基因操作原理08

1、会计学1基因操作原理基因操作原理08第1页/共93页基因文库（Gene library）：由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体, 称之为基因文库。一个完全的基因文库，应该能够保证从中筛选到目的基因。 即 Genomic library第1页/共93页第2页/共93页1976年L.Clark, J.Carbon提出了一个完全的基因文库所需克隆的计算公式 n=ln(1-p)/ln(1-f)n: 一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数p: 所期望的目的基因在基因文库中出现的几率f: 插入片段的平均大小与基因组DNA大小的比值第2页/共93页第3页/

2、共93页哺乳动物 3109kb若p=99% 平均克隆片段20kb f=20kb/3109 n=690773.2E.coli 4639221bp p=99% f=20kb/4600kb n=1056.9 p=99% f=10kb/4600kb n=2116第3页/共93页第4页/共93页cDNA文库:若这些大量的重组DNA分子所含的外源DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA，它们所构成的重组DNA克隆群体，则称之为cDNA基因文库第4页/共93页第5页/共93页一、载体的选择第一节 基因组DNA文库的构建可装载的外源DNAPlasmi

3、d 10kb Phage 0-23kbCosmid 45kbBAC 100kbYAC 300kb-1.2Mb第5页/共93页第6页/共93页粘粒克隆所需的克隆子数是phage的一半，如需700000时，cosmid需350000个如无特殊需要(如单个phage不能包容靶基因片段或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克隆时)一般不采用cosmid，因其在构建文库和贮存文库比phage困难得多第6页/共93页第7页/共93页YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段BAC 可减少DNA分子间的重组第7页/共93页第8页/共93页1 phage vectors早期（70年代后期）使

4、用，如Charon 4A 和 gt-WES， 克隆1520kb目前用EMBL系列, 2001，DASH， Charon 38-40，GEM-11 等置换型载体，插入片段的最大值可达20-24kb第8页/共93页第9页/共93页选择载体要考虑的因素 易于从重组噬菌体中回收插入的外源DNA 易于制备两臂 载体的可知性，如序列，图谱 载体臂上的琥珀突变，利用特殊筛选系统 重组体中有活性的gam基因 载体臂上的chi序列第9页/共93页第10页/共93页2Cosmid vector所有cosmid vector均可用于构建文库，但建议尽量使用 pJB8和c2RB，因为经验较多，许多问题易于解决第10页

5、/共93页第11页/共93页二、用phage构建文库1总DNA的提取DNA初始长度应至少是用于克隆的片段的4倍，否则有效片段较少，因此DNA至少应大于100kb（cosmid200kb） 2载体臂的制备 购买 载体制备、纯化 限制酶消化 BamHI / EMBL XhoI / GEM-11第11页/共93页第12页/共93页载体臂的纯化（梯度离心：蔗糖 或NaCl） 梯度离心的收获量大，而agarose回收量小 回收无填充片段 聚乙二醇沉淀，除去碎片置换型载体coscosRLCentral stuffer第12页/共93页第13页/共93页3基因组DNA的消化 一般采用Sau3AI消化 回收2

6、0-24kb （ agarose法 or 梯度离心） 有些载体可做不完全补平4连接/包装 连接形成较长的多联体，包装成粘粒（4 6个月稳定）第13页/共93页第14页/共93页5扩增和保存重组phage可在E.coli中扩增，所得文库可被长时间利用和贮存，可用于多个不同基因的筛选6在宿主菌上形成噬菌斑7带有目的外源DNA序列的phage重组体的鉴定8对选出的重组phage进行噬斑纯化，再对外源DNA进行分析第14页/共93页第15页/共93页 载体的去磷酸化，提高连接和包装效率 双酶切消化载体 （EMBL系列，2001，XDASH，Charson 40,35,34）EMBL 3A: SalI

7、BamHI EcoRI - E1 B1-S1 连接反应中，应测定外源片段与载体的比例 phage 108pfu/g DNA若用BamHI和EcoRI双酶切，可用异丙醇沉淀或其它柱层析法去除小片段，使非重组体的数目降低2个数量级，结合其它方法如Spi筛选可再降低2-3个数量级第15页/共93页第16页/共93页 基因组DNA片段3凹端的不完全补平-GATC-CTAG- GATC-CTAG -Sau3AI-GA GATC-CTAG AG-KlenowdATP /dGTP-CTCGAG-GAGCTC-XhoIKlenowdCTP /dTTP-CTC TCGAG-GAGCT CTC-互补GEM-11基

8、因组DNAVector 第16页/共93页第17页/共93页三、重组体的筛选和分析 噬斑原位杂交将噬菌体以一定密度铺于平板，并影印到固相膜上要从哺乳动物DNA文库里筛选出目标基因，哺乳动物基因组复杂度为3109bp，必须筛选几十万个噬斑第17页/共93页第18页/共93页平皿直径 (mm)总面积(cm2)底层琼脂量 (ml)指示细菌量 (ml)顶层琼脂量 （ ml）噬 斑 最 大 数 目(噬 斑 数 /平 板 )9063.9300.12.515000150176.7800.36.550000不同大小的培养皿所能容纳的噬斑数目第18页/共93页第19页/共93页. 杂交筛选 用探针. 纯化. 分

9、析 /Southern杂交，酶切Sequencing/ 其它方法，如免疫学方法第19页/共93页第20页/共93页四、亚基因组文库的构建用基因组DNA的特定部分所构建的基因文库质粒 DNA，线粒体DNA, 特定限制性片段第20页/共93页第21页/共93页在有杂交探针的情况下，可通过Southern杂交，先找出目标基因所在的限制性片段的大小，然后用相应大小的限制性DNA片段构建出基因文库，这样可减少筛选的压力。第21页/共93页第22页/共93页例如 将基因组DNA用多种限制性内切酶切割， 通过Southern杂交 则 将SpeI切割的基因组DNA中的8.3kb片段回收，用于构建DNA文库发现

10、目标基因在8.3kb SpeI片段上第22页/共93页第23页/共93页哺乳动物 3109kb 若p=99% 平均20kb n=690773.2E.coli 4639221bp p=99% 平均10kb n=2134若用占 总DNA 1/10 区域的限制性片段, 则 n = 69075 若用占 总DNA 1/10 区域的限制性片段(10kb)， 则 n = 199 第23页/共93页第24页/共93页第24页/共93页第25页/共93页一、cDNA克隆用的mRNA第二节 cDNA文库的构建第25页/共93页第26页/共93页1. mRNA的完整性 指导合成高分子量蛋白质的能力 无细胞翻译体系（

11、源于网织红细胞） 哺乳动物总mRNA可编码 10100kDa蛋白 指导合成目的多肽的能力 利用免疫沉淀和SDS-PAGE mRNA的大小 500bp8kb 大部分 1.52kb第26页/共93页第27页/共93页 总mRNA制剂指导合成cDNA第一链长分子的能力 合成的cDNA也应为上述范围 脱氧胸苷酸12-18聚体oligo(dT) 12-18 引物可刺激cDNA第一链的放射性活度掺入量至少增加30倍第27页/共93页第28页/共93页2mRNA的丰度 高丰度mRNA 珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白 在特定细胞中占50-90% 低丰度mRNA0.5% 被称为低丰度或稀有mRNA文库应足够大，鉴

12、定和分离困难第28页/共93页第29页/共93页3mRNA的富集 按大小对mRNA进行分级分离 分离不同大小的mRNA（先变性，如氢氧化甲基汞，后梯度离心，蔗糖） 体外翻译，检测每份中的比活 cDNA的分离级分离近年来多采用此方法，特别是大mRNA，可避免降解mRNA, agarose分离大小易辩第29页/共93页第30页/共93页 多聚核糖体的免疫学纯化法用抗体来纯化合成的目的多肽的多聚核糖体 免疫亲和柱/A蛋白-Sepharose柱，单克隆抗体把正在合成新生链的多聚核糖体结合到A蛋白-spharose柱上，随后用EDTA解离下来，通过oligo(dT)层析分离mRNA。 此法分离的mRNA

13、只占总mRNA的0.01-0.05% 并非都可用，根据材料来源特异性来选择第30页/共93页第31页/共93页 反转录酶 AMV (42) M-MuLV (37) RNase H RNase H弱 长mRNA 引物 oligo(dT) 12-18 一般要求浓度高 模板 氢氧化甲基汞预处理，减弱链内二级结构 RNase 抑制剂AAAAAAAmRNA53TTTTTTTT二、cDNA第一链的合成cDNA第31页/共93页第32页/共93页1自身引导法三、cDNA第二链的合成第32页/共93页第33页/共93页2. 置换合成法第33页/共93页第34页/共93页 有效 无须进一步纯化 不需用S1酶，否

14、则会导致cDNA的大量损失问题： 如何脱帽以便进入载体 5端cDNA不能合成（少几个Nt） 有可能仍形成发夹结构第34页/共93页第35页/共93页3. 第二链引导合成第35页/共93页第36页/共93页Okayama-Berg方法第36页/共93页第37页/共93页4. 引物-衔接头合成法第37页/共93页第38页/共93页四、ds cDNA的分子克隆1.同聚物加尾问题： 只对质粒有效，文库不易保存和复制。 尾的长短不一 (100dA/dT, 20dG/dC) 同聚尾结合的质粒：cDNA杂合分子转化E.coli的效率随宿主不同而不同。第38页/共93页第39页/共93页2合成接头和衔接头cD

15、NA合成接头(含酶切位点)酶切NotI, SalI与载体连接Optional: methylation 接头中含稀有位点，如NotI, SalI(100kb一次) 先甲基化ds cDNA，再连接接头 用衔接头替换接头第39页/共93页第40页/共93页 用衔接头替换接头第40页/共93页第41页/共93页3. 其他方法(1) mRNA-cDNA杂交体克隆mRNAcDNAAAAAAAAARNA 末端加尾效率只及DNA的1/10合成第一链后, 加尾, 与带dT尾的载体退火, 在宿主体内, 可除去RNA, 代之以DNA优点: 无须合成第二链, 序列完整 但效率 1/10第41页/共93页第42页/共

16、93页(2) 依次连加不同接头第42页/共93页第43页/共93页(3) RACE random amplification of cDNA ends cDNA克隆是常出现丢失末端序列的现象，需较长时间获得全长cDNA克隆 筛选文库时一般只能回收一个或几个cDNA克隆， 而RACE可产生大量独立克隆第43页/共93页第44页/共93页mRNAcDNATTTTTTTT-QI-QOAAAAAAAA. 经典RACE3末端克隆TTTTTTTT-QI-QO反转录QOPCRGSP1QIGSP2根据已经得到的不完整的cDNA的序列设计引物 GSP1和GSP2PCRcDNA克隆中, 得到了不完整的片段, 可采

17、用此方法获得3末端和5末端的序列第44页/共93页第45页/共93页5末端克隆mRNAAAAAAAAGSP1GSP1AAAAAQ1-Q2- TTTTTTQ1/ GSP1 PCR反转录Q2/ GSP2 PCRGSP2第45页/共93页第46页/共93页获得的cDNA 克隆片段第46页/共93页第47页/共93页AAAAAAAGSP1反转录连接RNA寡聚物NNNNNNNNB. 新RACE第47页/共93页第48页/共93页第48页/共93页第49页/共93页(4) 其他与cDNA第二链合成有关的方法，如 Okayama-Berg方法和引物-衔接头合成法第49页/共93页第50页/共93页五、cDN

18、A克隆用的载体1gt10和gt11gt10: 可用核酸探针 克隆0-6kb EcoRI 插入后载体变cI- cI+在hflA中发生溶原GenBank: U02447第50页/共93页第51页/共93页gt11：表达载体，可用免疫探针 克隆0-7.2kb 可表达融合蛋白LacZE.coli C600 allowing growth of parental and recombinant phageC600hfl represses parental phage growth 50-100-fold, recombinant phage form clear plaques and parenta

19、l phage form turbid plaques第51页/共93页第52页/共93页E.coli LE392 allowing growth of parental and recombinant phageY1090 as the host, 42C形成噬斑适合用免疫学探针筛选第52页/共93页第53页/共93页2. ORF8 9kb 可用于定向克隆3其它gt18，19，20，21，22，23，ZAP第53页/共93页第54页/共93页第54页/共93页第55页/共93页第55页/共93页第56页/共93页第56页/共93页第57页/共93页第57页/共93页第58页/共93页第58页

20、/共93页第59页/共93页第59页/共93页第60页/共93页第60页/共93页第61页/共93页第三节 基因克隆的策略基因克隆的本质从文库中筛选目标克隆，重点在“筛选”常见筛选工具: 探针狭义: 核酸, 抗体广义: 还包括其他筛选手段第61页/共93页第62页/共93页 抗性基因: antibiotics抗性基因, 抗重金属活性一、功能筛选 分解基因: 苯环化合物, 分解酶 功能活性：杀虫，酶 启动子/复制子利用目标基因的特定功能进行筛选第62页/共93页第63页/共93页Amp ori MCSTet gene without promoterVector 将目标DAN切割成小片段, 插入

21、MCS在Tet 平板上筛选抗性菌落, 可得到promoter其他标记: gfp, Kan第63页/共93页第64页/共93页质粒复制单位的克隆Amp ori MCS目标宿主可用的抗性gene 将目标DAN切割成小片段, 插入MCS在抗性平板上筛选抗性菌落, 可得到质粒复制单位第64页/共93页第65页/共93页 功能缺失在获得相应突变体的前提下以此突变体作为宿主在野生型的DNA导入后检测回复突变如 营养缺陷型 相关的基因二、核酸探针 同源DNA探针高度保守的基因 rRNA基因邻近种属的相应基因相应基因的序列比较第65页/共93页第66页/共93页 合成寡核苷酸蛋白质N-末端aa序列简并探针de

22、generacy选取简并程度低的aa序列 综合合成可能的话 设计一对, 用PCR产物作探针根据密码子的使用频率, 合成猜测体探针设计两组简并探针, 用第二个探针对第一次筛选的阳性克隆子作第二次杂交第66页/共93页第67页/共93页三、免疫在可获得PT后, 制备抗体, 用于筛选四、高表达基因高丰度mRNA, 如 用苯肼作了贫血处理的兔网织红细胞中,血红蛋白mRNA的含量占绝大多数第67页/共93页第68页/共93页五(1)、差别杂交第68页/共93页第69页/共93页第69页/共93页第70页/共93页第70页/共93页第71页/共93页五(2)、扣除杂交T cell (TCR)B cell

23、mRNAmRNAcDNAcDNA: mRNA 杂交体过量通过羟基磷灰石柱, 吸附杂交分子T cell (TCR)特异的cDNA 流出cDNA 第二链合成第71页/共93页第72页/共93页生物素标记生物素结合蛋白柱第72页/共93页第73页/共93页第73页/共93页第74页/共93页六、mRNA差别显示mRNA 3末端 有12中可能的序列 以此12种引物引导cDNA第一链合成引物: 5-T11MN 或5-T12MN M=A, G, or C 以10核苷酸随机引物引导cDNA第二链合成(PCR) 可产生50-100条100-500bp DNA条带 12种锚定引物和20种随机引导组成240组引物

24、, 产生约20000 DNA条带第74页/共93页第75页/共93页Sequencing gel对两个相近品种的mRNA作上述处理, 比较它们产生DNA扩增条带的差异, 找到 单方具有的特异DNA条带, 则可能找到特异性表达的基因, 回收并克隆特异性的条带, 分析其序列, 以此条带为探针克隆全长基因。第75页/共93页第76页/共93页七、酵母双杂交系统用于分离与某一已知蛋白发生相互作用的蛋白质基因GAL4蛋白： 酵母半乳糖苷酶基因gal的转录激活因子，该蛋白结合在gal基因上游激活区(UAS)可启动gal基因的转录 GAL4蛋白：可分为两个区域 DNA-BD: DNA结合域, N-末端 1-

25、147aa AD: 转录激活域， C-末端 768-881aa 第76页/共93页第77页/共93页融合蛋白：DNA-BD域 / X蛋白X蛋白与靶蛋白Y 可发生作用构建融合表达文库AD域 / cDNAhost当文库中的某个重组子装载有蛋白Y的cDNA时，可能启动LacZ(HIS)报告基因的表达 第77页/共93页第78页/共93页Invitrogen Hybrid Hunter 第78页/共93页第79页/共93页五、其它 Tn插入缺失 分子标记（略）六、PCR在cDNA克隆中的应用1. RACE 等第79页/共93页第80页/共93页获得的cDNA 克隆片段第80页/共93页第81页/共93

26、页第81页/共93页第82页/共93页, 并补平末端2、cDNA第二链的扩增CCCCAAAATTTTT-mRNAAAAATTTTT-CCCCAAAA-TTTTT-GGGGPCR扩增出ds cDNA加入合成的引物mRNAmRNA-CCCCAAAA-TTTTT-GGGG用合成的引物 合成cDNA第一链, 加入polyC尾第82页/共93页第83页/共93页3. PCR-Select cDNA Subtraction Clontech公司第83页/共93页第84页/共93页第84页/共93页第85页/共93页基因文库（Gene library）：由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体, 称之为基因文库。一个完全的基因文库，应该能够保证从中筛选到目的基因。 即 Genomic library第85页