重组体分子选择与鉴定方法及鉴定

1、重组体分子的选择与鉴定方法及原理重组体分子的选择与鉴定方法及原理 重组体分子的选择与鉴定方法重组体分子的选择与鉴定方法 我们把外源基因导入受体细胞的目的是获得带有目的基因目的是获得带有目的基因 阳性重组体阳性重组体，因而重组体的筛选是体外重组技术的一个重 要环节。 涂布菌液，观察平板是无法判断重组子是否是我们所需的。 因此，我们需要进一步进行筛选。 常用的筛选方法常用的筛选方法概括起来有两大类：直接筛选法；间 接筛选法。直接筛选法直接筛选法 直接筛选法是借助遗传学表型遗传学表型来进行筛选的方法。 重组子转化宿主细胞后，载体上的一些筛选标志基因表标志基因表 达达，会导致宿主的某些表型的改变，通过

2、琼脂平板中添加 相应筛选物质，可以直接筛选含重组子的菌落。如果质粒 上有两种抗性，因为外源基因的插入，导致其中一个不其中一个不能能 表达表达，那么也可以通过抗药性将重组子筛选出来。间接筛选法间接筛选法 间接筛选法是检测重组体克隆中是否含有目的基因的核苷 酸序列或是否产生目的基因所编码的产物。 一般来说，先用直接筛选法进行初步筛选后，再用间接检 测法进行鉴定，直至获得我们所需要的阳性重组体。DNA水平RNA水平蛋白质水平遗传表型直接筛选法遗传表型直接筛选法核酸分子杂交法核酸分子杂交法PCR法法DNA序列分析法直接凝胶电泳法直接凝胶电泳法酶切片段分析法酶切片段分析法重组子筛选检测特定外源基因是否转

3、录及转录的强度（Northern杂交印迹法) 免疫化学检测法（放射性抗体检测法、 免疫沉淀检测法） Westhern印迹杂交法重组子筛选的方法重点介绍的筛选方法重点介绍的筛选方法间接选择法抗药性筛选a互补快速裂解菌落鉴定分子大小限制性内切酶酶切法PCR方法筛选鉴定重组子遗传表型直接选择法菌落杂交筛选 遗传学表型筛选的方法之一遗传学表型筛选的方法之一抗药性筛选抗药性筛选 基本原理 抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。 因为质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因抗药性选择标记基因，与目的 基因重组后，转入受体菌，能使受体菌带有相应抗药性， 另一种情况是虽然质粒中原来有相应抗性，但

4、插入外源片 段后重组质粒失去抗药性，据此我们也可以进行抗药性筛 选。 常用的抗药性选择标记抗药性溶解剂虑过除菌贮存温度贮存浓度终浓度氨苄青霉素（Amp）氯霉素（Cm） 水 乙醇 是 否 -20 -2050mg/ml34mg/ml50100g/ml20170g/ml卡那霉素（Ka或Kan）水 是 -2010mg/ml 50g/ml四环素（Tet或Tc） 乙醇 否 -2012.5mg/ml10g/ml（液） 12.5g/ml （固）链霉素（Sm或Str） 水 是 -2020mg/ml25g/mlA 如果外源基因片段外源基因片段插入载体的位点在抗药性基之外在抗药性基之外， 不导致抗药性基因的失活，仍

5、能编码抗药性基因产物仍能编码抗药性基因产物。 含有这种重组子的转化细胞可以在含有相应抗生素的琼 脂平板上生长成菌落，未能接受载体DNA的细胞因不能 生长而被排除。 b：如果外源基因片段外源基因片段插入载体的位点在抗药性基因中中 间间，导致抗药性基因失活抗药性基因失活，这个抗药性标志就会失活。 检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插人失活插人失活 效应效应 。 a类筛选 基本原理 抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。 因为重组质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因抗药性选择标记基因，转 化受体菌后能使后者在含有相应选择药物的选择培养基上 生长，而不含重组质粒DNA分子的受体

6、菌则不能存活。a类筛选的实验方法 LB固体培养基中加入千分之一的抗性药物，再倒平板； 将转化后的菌液均匀涂布在平板上； 放在37培养箱培养1216小时； 观察菌落生长情况。抗药性标记法示意图 b类插入失活筛选 从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内 的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活 (insertional inactivation) 。插入失活法是从不同的重组 DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子 （筛选）的主要方法。 例如：例如： 非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素四环素和氨苄青霉素抗性 基因都是正常的, 表型为AprTcr。

7、带有这种质粒的受体菌 可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长双抗性平板上生长。但 是, 如果在该质粒的氨苄青霉素抗性基因内插入外源片段外源片段, 就会造成氨苄青霉素抗性基因失活氨苄青霉素抗性基因失活, 变成ApsTcr, 携带这种 质粒的宿主菌可以在四环素的平板上生长在四环素的平板上生长, 而不能在氨苄不能在氨苄 青霉素抗性平板上生长青霉素抗性平板上生长。 B类插入失活筛选步骤 注意事项： （1）以Amp、Tc等抗生素作为选择药物，37培养时间 约1216h，超过时间视为杂菌（假转化子菌落）。 （2）挑选单菌落作为转化子以便进一步实验验证。挑的 菌落在LB培养基中震荡培养。遗传学表型筛

8、选的方法二a互补 基本原理： 这种筛选方法适用于含含b-b-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因的载体。载体在 b-半乳糖苷酶的a-肽编码区具有多克隆区域。重组质粒中 的插入片段使a-a-肽失活肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴 别。不带有插入片段的载体表达有活力的b-半乳糖苷酶， 所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉在染色体或附加体上缺失掉LacZM15LacZM15基因基因， 导致内源a-肽失活。载体或其他含LacZ基因的a-肽互补 细菌，具有b-半乳糖苷酶的w片段。 所得到的活力b-半乳糖苷酶（ a-肽加w片段）将底物X- Gal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。在载体多克隆 区域，克隆上插入

9、片段导致插入片段导致a-a-肽编码区的破坏肽编码区的破坏，使b-半乳 糖苷酶失活，得到白色菌落。 a-肽编码区读码框内小的 插入片段产生浅蓝色菌落，因b-半乳糖苷酶只是部分失活。 通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的 。这样 一次筛选 可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空 载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组 质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。蓝白斑筛选X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)，IPTG (异丙基硫代-D-半乳糖苷) X-gal被没分解后的产物为5-溴-4-氯-靛蓝无质粒的无质粒的 受体菌受体菌质粒转化质粒转

10、化的受体菌的受体菌带外源带外源DNADNA插插入的质粒转入的质粒转化的受体菌化的受体菌b-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal；无抗菌素抗性无菌斑无菌斑生长生长b-半乳糖苷酶的缺失被载体产物a互补，能分解Xgal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养有蓝有蓝色菌色菌斑生斑生长长载体产物失活，不能互补b-半乳糖苷酶的缺失。不能分解Xgal，但有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养有白有白色菌色菌斑生斑生长长不能正常生长实验中的蓝白斑筛选 蓝白斑筛选 注意事项：（1）菌液涂布量为90mm平皿50100 l;（2）由于被转化的基因产物作用于X-gal需要较长时间，因 此，观察和确

11、定转化子菌落的培养时间可适当延长。 与37温箱取出后放4 冰箱几小时后观察效果更好；（3）为了防止假阳性需挑菌进一步验证；（4）宿主菌的b-半乳糖苷酶的a-肽编码区应在染色体或附 加体上缺失。依赖于重组子结构特征分析的筛选法之一依赖于重组子结构特征分析的筛选法之一快速裂解菌落鉴定分子大小快速裂解菌落鉴定分子大小 基本原理： 由于外源片段插入的重组质粒与载体大小不同，我们可以 利用琼脂糖凝胶电泳将重组体分离出来。利用此种方法就 需要将用裂解液将菌体悬浮，保温15min30min，再 12000rmp离心10min,上清中既含我们所需获得质粒。 此方法直观快捷，适用于插入片段较大的重组子的筛选。

12、电泳法能筛选出有插入片段的阳性重组体，但不能鉴别插入 片段大小相近的非目的基因片段。依赖于重组子结构特征分析的筛选方法二依赖于重组子结构特征分析的筛选方法二限制性内切酶酶切方法鉴定重组子限制性内切酶酶切方法鉴定重组子 基本原理： 根据已知的外源DNA序列的限制酶切图谱，选择一两种 内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA的带数和 长度）。或用合适的内切酶酶切插入片段，再用其它酶 酶切这个片段，电泳后比较电泳结果是否符合预计的结 果。电泳后的图谱挑三个菌落鉴定，图显示的是三个菌落中的质粒双酶切的结果依赖于重组子结构特征分析的筛选方法三依赖于重组子结构特征分析的筛选方法三PCR方法筛选鉴定重组子

13、方法筛选鉴定重组子 基本原理： 在载体DNA分子中，外源DNA插入位点两侧的序列多为已知，通过与插入位点两侧已知序列互补的引物，从单 克隆中提取少量质粒DNA作为模板进行PCR扩增，琼脂 糖凝胶电泳分析确定是否为重组子。 注意事项： 如需检测插入片段及其方向，使用载体特异引物和方向 插入特异引物或互换。如只需确认是否存在插入片段， 可用2个插入片段特异引物。扩增反应前在94变性两 分钟，有利于细菌的裂解，提高PCR产物扩增的成功。 1 主要原理主要原理 用体外标记目的基因DNA或相应的RNA为探针同转化后的菌落进行原位杂交原位杂交，筛选含重组DNA的克隆。这个方法可以快速地从数百个菌落中挑选出

14、含有重组DNA的克隆。 该方法的优点是通用性比较强优点是通用性比较强，可以用来检测任何一种插入的DNA序列。这种方法依据的是核酸分子杂交的原理核酸分子杂交的原理，而不以插入的DNA序列能否实现基因表达为前提，因此，只要有可利用的标记探针就可检测出重组质粒DNA。 重组质粒重组质粒DNA的菌落杂交筛选的菌落杂交筛选 方法： 1 硝酸纤维素膜的准备硝酸纤维素膜的准备：将硝酸纤维素膜剪成直径为8cm 的圆形，放人一个干净的平皿内，高压灭菌，待用。 2 将无菌的作有标记的硝酸纤维素膜铺在含有相应抗生素铺在含有相应抗生素 的琼脂糖培养基平皿上的琼脂糖培养基平皿上，用无菌的L型玻璃棒去除膜与培 养基间的气

15、泡，约12min，培养基即可将滤膜浸湿。 3 用无菌牙签将转化平皿中选择的菌落接种到滤膜上菌落接种到滤膜上，同 时接种到另一含有相应抗生素的琼脂糖平皿的对应位置， 并作为标记菌落参照。每个90mm的平皿上大约可接种 100个菌落。 4 将平皿置于 37培养 23h，菌落长到1mm时，把滤把滤 膜转移到另一块含有氯霉素（膜转移到另一块含有氯霉素（170ugml）的琼脂糖平皿）的琼脂糖平皿 上上，菌落面向上，37培养1520h，扩增质粒。另一个 菌落对照平皿 37培养过夜后，密封，4保存。 5 把滤膜从平皿中取出，菌落面朝上，置于有一薄层变性置于有一薄层变性 液的塑料膜上液的塑料膜上，变性处理10

16、min，然后用干滤纸吸干变性 液；再将菌落面朝上置于有一薄层中和溶液的塑料膜上有一薄层中和溶液的塑料膜上， 中和两次，每次15min。室温晾干后，再置于80真空干 燥12h。 6 杂交：把滤膜浸入预杂交液滤膜浸入预杂交液中，在60下放置6h；把同同 位素标记的位素标记的DNA探针探针于100变性后加入杂交溶液中，然 后放入滤膜，60杂交1624h。探针的用量一般为105 106cpm/ml。用2SSC洗脱3次，每次30min。 7 放射自显影放射自显影：将洗好的滤膜用吸水纸吸干，夹于两层保 鲜膜中，在暗室内放进暗盒，放好X线片，并于X线片上 作好标记，置于70冰箱暴光4872h。 8 洗片：在

17、暗室内取出X线片，进行显影和定影，分析杂 交结果。 注意事项注意事项： (1) 菌落杂交与DNA的吸印转膜杂交与斑点杂交不同，后者 一般只有DNA，而菌落杂交时，许多菌体成分与DNA一起 形成斑点，即使经过固定步骤之后，DNA与膜的结合很不 牢固。因此，菌落杂交菌落杂交与纯核酸的杂交最适温度最适温度不同，一 般温度略低略低一些可防止DNA从膜上脱落。 (2) 为防止防止滤膜上菌落脱落或移位落脱落或移位，可采用抽吸方法进行采用抽吸方法进行 DNA变性变性：即将滤膜菌落面向上，置于4层用变性液浸透的 Whatman 3MM滤纸上，放置5min，然后把滤液放到一 合适的抽滤器上，用水泵或负压抽至菌落接