱呈橙黄色鉴定含有芳香族氨基酸的蛋白质米伦氏反应硝酸、硝酸汞、亚硝酸、亚硝酸汞混和液先是白色沉淀，加热后变成红色鉴定含有Tyr残基的蛋白质乙醛酸反应乙醛酸、浓硫酸紫色环鉴定含有Trp残基的蛋白质坂口反应次氯酸钠、-萘酚、氢氧化钠红色鉴定含有Arg的蛋白质福林反应磷钼酸、磷钨酸蓝色Lowry法鉴定含有Tyr残基的蛋白质醋酸铅反应醋酸铅黑色含有Cys的蛋白质考马斯亮蓝结合反应考马斯亮蓝G-250酸性溶液蓝色Bradford

4、法定量测定蛋白质蛋白质的各种颜色反响蛋白质的各种颜色反响蛋白质研讨方法假定他发现一种新的蛋白质：蛋白质假定他发现一种新的蛋白质：蛋白质X1. 如何得到这种蛋白质如何得到这种蛋白质? 蛋白质的分别、纯化技术蛋白质的分别、纯化技术2. 这种蛋白质的大小？这种蛋白质的大小？ SDS-PAGE3.它的它的pI是多少？是多少？ 等电聚焦等电聚焦4. 其他细胞或其他生物体内能否存在？其他细胞或其他生物体内能否存在？ Western印迹印迹5. 其一级构造如何？其一级构造如何？ 序列分析序列分析6.其三维构造又如何？其三维构造又如何？ X-射线衍射和核磁共振射线衍射和核磁共振蛋白质纯化蛋白质纯化一、预备任务

5、 要处理三个问题：1纯化蛋白质的目的；2目的蛋白的测活方法；3纯化蛋白质的原料。二、纯化步骤：1破碎细胞或组织混合和匀浆；2去除残渣离心；3沉淀/浓缩硫酸铵或聚乙二醇；4纯化层析；5鉴定等电聚焦需求在凝胶中参与两性电解质，以在阳极和阴极之间建立递增的pH梯度，处在其中的蛋白质分子在电场的作用下迁移，最后各自挪动到并聚焦于与其pI相当的pH位置上。于是经过等电聚焦，不仅可以实现pI不同的蛋白质之间的分别，而且还可以测定出各种蛋白质的pI蛋白质的双向电泳蛋白质的双向电泳Western印迹蛋白质一级构造的测定 直接测定法 间接测定法。 先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列，然后根据通用的遗传密码表间接

6、推导出由其决议的氨基酸序列。测定步骤主要试剂和方法备注1详见蛋白质的纯化2极端pH；8mol/L 尿素；6mol/L 盐酸胍；高盐 (常用硫酸氨)。如果肽链之间以二硫键相连，可使用步骤3的方法进行拆分。3过甲酸氧化法；巯基类还原剂还原法：巯基乙醇；二硫苏糖醇（DTT）或二硫赤藓糖醇。第二种方法需要使用烷基化试剂，如碘代乙酸，防止二硫键从新形成。4氨基酸自动分析仪为步骤6和7选择合适的裂解法提供有用的信息。5N-端测定：Sanger试剂法；丹磺酰氯法；PTIC或其衍生物测定法。C-端测定：肼解法；还原法：使用硼氢化纳将C-端氨基酸残基转变成氨基醇，而将它与其它氨基酸区别开来。羧肽酶法（羧肽酶A、B，参考表4-2）如果N-端氨基被封闭，不能直接使用表中的方法，需要根据可能的封闭类型，区别对待。如果氨基是被甲酰或乙酰化封闭的，需要先将甲酰基或乙酰基水解。如果氨基是被焦谷氨酰化封闭的，可以使用专门水解焦谷氨酸残基的焦谷氨