基因操作原理display基因展示技术

1、会计学1基因操作原理基因操作原理display基因展示技术基因展示技术第1页/共109页通常是指通过遗传操作将外源大分子定位表达在微生物细胞表面以便直接利用全细胞进行后续工作而无须基因产物的 提取、纯化、和重新折叠等操作一、微生物细胞表面展示 Microbial cell surface display, MCSD微生物细胞表面展示微生物细胞表面展示第一部分第1页/共109页第2页/共109页MCSD主要以构建融合蛋白方式来实现即将外源蛋白与菌体的某一表面蛋白相融合借助后者的表面识别和表面定位功能将前者携带并定位在细胞表面前者称为乘客蛋白，后者称为运载蛋白即将外源蛋白与菌体的某一表面蛋白相融合

2、借助后者的表面识别和表面定位功能将前者携带并定位在细胞表面前者称为乘客蛋白，后者称为运载蛋白第2页/共109页第3页/共109页宿主菌细菌和酵母菌展示了病原菌的抗原表位、多聚组氨酸肽、蛋白质文库、金属硫蛋白、多种酶类、多种单链抗体和T细胞受体的信号分子运载蛋白膜蛋白、附属结构蛋白、粘附蛋白、凝集素、以及S-层蛋白等宿主菌细菌和酵母菌展示了病原菌的抗原表位、多聚组氨酸肽、蛋白质文库、金属硫蛋白、多种酶类、多种单链抗体和T细胞受体的信号分子运载蛋白膜蛋白、附属结构蛋白、粘附蛋白、凝集素、以及S-层蛋白等第3页/共109页第4页/共109页第4页/共109页第5页/共109页二、微生物细胞表面展示技

3、术的应用二、微生物细胞表面展示技术的应用MCSD技术广泛应用于生物工程领域，可开发和利用来进行蛋白构象的分析、活菌疫苗的研制、临床诊断、表面抗原的直接克隆、以及抗体工程应用等。1. 1. 构建和筛选蛋白质文库构建和筛选蛋白质文库 2. 2. 开发活菌体疫苗，制备抗血清和多克隆抗体开发活菌体疫苗，制备抗血清和多克隆抗体 3. 3. 构建全细胞催化剂构建全细胞催化剂4 4开发新型微生物吸附剂开发新型微生物吸附剂5 5研制新型生物传感器研制新型生物传感器第5页/共109页第6页/共109页三、举例Display of Poly-His Peptides on Escherichia coli Cel

4、l Surface在大肠杆菌细胞表面展示多聚组氨酸肽第6页/共109页第7页/共109页Schematic Presentation of E. coli OmpC LQ 位点含PstI位点第7页/共109页第8页/共109页GATAGATACCTGCAGGTCGACCCAAGCGGACATCACCATCATCACCATTCTGGTCTCGAGGATATCCTGCAGTTGGCTATCTATGGACGTCCAGCTGGGTTCGCCTGTAGTGGTAGTAGTGGTAAGACCAGAGCTCCTATAGGACGTCAACCPoly(His)6XhoIPstIPstISalIL Q V D P

5、 S GS G L E D I L Q GATAGATACCTGCAGGTCGACCCAAGCGGACATCACCATCATCACCATTCTGGTCTCGAGGATATCCTGCAGTTGGCTATCTATGGACGTCCAGCTGGGTTCGCCTGTAGTGGTAGTAGTGGTAAGACCAGAGCTCCTATAGGACGTCAACCGTCGACCAGCTGCTCGAGGAGCTCGTCGAGCAGCTCCTCGACGAGCTGSalIXhoIXhoIPstIPstISalI第8页/共109页第9页/共109页第9页/共109页第10页/共109页Sequence Inserted i

6、nto OmpC L7第10页/共109页第11页/共109页Expression of OmpC-(6His)n at 30 CNo.StrainsOmpC or its derivatesFraction (%)1MC4100OmpC26.62MC4100(pTCdP)OmpC49.73MC4100(pTCHP1)OmpC-(6His)134.74MC4100(pTCHP2)OmpC-(6His)233.15MC4100(pTCHP3)OmpC-(6His)332.86MC4100(pTCHP6)OmpC-(6His)626.76Fraction of OmpC or its deriva

7、tes of the total outer membrane proteins123456第11页/共109页第12页/共109页Expression of OmpC-(6His)n at 25 CFraction of OmpC or its derivates of the total outer membrane proteinsNo.StrainsOmpC or its derivatesFraction (%)1MC4100(pTCHP6)OmpC-(6His)629.92MC4100(pTCHP12)OmpC-(6His)1210.2612第12页/共109页第13页/共109页

8、Interaction Between Neighboring Histidines and Ni-NTA Agarose Each Ni2+ require six pairs of electrons to form a stable coordination sphere around; four of them are available from NTA, and two of the other two are expected from neighboring histidines.NTA: nitrilotriacetic acid 次氮基三乙酸第13页/共109页第14页/共

9、109页Ni-NTA-Agarose Surface bound cells of (a) MC4100(pTCHP2) and (b) MC4100(pTCHP3)Attachment to Ni-NTA-Agarose beads碘化丙锭 染色细胞, 543nm氦/氖激光， 570nm 光栅 第14页/共109页第15页/共109页Attachment to Ni-NTA-Agarose beadspTCdPpTCHP1pTCHP2pTCHP12pTCHP6pTCHP3第15页/共109页第16页/共109页 All recombinant cells could attach to th

10、e surface of Ni-NTA-Agarose Poly-His peptides were exposed successfullybeads, except MC4100(pTCHP18)第16页/共109页第17页/共109页Cd2+ Adsorption of MC4100(pTCHPn) The adsorption capacity increased along with the increasing MC4100(pTCHPn) can be used as bioadsorbents.number of 6His units.0510152025303540pTCdP

11、pTCHP1pTCHP2pTCHP3pTCHP6mols Cd2+ adsorbed per gram cell dry weight15.318.923.926.132.0第17页/共109页第18页/共109页三、三、S-S-层蛋白用于表面展示层蛋白用于表面展示第18页/共109页第19页/共109页细菌表面S-层 细胞膜细胞壁S-层Cell surface layerS-layer第二部分 细菌细胞表面S层简介第19页/共109页第20页/共109页一、S-layer 的分布广泛存在于许多古细菌和真细菌的细胞最外表面在绝大多数古细菌当中，S层是细胞唯一的外壁层在所有的主干细菌类群中的几百

12、个种中都检测到对于发现S-层的某个种来说，并不是每一个分离株都存在S-层尽管S-layer分布广泛，但其存在在相当长一段时间内并没有引起人们的重视因为 S-layer 在实验室培养过程中容易丢失，Freeze-etching electron microscopy 能观察到第20页/共109页第21页/共109页S-层可在细胞生长的所有阶段完全覆盖在细胞表面二、S-层的结构和组成由蛋白质或糖蛋白构成的单分子晶格状的聚合层由蛋白质或糖蛋白构成40kDa-200kDa50 nm第21页/共109页第22页/共109页G- 古细菌G+ 细菌G- 真细菌第22页/共109页第23页/共109页第23页

13、/共109页第24页/共109页a. 嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius(古细菌); b. 杀鲑气单胞菌(G-); c. 苏云金芽胞杆菌(G+)。PM, 质膜; PG,肽聚糖层；OM, 外膜；CW, 细胞壁；S, S-层。内标50nm。第24页/共109页第25页/共109页完整细胞表面覆盖5105 单体 500copies 单肽/秒 合成，转运至细胞表面，组装成晶格结构 Generation time: 20-30minS-层蛋白的启动子是非常强的Lactobacillus acidophilus (嗜酸乳酸杆菌)S-层蛋白的启动子乳酸脱氢酶基因启动子的两倍 (

14、是细菌中最强启动子之一)第25页/共109页第26页/共109页炭疽芽胞杆菌Sap蛋白由814aa组成含N-末端29aa信号肽，其SLH位于N-末端200aa以内，通过该SLH已使聚蔗糖果聚糖酶成功地在细胞表面得到表达其表达的分子数与细胞表面S-层中S-层蛋白的分子数相当第26页/共109页第27页/共109页四、S-层的应用前景人们对S-层的应用潜力寄予厚望在生物技术和仿生学方面 1. S-层可开发成超滤膜分子筛2. S-层在开发疫苗方面具广阔前景与特异性抗原或半抗原结合可作为佐剂系统加以使用3. 提高脂膜的稳定性通过S-层蛋白在脂膜上重结晶成S-层，可明显提高脂膜的稳定性，便于研究膜蛋白的

15、生物学功能第27页/共109页第28页/共109页4. S-层在纳米材料方面有巨大应用潜力S-层可作为形成有序排列的纳米金属或半导体材料的模板; 这些具有特殊物理性质的材料可广泛用于纳米电子学和非线性光学的研究5. 细胞表面展示Cell surface displayS-层是一个极有前途的、可用于细胞表面定位表达蛋白质的展示系统S-层蛋白表达量高，可达细胞蛋白的15%，而且可有效地与细胞壁结合第28页/共109页第29页/共109页第三部分 利用S-层蛋白进行表面展示的基因操作一、S-层蛋白的基因克隆 苏云金芽胞杆菌苏云金芽胞杆菌 ，具杀虫活性，具杀虫活性第29页/共109页第30页/共109

16、页苏云金芽胞杆菌苏云金芽胞杆菌一种细菌广泛存在于土壤等自然环境简称 苏云金杆菌 或 BtBacillus thuringiensis第30页/共109页第31页/共109页伴胞晶体第31页/共109页第32页/共109页(kDa)20011697.466453121.5SDS-PAGE profile of crystal protein of Bacillus thuringiensis CTC and T02 strainM CTC T02 M苏云金芽胞杆菌苏云金芽胞杆菌 CTC第32页/共109页第33页/共109页测定测定 CTC 蛋白蛋白 ( 100kDa )第一次：A G K S

17、F P D V P A D H W G I第二次：A G K S F P D V(P)A Primer design CTC-46 GCA GGA AAA TCA TTC CCA GAC GTT C第33页/共109页第34页/共109页Digested CTC DNA with various restriction enzymesSouthern hybridization to CTC DNA(DIG-labeling)Kb ladder第34页/共109页第35页/共109页Restrict location of ctc gene9.0kb HpaII9.5kb EcoRI以9.0k

18、b HpaII和9.5kb EcoRI为目标构建文库第35页/共109页第36页/共109页E.coil X-Blue (pBMB982) 重组E.coil 生长艰难 易于自溶构建亚基因组文库以基因组中某些DNA片段为目标所构建的DNA 文库但在以9.0kb HpaII和9.5kb EcoRI为目标构建的文库中，得不到阳性克隆子第36页/共109页第37页/共109页表达S-layer蛋白的E.coli第37页/共109页第38页/共109页3.1kb ClaI2.9kb XbaIX 2814082bp EcoRI-ClaIpBMB982第38页/共109页第39页/共109页第一个来自苏云金

19、芽胞杆菌的第一个来自苏云金芽胞杆菌的S-层蛋白基因层蛋白基因(Sara et al, J. Bacteriol, 2000)DNA Sequencing EcoRI / ClaI fragment The 4082 bp sequenced 816 aa encoding capability GenBank AJ012290 第39页/共109页第40页/共109页 3141 ATTAAAGAAG TAAAAGAAGT AAAATAATAA TTATTAAAGC I K E V K E V K - - 3181 CTATGAGAAA ATAGACAAAA GTCTATGAGT ATCATAG

20、GCT 3221 TTTTATTTTG ATCTTATTTC ATATATATTT TAGATTGAAG 第40页/共109页第41页/共109页第41页/共109页第42页/共109页X 2814082bp EcoRI-ClaIpBMB982Cloning of ctc-2 gene第42页/共109页第43页/共109页ClaI: 3.1kb 2.9kb 第43页/共109页第44页/共109页ClaI 2.9kb in pKS 第44页/共109页第45页/共109页ClaIClaIClaIctc-2 genectc-1 geneFull length ctc-2 gene ?第45页/

21、共109页第46页/共109页Problem 1 ClaI -ctc-2 gene (2.9kb) can not be recovered 第46页/共109页第47页/共109页ATCGATCGTGCTTCTGCAGCTGTAATCTTCACClaIDam methylation site ClaI is sensitive to methylation第47页/共109页第48页/共109页GM2163: dam- dcm-VJS987: dam-Purify plasmid from dam- E. coli第48页/共109页第49页/共109页ClaIClaIClaIctc-2 g

22、enectc-1 geneProblem 2 ctc-1 gene can not be recovered at its 3-end 第49页/共109页第50页/共109页实际使用pIJ2925第50页/共109页第51页/共109页ATCGATTAGCTAGTCGACCAGCTGClaIAccIATCGACTAGCTGligation第51页/共109页第52页/共109页ATCGACCGGCATGCAAGCTTTAGCTGGCCGTACGTTCGAASphIHindIIISphIATCGACCGGCATG CAAGCTTTAGCTGGCC GTACGTTCGAAKlenow / dAT

23、PATCGA CAAGCTTTAGCTGGCC AAMung Bean Nuclease第52页/共109页第53页/共109页ATCGA CAAGCTTTAGCTGGCC AAMung Bean NucleaseATCGA TTTAGCT AAligationATCGATTTAGCTAARecovering ClaI第53页/共109页第54页/共109页8611/ClaI K23/ ClaI第54页/共109页第55页/共109页二、表达载体 稳定 安全 高效表达（一）质粒复制区的克隆（一）质粒复制区的克隆利用利用Bt 内源质粒的复制片段作为内源质粒的复制片段作为载体稳定因素载体稳定因素第

24、55页/共109页第56页/共109页任何一个质粒都含有一段与复制有关的区域，包括1. 复制起点and/or2. 复制蛋白复制起始蛋白基因and/or 3. 其他任何一个质粒的复制有宿主特异性如在Gram+ / Gram- 有差异第56页/共109页第57页/共109页Gram+ 细菌质粒复制区克隆载体Ori /E.coliAmp 抗性基因 (E.coli or Gram)Sp 壮观霉素抗性基因( Gram)1. ori 9741 GenBank AF202532 2. ori 2062 GenBank AF050161第57页/共109页第58页/共109页cry3AapBMB608pBMB

25、685稳定性为 99.5%无抗生素选择压力40代 stability test*以内源质粒为基础的质粒载体以内源质粒为基础的质粒载体 在无选择压力的情况下，能够稳定遗传在无选择压力的情况下，能够稳定遗传第58页/共109页第59页/共109页（二）解离载体的构建（二）解离载体的构建Res tnpI tnpATn4430转座子通过体内重组通过体内重组可去掉非可去掉非 Bt DNA Bt DNA 片段片段解决环境释放安全问题解决环境释放安全问题第59页/共109页第60页/共109页cry geneoriBtresresermamporiEccry geneoriBtresresermampori

26、Ec受体菌中受体菌中发生解离发生解离TnpI只能在苏云金芽胞杆菌中复制只能在苏云金芽胞杆菌中复制 只能在大肠杆菌中复制只能在大肠杆菌中复制 解离载体的解离解离载体的解离第60页/共109页第61页/共109页第61页/共109页第62页/共109页IRSIRS第62页/共109页第63页/共109页解离载体解离载体pBMB801的构建及解离的构建及解离resolution第63页/共109页第64页/共109页ori/tsTcori/EAmptnpI tnpA2. 整合在染色体整合在染色体 转座子整合载体转座子整合载体第64页/共109页第65页/共109页三、S-层蛋白用于表面展示的前景信号

27、肽SLH 锚定序列第65页/共109页第66页/共109页1 1六聚组氨酸肽六聚组氨酸肽Poly(His)Poly(His)6 6 Poly(His)6)对重金属二价阳离子如镉(Cd2+)、镍(Ni2+)、铜(Cu2+)、锌(Zn2+)和铅(Pb2+)等具有螯合(吸附)作用, 可用于重金属污水处理目前几乎所有的表达重金属结合能力的细菌都限定在大肠杆菌第66页/共109页第67页/共109页成功的重组菌在固定化之后在重金属污水处理方面，以及重金属矿物富集方面将有重要的应用潜力金属硫蛋白具有相似作用第67页/共109页第68页/共109页ctc-(6His)n融合基因的构建第68页/共109页第6

28、9页/共109页6His PCR产物电泳图1 2 31，100bp Ladder；2，3，6His PCR产物第69页/共109页第70页/共109页PvuIIPCRXbaI PvuII EcoRIXbaIHincIISphIEcoRIXbaISphIEcoRIKpnIBamHIXbaISalISphIslhXbaI(6His)slh(6His)1slh(6His)1pBMB-982pHT304重组质粒pBMB-SHA1构建示意图pBMB-SHA1第70页/共109页第71页/共109页重组质粒pBMB-SHB1构建示意图XbaI(6His)XbaIPCRXbaI XbaI XbaIpBMB9

29、82-304slh(6His)1pBMB-SHB1第71页/共109页第72页/共109页 slh(6His)1EcoRISalIXhoI slh(6His)1EcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRI+SalIEcoRISalIXhoIEcoRI+ XhoIEcoRISalIXhoIctc-(6His)2融合基因的构建 slh(6His)2EcoRISalIXhoI slh(6His)1EcoRISalIXhoIEcoRI+ XhoIEcoRI+ SalIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIctc-(6His)3融合基因的构建第7

30、2页/共109页第73页/共109页EcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIctc-(6His)1 ctc-(6His)2 ctc-(6His)3 ctc-(6His)6 ctc-(6His)9 ctc-(6His)15ctc-(6His)12 ctc-(6His)18ctc-(6His)n融合基因构建示意图第73页/共109页第74页/共109页1 2 3 4 5 6 7 8重组质粒pBMB-SHAn酶切验证电泳图1，/Hin

31、dIII分子量标准2，pBMB-SHA18/ClaI+XhoI3，pBMB-SHA12/ClaI+XhoI4，pBMB-SHA6/ClaI+XhoI5，pBMB-SHA3/ClaI+XhoI6，pBMB-SHA2/ClaI+XhoI7，pBMB-SHA1/ClaI+XhoI8，100bp Ladder第74页/共109页第75页/共109页重组质粒pBMB-SHBn酶切验证电泳图1 2 3 4 5 6 71，/HindIII分子量标准；2，pBMB-SHB15/ClaI+XhoI；3，pBMB-SHB9/ClaI+XhoI；4，pBMB-SHB3/ClaI+XhoI；5，pBMB-SHB2/C

32、laI+XhoI；6，pBMB-SHB1/ClaI+XhoI7， 100bp Ladder第75页/共109页第76页/共109页第76页/共109页第77页/共109页1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8 重组质粒pBMB-SHAn在171中表达的SDS-PAGE1，分子量标记；2，171/pBMB-CSA；3，171/ pBMB-SHA1；4，171/ pBMB-SHA2；5，171/ pBMB-SHA3；6，171/ pBMB-SHA6；7，171/ pBMB-SHA12；8，171/ pBMB-SHA18第77页/共109页第78页/共109页1 2 3 4 5

33、 6 7 重组质粒pBMB-SHBn在4Q7中表达的SDS-PAGE1 2 3 4 5 6 71，4Q7/pBMB-CSA；2，4Q7/ pBMB-SHB15；3，4Q7/ pBMB-SHB9； 4，4Q7/ pBMB-SHB3；5，4Q7/ pBMB-SHB2；6，4Q7/ pBMB-SHB1；7，分子量标记。第78页/共109页第79页/共109页第79页/共109页第80页/共109页CTC-（6His）n融合蛋白对镍离子的吸附检测表达了CTC-（6His）n融合蛋白的重组菌与Ni-NTA-Agarose 吸附作用用碘化丙锭对细胞染色荧光显微镜观察使用波长为532nm第80页/共109页

34、第81页/共109页Interaction Between Neighboring Histidines and Ni-NTA Agarose 第81页/共109页第82页/共109页含质粒pBMB-SHAn的重组菌与Ni-NTA-琼脂糖微球的吸附作用A, 171/pBMB-CSA； B，171/pBMB-SHA1； C，171/pBMB-SHA2；D，171/pBMB-SHA3； E，171/pBMB-SHA6； F，171/pBMB-SHA12；G，171/pBMB-SHA18ABCDEFG第82页/共109页第83页/共109页含质粒pBMB-SHBn的重组菌与Ni-NTA-琼脂糖微球的

35、吸附作用A，4Q7/pBMB-CSA； B，4Q7/ pBMB-SHB1； C，4Q7/ pBMB-SHB2；D，4Q7/ pBMB-SHB3； E，4Q7/ pBMB-SHB9； F，4Q7/ pBMB-SHB15ABCDEF第83页/共109页第84页/共109页第84页/共109页第85页/共109页 重组菌对 Cd2+的吸附作用 Adsorption of Cd2+ by recombinant strains菌株StrainsCd2+吸附量(mg/L)Adsorption quantity ofCd2+(mg/L)Cd2+吸附量(Cd2+个数/细胞)Adsorption quanti

36、ty of Cd2+(number of Cd2+/cell)Cd2+吸附量(mol/g 菌体干重)Adsorption quantity of Cd2+(mol/g cell dry weight)宿主菌吸附量重组菌吸附量Adsorption quantity of hoststrain Adsorption quantityof recombinant strain171/pBMB-CSA10.2291.42021071.7167171/pBMB-SHA122.4833.12151073.77331 2.20171/pBMB-SHA223.6243.28001073.96481 2.311

37、71/pBMB-SHA324.4753.39811074.10771 2.39171/pBMB-SHA628.8314.00291074.83871 2.82171/pBMB-SHA1219.6532.72861073.29841 1.92171/pBMB-SHA1810.4051.44461071.74631 1.024Q7/pBMB-CSA9.99301.38741071.67714Q7/pBMB-SHB120.2122.80621073.39221 2.024Q7/pBMB-SHB221.8483.03341073.66681 2.194Q7/pBMB-SHB322.4123.11101

38、073.76141 2.244Q7/pBMB-SHB926.9303.73891074.51971 2.694Q7/pBMB-SHB1510.3591.43821071.73861 1.04第85页/共109页第86页/共109页系列1系列21 2 3 4 5 6 74107310721071107重组菌171/pBMB-SHAn和 4Q7/pBMB-SHBn对Cd2+的吸附作用系列1：1，171/pBMB-CSA； 2，171/pBMB-SHA1；3，171/pBMB-SHA2； 4，171/pBMB-SHA3；5，171/pBMB-SHA6；6，171/pBMB-SHA12； 7，171/

39、pBMB-SHA18系列2：1，4Q7/pBMB-CSA； 2，4Q7/pBMB-SHB1；3，4Q7/pBMB-SHB2； 4，4Q7/pBMB-SHB3；5，4Q7/pBMB-SHB9；6，4Q7/pBMB-SHB15第86页/共109页第87页/共109页但该蛋白为胞内蛋白，若在细胞表面表达可增强其抗病作用第87页/共109页第88页/共109页CGGCTCTAGACATGACCGTAAAGAAGCTTTAaii-up:aii-down:AGCTGCATGCCTATGTATACTCCGGGAACAXbaISphI以pGEMT-4Q7aii为模板第88页/共109页第89页/共109页ai

40、i基因及pBMB-SAII重组质粒PCR扩增产物电泳图 1 2 31，100bps Ladder；2，aii基因PCR产物；3，pBMB-SAII重组质粒PCR扩增产物第89页/共109页第90页/共109页XbaISphIslhpGEMT-4Q7aiiXbaI SphIaiipBMB982-304XbaI+SphIslhaiipBMB-SAII重组质粒pBMB-SAII的构建示意图第90页/共109页第91页/共109页pBMB-SAII质粒图谱第91页/共109页第92页/共109页重组质粒pBMB-SAII的酶切验证电泳图1 2 3 41，pBMB-SAII/HindIII；2，pBMB

41、-SAII/SphI；3，pBMB-SAII/XbaI；4，/HindIII 分子量标准第92页/共109页第93页/共109页重组质粒pBMB-SAII在4Q7中的表达1，4Q7/pBMB-CSA；2，分子量标准；3，4Q7/pBMB-SAII；4，CTC1 2 3 4携带ctc-aii融合基因重组菌 的构建第93页/共109页第94页/共109页胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1AI致病基因表达重组菌分解第94页/共109页第95页/共109页在马铃薯上重组菌4Q7/pBMB-SAII对胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1引发病灶的抑制作用3 42 14 13 23 42 1A B CA，B，C三个平板分别代表SCG1与待测菌株混合培养0.5h、2h、4h每个平板上 1为SCG1+无菌水