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1、1 灭活疫苗的研究1931 年4 月27 柏林微生物学会首次召开了FMD 学术会议, 奠定了FMD 疫苗研究基础。Fren2kel H S 等 成功地实现了FMDV 体外培养, 不但满足了FMDV 疫苗的规模化生产要求, 而且实现了对病毒的定量研究。目前用于FMD 疫苗生产的细胞主要是BHK221 细胞。疫苗生产过程主要包括FMDV 的细胞培养, FMDV 细胞培养物的浓缩、灭活, 佐剂的加入, 安全性检验和效力检验等程序。进行FMD 疫苗生产时首先要考虑FMDV 血清型, 其次要了解当地FMD 的流行情况, 最终确定用于FMD 疫苗生产的毒株。如果对当地FMD流行情况不了解, 或本地区进出口

2、贸易把关不严, 周边国家或其他距离较远的国家FMD 有可能传入本国或地时,FMD 疫苗生产就要选择所有可能对本地区构成威胁的FMDV 毒株。比如一些阿拉伯半岛国家, 就选择了8 株FMDV 用于疫苗的生产, 以期生产出能够预防本国或地区所有潜在FMD 疫苗。尽管FMD灭活疫苗在FMD 预防和控制上, 发挥了重要作用,但是灭活疫苗本身也存在许多安全隐患, 国外学者先后用分子生物学方法证明欧洲暴发的FMD 是因使用了灭活不全的FDM 疫苗引起的。具有讽刺意义的是在欧洲国家尽管通过免疫成功实现对FMD暴发流行控制, 但在1992 年欧洲经济委员会还是放弃了疫苗的使用, 该决策是否正确, 还有待观察,

3、 因为在西欧的一些周边国家仍然存在FMD的流行。常规灭活疫苗是经一系列试验动物选择的田间毒株经病毒培养系统大量扩增获得的病毒制备物, 灭活剂处理后添加佐剂制成的一类生物制品。1925年Be2lin首次用甲醛灭活牛舌皮组织病料制成了灭活疫苗;1966年Lapstich和Te lling等应用乳仓鼠肾传代细胞(BHK221) 深层悬浮培养法制备口蹄疫疫苗, 可大量培养细胞、增殖病毒和制造疫苗。意大利在60年代早期研制成功牛原代肾细胞转瓶培养法生产口蹄疫抗原, 以及后来投产的BHK221克隆13 转瓶单层培养法, 也存在劳动强度大及易散毒的缺点。现在大多数口蹄疫灭活疫苗仍用BHK221克隆13或IB

4、RS22细胞生产。目前广泛应用二乙烯亚胺( BE I) 作为灭活剂。佐剂有氢氧化铝胶、皂素、弗氏不完全佐剂、油包水乳剂等。有学者用分枝杆菌细胞壁的可溶性部分、合成硫辛酰胺、Avrid ine等作佐剂生产FMDV 油佐剂灭活疫苗, 可以降低抗原的用量, 同时增强FMDV 的细胞免疫应答 3。灭活疫苗的缺点是热稳定性差,需要低温保存, 免疫持续期短, 抗病毒谱有限, 不能区分注射疫苗动物和自然感染动物, 同时存在病毒灭活不彻底而散毒的可能性。灭活疫苗是现今使用最广泛的疫苗, 安全可靠, 免疫效果良好。灭活疫苗研究主要有3 个重要环节: 获取大量的病毒抗原、选择适宜的灭活剂和灭活方法、选择适宜的无毒

5、副作用的免疫佐剂。病毒生产可从发病动物水疱皮( 液) 、血液、试验小动物及细胞培养获得。灭活剂主要有甲醛、结晶紫、乙酰基乙烯亚胺(AEI) 、二乙烯亚胺(BEI) 、乙基乙烯亚胺( EEI) 等。目前我国在牲畜口蹄疫强制免疫中主要应用细胞培养病毒的BEI 灭活苗, 对猪使用O 型口蹄疫灭活疫苗, 对牛、羊、骆驼和鹿等使用O 型- 亚洲I 型口蹄疫二价灭活疫苗; 其中, 猪O型口蹄疫灭活疫苗( II) 采用猪源口蹄疫强毒株, 经BHK21 细胞增殖, 应用生物浓缩技术提高疫苗中有效抗原含量, BEI 灭活病毒, 与矿物油佐剂乳化而制成的高效疫苗, 注射剂量2ML/ 头, 可抵抗200 个最小发病

6、量的强度攻击, 抗病猪同居感染。但灭活疫苗也有它的不足之处, 表现为免疫性较差; 所用种毒均为强毒, 必须有严密的防范设施和严格的操作规程, 存在生物安全隐患; 生产难度大,成本较高; 使用剂量大, 免疫期较短。1930 年Frenkel H S 等首次成功地实现了FMDV 的体外培养，满足了疫苗的规模化生产，并实现了对病毒量化研究。1931 年4 月在柏林微生物学会首次召开了专题学术会议，确定了FMD 疫苗研究的方向。1962 年英国的Mowat 和Chapman 等开始用乳仓鼠肾传代细胞(BHK-21) 培养FMDV，生产灭活疫苗并迅速商业化。目前应用的灭活剂，主要有乙酰乙烯亚胺(N-ac

7、etylethylenimine，AEI)，灭活曲线为线性。主要作用于核酸，蛋白抗原性保持较好，但毒性较大。后来改用二乙烯亚胺(Binaryethyleneimine，BEI)， 其毒性较小，被广泛应用2-5。FMD 疫苗的免疫佐剂有氢氧化铝胶、司班、轻型矿物油。由于疫苗佐剂的不断地更新，已由最初的水佐剂发展成现在的油佐剂，其他一些佐剂也相继问世并取得了一定的效果6-8。尽管FMD 灭活疫苗在FMD 预防和控制上发挥了重要作用，但是灭活疫苗本身也存在许多安全隐患，国外学者先后用分子生物学方法证明欧洲暴发的FMD 是因使用了灭活不彻底的抗原制备的疫苗所引起。蛋白亚单位疫苗是指用基因工程手段制备的

8、病原体亚单位成分，将其作为抗原制备的疫苗。由于亚单位疫苗只含有病原体的一部分抗原，不会引起动物发病，可提高疫苗的安全性。目前，FMD 基因工程亚单位疫苗主要是利用各种表达系统表达VP1蛋白， 制备疫苗。自1981 年Kupper和Kleid 分别成功的进行了FMDVVP1 基因的原核表达， 通过间接ELISA 证实了表达产物具有抗原性9，免疫动物后能产生中和抗体10，人们对此类疫苗进行了大量的研究。Luis D.Giavedoni 等将FMDV VP1基因中的多个抗原表位片段分别进行了原核表达，并用表达产物接种豚鼠，发现VP1 第141158、200213 氨基酸的融合表达的产物免疫原性最好，

9、 诱导产生高水平的中和抗体，且接种动物能抵抗同型病毒的攻击11。杨志军和庄娟分别表达了O 型FMDV VP1 的T、B 细胞表位， 该融合蛋白较小剂量就能诱导豚鼠产生高滴度的中和抗体，还能诱导细胞免疫12-13。H Song 等将O 型FMDV VP1 与霍乱弧菌肠毒素B 亚单位（CTB）串联表达后接种小鼠， 发现该融合蛋白能诱导小鼠产生中和抗体。用该蛋白接种猪时，经三次接种后可产生免疫反应，并且攻毒时80%的猪被保护14。此外，FMDV 结构基因和非结构基因的串联表达，可以产生76S 的类病毒粒子，用该类病毒粒子免疫动物其效果类似于全病毒，可产生高水平的中和抗体，显示出良好的应用前景， 亚单

10、位疫苗与合成肽疫苗FMDV 的结构蛋白主要由VP1、VP2、VP3 和VP4 组成, 其中VP1 是诱导机体产生免疫反应的主要结构蛋白。20 世纪80 年代以来, 人们以FMDV的结构蛋白VP1, 146 S 和12 S 蛋白亚单位等作为抗原免疫牛和豚鼠均可产生沉淀抗体、补体结合抗体及中和抗体。Vasantha 等用脂质体包裹O 型和Asia 1 型FMDV 的VP1 制备亚单位疫苗, 免疫豚鼠产生了高水平的中和抗体, 小规模的田间试验也取得了比较好的效果。Kield 等应用重组DNA 技术首次在大肠埃希菌中表达了口蹄疫病毒主要保护性抗原VP1。以这种融合蛋白制备的实验疫苗, 在牛和猪中均可诱

11、导中和抗体产生。使用152 Lg 的融合蛋白重复接种, 牛可抵抗A 型口蹄疫病毒的攻击。Huang 等则用含有半乳糖苷酶和一个完整的FMDV VP1 蛋白主要抗原决定簇的重组融合蛋白接种豚鼠和猪, 可以产生特异性的中和抗体, 起到有效的保护作用。Bitlle 根据口蹄疫病毒O1 型VP1氨基酸序列分析资料, 化学合成了1402160 段氨基酸与载体蛋白偶联, 能诱导保护豚鼠的中和抗体。Dimarch 用合成的O1K 病毒VP1 的141 段 158段和200 段 213 段氨基酸组成40 个氨基酸短肽,在其中间加上两个脯氨酸和一个丝氨酸使多肽拆成立体构型, 大大提高了单段肽在豚鼠的应答水平,

12、并提出了VP1 羧基端氨基酸在提高保护应答中的重要性。这些亚单位疫苗与合成肽疫苗的免疫原性均基于它们能递呈VP1 蛋白G2H 环上的关键的抗原表位。然而, 这些抗原位点不仅不是病毒粒子上惟一的中和性位点, 也不一定能被所有的宿主动物识别,这导致这些疫苗在大规模使用时候, 效果并不理想。如Taboga 等应用138 头牛进行4 种合成肽疫苗的效果检测。结果表明各免疫组虽可产生相应的的免疫反应, 甚至高水平的中和抗体, 但它们对免疫动物的攻毒保护率没有一个在40% 以上。此外, 由于FMDV 的高变异性和准种特性, 使用有些的抗原表位, 不仅不能有效地诱导保护性免疫, 还会加速病毒的变异速度。如T

13、 aboga 等就在未保护牛中分离到突变逃逸株。基因工程疫苗由于只含有病毒衣壳蛋白, 不含有核酸, 因而具有很高的安全性。FMDV抗原结构研究表明, VP1 片段是FMDV 的主要抗原位点, 能诱导机体产生保护性的中和抗体, 并能产生部分的保护作用。因此, 分离纯化完全的VP1片段或其C 端1 /2部分就成为人们制备FMDV基因工程疫苗的目标。1981年K leid等 4成功地进行了FMDV基因在原核细胞中的表达, 免疫牛和猪后能产生中和抗体。1995年McKenna等 5 通过基因工程技术构建了一株缺失RGD的FDNV, 并用此病毒接种牛使之产生抵抗强毒株攻击的免疫力。2000年赵凯等 6报

14、道在大肠杆菌细胞中表达的融合蛋白注射豚鼠和猪后产生保护作用。Song等 7将O型FMDV VP1蛋白与CTB一起进行表达后接种小鼠, 发现该融合蛋白能诱导小鼠产生中和抗体, 且通过腹腔和鼻内接种小鼠比口腔接种有更高的保护率。用该蛋白免疫接种猪时, 经3次接种后有免疫反应产生, 并且攻毒时80% 的猪被保护。董博翰等 8 选择了VP1上的几个B细胞表位和T 细胞表位, 原核表达出一种重组蛋白J112G。并证明这种重组蛋白有较好的免疫活性。杨光等 9 以FMDV VP1的B细胞表位和T细胞表位串联的方式构建牛O型口蹄疫病毒VP1 表位疫苗, 试验结果表明, 以此方式构建的重组蛋白能够诱导豚鼠产生具

15、有保护性的抗牛O型FMDV 中和抗体, 可有效的诱导机体的免疫应答, 以促进中和抗体的产生。基因工程疫苗研究在世界各国都有不同程度进展。1975 年Bachrach 等从口蹄疫病毒分离衣壳蛋白VP1, 配以不完全弗氏佐剂,制成亚单位苗, 有良好免疫效果。Kield 等( 1981) 应用重组技术首次在大肠杆菌中表达了口蹄疫病毒VP1, 经融合蛋白制成的实验疫苗, 在牛和猪中可诱导中和抗体的产生3 。Mckemher 等( 1985) 用高浓度的重组DNA 的VP1 融合蛋白152 Lg 或重复接种后,牛可抗A 型FMDV 的攻击感染。Morgan( 1990) 等用58 Lg 的A12- 32

16、 二聚体重复接种, 使猪也可抗A 型FMDV的攻击感染 4 。薛青红等用FMDV 的3A 基因在大肠杆菌中可高效的表达, 所表达的蛋白含量占菌体蛋白的2912%5 。江鹏斐等( 2001) 从O 型口蹄疫病毒china 株病毒材料中成功克隆到了非结构蛋白的2c 基因, 并成功地将该基因在大肠杆菌中进行了表达, 并为能区分人工感染和自然感染的动物检疫方法提供了技术和材料条件。近年来, 出现了用T4 噬菌体作为载体表达口蹄疫VPI 编码蛋白的研究, 并在豚鼠免疫试验中检测到中和体。我国复旦大学于1994 年研制成功家畜口蹄疫基因工程苗并申请了专利, 目前已在国内逐渐推广应用。合成肽疫苗是基因工程亚

17、单位疫苗的延伸。合成肽疫苗的抗原是根据免疫抗原表位的氨基酸序列通过人工合成或是基因工程表达而得到的肽段。Brown 等用化学法合成了FMDV VP1 基因编码的140160 及200213位肽段的基因片段，并在大肠杆菌体内得到了表达，用其免疫牛、猪等都获得了较好的免疫力16。Doel 等分别合成了FMDV A、O、C 三型的VP1 序列的第200213 和141158 位氨基酸残基的多肽。分别将各多肽与油佐剂混合接种实验动物，诱导产生了高水平的抗同型病毒和抗接种肽的抗体， 接种A 型和O 型多肽的实验动物能抵抗同型病毒的攻击，接种C 型多肽的实验动物不能抵抗同型病毒的攻击17。通过不断的实验发

18、现，不同的载体蛋白与FMDV 的免疫原性肽段偶联后可增强其免疫原性18-19。所谓合成肽疫苗是用化学合成法人工合成病原微生物的保护性多肽, 并将其连接到大分子载体上, 加及佐剂制成的疫苗。它是一种仅含免疫决定簇组成的小肽。Brown 10用化学法合成了FMDV VP1基因编码的140 160及200 213位肽段的基因片段, 并在大肠杆菌体内得到了表达, 用其免疫牛、猪等都获得了较好的免疫力。Kupriianova等 11 应用44 63个氨基酸, 即FMDV2A22 株VP1 基因第135 159、170190和197 213位氨基酸所构建的合成肽疫苗, 通过免疫豚鼠和小鼠, 证明了相对于含

19、有较少氨基酸的合成肽来说, 其免疫效果有显著的提高。通过不断的试验发现, 不同的载体蛋白与FMDV的免疫原性肽段偶联后可增强其免疫原性 12- 13。FMDV抗原结构的研究为合成肽疫苗的研制提供了理论依据, 但这些抗原位点不仅不是病毒粒子上惟一的中和性位点, 也不一定能被所有的宿主动物识别, 而且合成肽由于其分子较小, 空间构象简单, 因而对免疫系统的刺激强度和识别信号不够, 不仅难以产生针对高度变异的小RNA病毒的保护作用, 相反还有利于抗原变异株的选择性适应。这导致这些疫苗在大规模使用时候, 效果并不理想。有效合成肽疫苗的研制还需对FMDV的免疫机理作深入的研究。合成肽疫苗是用化学合成法人

20、工合成病原微生物的保护性多肽, 并将其连接到大分子载体上, 加入佐剂制成的疫苗。它是一种仅含免疫决定组成的小肽。Biflle 等( 1982) 根据FMD病毒O型VP1 氨基酸序列, 化学合成了140- 160 段氨基酸肽与载体蛋白偶联, 可诱导保护豚鼠的中和抗体。Doel 等( 1990) 曾用A、O、C 血清型( FMDV)VP1 序列的141- 158 和200- 213 肽段组成了40 个氨基酸的合成肽, 对牛和豚鼠均产生了特异的高水平抗病毒抗肽抗体。活载体疫苗是指将FMDV 免疫原基因利用基因工程的方法插入活的无致病性的病毒基因组中，并使其共同表达重组蛋白。这种活载体疫苗在机体内不但

21、能产生针对载体的抗体， 而且可以产生针对FMDV 的抗体。由于FMDV 的血清学之间没有交叉免疫，因而可以将不同血清型的免疫原基因同时插入到一个活载体中，组成多价基因疫苗进行防治，从而降低疫苗生产成本。已报道的活载体主要包括腺病毒（Adenovirus）、疱疹病毒（Herpesvirus）、痘病毒（Poxvirus）、腺联病毒（Adeno-associated vrius）、反转录病毒（Retrovirus）、甲病毒（Alphavirus）、水泡性口炎病毒（Vesicularstomatitis virus）等。在FMD 活病毒载体疫苗研究中应用的有腺病毒、痘病毒和杆状病毒载体。5.1 FMD

22、V 腺病毒活载体疫苗Sanz 等20用人的可复制的IV 型腺病毒疫苗株（Ad5 wt）载体，构建了表达结构蛋白P1 基因的重组腺病毒活载体疫苗Ad5-P1。用Ad5 wt 和重组的Ad5-P1 经皮下或鼻内接种牛，在第二次免疫后鼻内滴注FMDV 进行攻毒。虽然未检测出抗FMDV 抗体，但经重组病毒皮下接种两次的所有动物均得到有效的保护。随后，Mayr 等， 用表达FMDV 结构蛋白腺病毒VI 型免疫猪，4 周后用相同剂量加强免疫一次，产生高水平的FMDV中和抗体，5/6 免疫猪得到完全保护21。Kit 等利用牛传染性鼻气管炎病毒表达了FMDV 结构蛋白的VP1 多肽，用该重组病毒接种牛诱导产生

23、高水平的抗FMDV 抗体22。5.2 FMDV 痘病毒活载体疫苗痘苗病毒载体是研究最早和最成功的载体病毒之一。痘苗病毒具有宿主范围广、增殖滴度高、稳定性好、基因组容量大、含多个非必需区等，有利于进行基因工程操作和适于插入多个外源基因且抗原性稳定、免疫原性持久，能够同时诱发体液和细胞免疫，相对安全。BerinsteinA 等构建了表达FMDVC3 Arg 85 毒株的P1 基因重组痘病毒， 用该重组痘病毒接种Balb/c 小鼠， 用ELISA 检测出高效价的抗FMDV 抗体，同时能保护同源病毒强毒的攻击23。郑敏等用鸡痘病毒作载体构建了表达FMDV P1-2A 和3C基因的重组疫苗，在小鼠和豚鼠

24、免疫试验均表现出较好的免疫效果，并且在豚鼠攻毒试验中， 可抵抗250MID50 同源病毒攻毒24。5.3 FMDV 杆状病毒活载体疫苗杆状病毒（Baculovirus）系昆虫病毒，与其它表达系统相比，主要优点在于：（1） 杆状病毒核衣壳和基因组庞大；（2） 通过多元表达载体或共同感染可以同时表达多个外源基因；（3） 杆状病毒对脊椎动物无病原性，不在哺乳动物细胞内进行病毒DNA转录、有效复制或将基因整合到细胞基因组内，遗传学上是安全的表达载体；（4） 昆虫细胞作为较高等的真核生物细胞能完成表达产物的一系列翻译后加工修饰，绝大部分外源基因表达产物均有良好的生物活性；（5）启动子强，很多外源基因均可

25、得到超高表达。目前最常用于表达载体构件的杆状病毒有：苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcNPV）、家蚕核型多角体病毒（BmNPV）及粉纹夜蛾核型多角体病毒（TnNPV）。1993 年美国梅岛动物疾病研究中心用杆状病毒表达FMDV 的P1 蛋白，部分P2 蛋白和P3 蛋白，免疫猪后能部分保护强毒攻击。K.J Sorensen等用杆状病毒构建并成功表达了FMDV 非结构蛋白（NSP）3D、3AB、3ABC，并将3ABC 用于免疫动物与自然感染动物ELISA 鉴别诊断抗原25。Jan.Roosien 等将FMDV 前体衣壳蛋白基因P1-2A 及L、3C 的互补DNA导入AcNPV，在秋粘虫（sf）细胞中

26、表达出衣壳蛋白前体1AB、1C、1D，获得了不含感染性RNA 的空衣壳蛋白，并用于动物FMD 的免疫26。2008 年， 中国农业科学院兰州兽医研究所， 柳纪省博士等成功地用家蚕杆状病毒表达体系表达了FMDV 亚洲空衣壳抗原。该表达体系对外源基因的容纳量较大，表达效率极高，完全具备高效表达FMDV 空衣壳抗原的基本条件。其表达的FMDV 抗原蛋白可通过翻译后修饰， 使其在生化性质和生物活性等方面与真实的FMDV 的外膜蛋白相似， 这为表达出的FMDV抗原的免疫原性提供了保证。表达的FMDV 空衣壳抗原缺乏病毒的RNA，因而丧失了病毒复制能力， 作为免疫原既可刺激B 细胞介导的体液免疫反应， 又

27、可刺激产生一定的细胞免疫反应，用作疫苗抗原非常安全。本产品已获得农业部批准的转基因生物安全证书，并获得了生产文号。在漫长的自然进化过程中, 病毒是以寄生形式存活下来的最小、最简单的生命体, 随着病毒分子生物学的深入发展, 为生物工程研究领域拓展了思路,提供了有效的方法和工具。以病毒为载体的新型疫苗成为了基因工程的研究热点之一, 病毒重组活载体疫苗可被视为减毒活疫苗和亚单位蛋白质疫苗的结合, 它既可以避免亚单位疫苗需要佐剂和多次接种注射的缺点, 又可以诱导全面而持久的免疫反应。可作为减毒活疫苗的病毒载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒、脊髓灰质炎病毒和单纯疱疹病毒等, 目前已用于FMD 疫苗研究的载

28、体主要有痘病毒、腺病毒和杆状病毒载体等。* 收FMDV 腺病毒重组活载体疫苗 人腺病毒弱毒疫苗的安全有效使用, 奠定了腺病毒作为载体研制的基础。第1 代腺病毒载体起于20 世纪80 年代初, 至今腺病毒载体已经经历了4 代发展 223 。在腺病毒载体快速发展的同时, Sanz Parr a A 等 4 用人的可复制的5 型腺病毒疫苗株(Ad5 wt) 载体, 构建了表达FMDV 结构蛋白P1 基因的重组腺病毒活载体疫苗Ad52P1。用Ad5 wt 和重组的Ad52P1 经皮下或鼻内接种牛, 在第2 次免疫后鼻内滴注口蹄疫病毒进行攻毒。虽然未检测出抗口蹄疫病毒抗体, 但经重组病毒皮下接种两次的所

29、有动物均得到有效的保护。后来, Mayr G A 等 5 构建了可以表达FMDV 衣壳蛋白P122A 和3C 蛋白酶基因的非复制型人5 型腺病毒载体, 被挑选出来两个重组病毒: 含有3C 蛋白酶的Ad52P1 和在蛋白酶编码区进行点突变的抑制多聚蛋白加工的Ad52P12X3CMUT。在293 个病毒感染细胞中, FMDV 的衣壳蛋白均能合成, 但能够将其加工成结构蛋白VP0、VP3 和VP1 的仅仅是Ad52P12X3CWT 病毒感染的细胞。通过用型特异性的单克隆抗体进行的免疫沉淀试验, 结果表明, 在Ad52P12X3CWT 病毒感染的细胞中可能形成较为高级的结构形式。口蹄疫病毒常经肌肉接种

30、小鼠产生相应的免疫反应, 但仅仅含有3CWT 的病毒才能表达中和抗体反应。在增加基础免疫以后, 中和抗体反应的程度增加了。猪肌肉接种AD52P12X3CWT 重组病毒后能够产生中和抗体, 并可完全或部分保护与人工接种强毒的动物相接触的猪免受病毒的感染。因此, 腺病毒可以作为一种有效的表达FMDV 的主要决定簇的抗原的载体, 诱导高水平的中和抗体的产生, 并保护动物免受FMDV 的攻击。Du Y 等 6 腺病毒载体构建了VP1 基因和VP1主要抗原表位分别与巨噬细胞集落刺激因子共表达的重组活载体疫苗rAd2GMCSF2VPe 和rAd2GMCSF2VP1, 研究结果表明两种疫苗均能诱导机体产生较

31、高水平的FMDV 特异性T 淋巴细胞增殖反应、IFN2gamma 和IL24, 而且rAd2GMCSF2VPe和rAd2GMCSF2VP1 均能对猪和豚鼠产生攻毒保护。2. 1. 2 FMDV 痘病毒重组活载体疫苗 痘苗病毒载体是研究最早和最成功的病毒载体之一。痘苗病毒具有宿主范围广、增殖滴度高、稳定性好、基因组容量大、含多个非必需区等优点, 有利于进行基因工程操作和适于插入多个外源基因且抗原性稳定、免疫原性持久, 能够同时诱发体液和细胞免疫, 相对安全。Berinstein 以痘苗病毒为载体构建了表达FM2DV C3Ar g85 株衣壳蛋白前体P1 基因的重组FM2DV 疫苗, 免疫后可检测

32、到高水平的FMDV 和痘苗病毒的中和抗体, 类似于灭活疫苗免疫所产生的抗体水平。经小鼠免疫试验表明, 重组痘苗病毒抗FMDV 的有效免疫原可以作为活载体疫苗。但痘苗病毒本身存在一些难以克服的缺点, 如感染谱广,容易引发痘病等。有人采用金丝雀痘病毒为载体表达FMDV 的VP1, 其表达效率要比以痘苗病毒为载体高出100 倍, 具有良好的应用前景 7 。此外, 鸡痘病毒表达载体具有安全、高效、外源基因容量大, 宿主范围较小等优点, 为疫苗的研究提供了可能, 具有很好的发展前景。作者所在课题组郑敏等用鸡痘病毒作载体构建了共表达FMDV P12 2A 和3C 基因的重组疫苗, 在小鼠和豚鼠免疫试验均表

33、现出较好的免疫效果, 并且在豚鼠攻毒试验中,可抵抗250 MID50 同源病毒攻毒 8 。在此基础上Ma Mingxiao 等 9 构建用鸡痘病毒作载体构建了共表达FMDV P122A, 3C 和猪IL18 基因的重组疫苗,进一步提供了该重组疫苗的免疫效果, 在猪的攻毒试验中, 保护率可达到4/ 5。2. 1. 3 FMDV 伪狂犬病毒载体重组活载体疫苗伪狂犬病毒载体就是通过基因工程技术使伪狂犬病毒载体中的毒力基因失活, 使病毒的毒力减弱, 但病毒粒子仍然保持良好的抗原性, 能够有效地刺激机体产生免疫应答。重组病毒粒子同插入的外源基因一起在动物体内表达不仅十分安全, 还可以做到一针多防, 提高

34、生产效率。伪狂犬病毒载体在基因表达、疫苗研制、基因投递和基因治疗等方面都显示了很好的优越性。Yao Q 等 10 用伪狂犬病毒载体构建了共表达O 型FMDV 的P12A3C 基因的重组载体疫苗, 并与用P12A3C 构建的DNA 疫苗免疫效果进行了比较, 结果表明, FMDV 伪狂犬病毒重组活载体疫苗能诱导较高的抗体水平, 对豚鼠的攻毒可完全保护, 而DNA 疫苗抗体水平较低, 对豚鼠的攻毒只能部分保护。重组活载体疫苗活载体疫苗是指将FMDV 免疫原基因利用基因工程的方法插入活的无致病性的病毒基因组中, 并使其共同表达重组蛋白, 并刺激机体产生免疫反应。目前, 常用的病毒表达载体有痘病毒、腺病

35、毒、疱疹病毒和杆状病毒等。研究表明, 应用腺病毒和杆状病毒为载体表达FMDV抗原已获得成功。31311 利用腺病毒表达FMDV抗原人腺病毒弱毒疫苗的安全有效使用, 奠定了腺病毒作为载体研制的基础。由于腺病毒与天然抗原相比, 活的微生物感染可引起更持久有效的免疫。另外, 腺病毒易于培养和纯化, 感染过程中可产生大量的病毒RNA。Sanz等 14 用人的可复制的IV 型腺病毒疫苗株(Ad5 wt) 载体, 构建了表达结构蛋白P1基因的重组腺病毒活载体疫苗Ad52P1。用Ad5 wt和重组的Ad52P1经皮下接种牛, 在第2 次免疫后鼻内滴注FMDV进行攻毒, 所有经重组疫苗两次皮下免疫的牛均获得坚

36、实保护力。Mauros 15 构建的Ad52A24疫苗免疫5头牛后获得完全保护。Du等 16腺病毒载体构建了VP1基因和VP1主要抗原表位分别与巨噬细胞集落刺激因子共表达的重组活载体疫苗rAd2GMCSF2VPe和rAd2GMCSF2VP1, 研究结果表明两种疫苗均能诱导机体产生较高水平的FMDV 特异性T淋巴细胞增殖反应、IFN2gamma和IL24, 而且均能对猪和豚鼠产生攻毒保护。目前FMDV腺病毒活载体疫苗的研究已取得了较大的进展, 有望在不久用于FMDV防治。31312 利用杆状病毒表达FMDV抗原杆状病毒(BEVS) 与其他表达系统相比的主要优点: ( 1) 可有极大的杆状病毒核衣

37、壳和基因组;( 2) 借助于多元表达载体或共同感染可以同时表达多个外源基因; ( 3) 对脊椎动物无病原性, 也未有在哺乳动物细胞内进行病毒DNA转录, 有效复制或基因整合到哺乳动物细胞基因组内报告, 因此可以认为是一种遗传学上安全的表达载体; ( 4) 昆虫细胞作为较高等真核生物细胞能完成表达产物的一系列翻译后加工修饰, 绝大部分外源基因表达产物均有良好的生物活性; ( 5) 具有强启动子, 很多外源基因均可得到超高表达。因此, 作为良好的表达载体, 在动物口蹄疫防治方面, BEVS也有巨大的应用前景。李志勇等 17成功地用家蚕杆状病毒表达体系表达了FMDV亚洲Ñ 型空衣壳抗原。其

38、表达产物作抗原制备疫苗免疫牛, 免疫动物均产生了特异性抗体。免疫后21 d进行病毒攻击保护试验, 获得了50% 的完全保护。L i等 18 将Asia1 /HNK /CHA /05 FMDV 的P122A和3C基因重组家蚕杆状病毒, 用其表达产物接种牛, 均可检测到抗体, 经同源病毒攻击, 80% 可获得保护。张小丽等 19 将FMDV 2C 及3AB 片段重组于杆状病毒穿梭质粒pMelBac2B, 表达的目的蛋白能与牛、羊、猪的O型FMDV阳性血清发生特异性反应。许多学者对活载体疫苗寄予了很大的希望, 但重组病毒疫苗仍然处于研究和探索阶段。与灭活疫苗相比, 在基因表达效率及天然产物的生物学活

39、性一致性等方面值得进一步探讨。活载体疫苗是近年来研究的热点之一, 通常采用非致病性微生物作载体构建重组体制备多价联苗, 如疱疹病毒、腺病毒、痘病毒及由痘病毒衍生而来的非复制型载体。因口蹄疫病毒是通过呼吸道感染的, 而且易形成持续感染, 所以研制黏膜免疫疫苗也是目前的重点, 例如用牛的非致病性腺病毒、沙门氏苗、分枝结核杆苗作载体的活载体疫苗。、核酸疫苗核酸疫苗(nucleic acid vaccine)又称为基因疫苗，是指将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA 或RNA)直接转移到动物体内，通过宿主表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主对该抗原蛋白产生免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗包括DN

40、A疫苗和RNA 疫苗， 目前研究较多的是DNA 疫苗。由于DNA 既是载体又是抗原的来源，DNA 疫苗不需其它任何化学载体， 因此被称为裸疫苗(naked vaccine)。2001 年Benvenisti将FMDV 完整的结构基因P1 和非结构基因2A、3CD 串联起来，同时加入脑心肌炎病毒(EMCV)内部核糖体进入位点(IRES)，并通过免疫荧光和免疫斑点技术检测到病毒蛋白在体外表达和加工，利用基因枪注射到猪皮肤中，部分猪可以抵抗FMDV 强毒的攻击29。同年，Shieh 为了克服亚单位疫苗不能产生持久的免疫保护，通过基因免疫和亚单位疫苗联合免疫来增强免疫效果，首先用含有FMDV 主要免疫

41、原性基因VP1 的质粒免疫小鼠， 接下来用VP1 多肽偶合物刺激，免疫的小鼠能产生高效价的抗体，并具有中和FMDV 的活性30。通过研究发现， 保护性抗原基因可以是编码VP1 抗原位点上的多个表位(如VP1的141160、200213 和2140)31-34，也可以是单个基因(如VP1)32或一组基因（如P1、2A、3C 和3D）35-38，甚至可以是FMD 抗原编码基因与其他具有协同保护功能的基因连在一起(如VP1 和IgG 的重链恒定区)DNA 疫苗是指那些注入动物体内后能够诱导机体产生免疫反应的病毒保护性抗原基因表达质粒。早在20 世纪70 年代末, 人们就证实了动物体内具有摄取裸露DN

42、A 分子的能力。20 世纪80 年代中期, 利用克隆的目的基因, 通过体内直接转染的方法大量用于基因治疗途径的研究。近几年, 基因免疫在FMDV 免疫研究中得到广泛的应用。Beard C 等 11 构建了两个不同的质粒, 一个质粒pP12X3C 携带有FMDV 衣壳蛋白前体基因P1和蛋白酶3C 基因, 用基因枪将该质粒接种动物可检测到特异性的体液反应。第2 个DNA 质粒pWRMHX, 携带有编码完整病毒的基因组( 但删除了其细胞结合位点) , 用该质粒接种猪后可以产生病毒样粒子并诱导产生中和抗体。比较两种质粒pP12X3C 和pWRMHX 接种猪后的效果结果显示,携带有复制病毒基因组的质粒D

43、NA 可以产生较强的免疫力, 应用pWRMHX 经肌肉注射、鼻内接种和基因枪途径接种的猪均对强毒攻击产生部分保护力。Chan E W 等 12 构建pCEIM 和pCEIS 两个质粒, 它们分别含有FMDV 的VP1 基因的主要抗原位点( 氨基酸残基的第141 位 160 位和200 位213 位氨基酸) 和鼠及猪的免疫球蛋白基因。用它们分别接种小鼠( 腹部皮下) 和猪( 耳背部皮下) , 前者可刺激小鼠产生特异性的T 淋巴细胞增生和中和抗体。后者两次免疫的猪也出现T 淋巴细胞增生( SI 可达8. 1) , 并产生高效价的中和抗体。在攻毒实验中, 应用pCEIS 进行免疫的猪可百分之百的保护

44、。Ma Mingxiao 等 13 在总结国内外学者研究的基础上, 利用FMDV 2A 蛋白自身裂解性和双启动真核表达载体, 构建了FMDV P122A、猪IL218 和FMDV 3C 共表达的核酸疫苗pVIR2P12AIL1823C和不携带猪IL218 的核酸疫苗pVIR2P12A23C, 研究结果表明, 两个核酸苗均对同源FMDV 对猪的攻毒具有很好的保护性, 且携带有猪IL218 基因的核酸苗免疫效果优于不携带猪IL218 的核酸疫苗。它是指将编码某种抗原蛋白的外源基因DNA直接转移到动物体内, 通过宿主表达系统合成抗原蛋白, 诱导宿主对该抗原蛋白产生免疫应答, 以达到预防和治疗疾病的目

45、的。Benven isti 20 将FMDV完整的结构基因P1和非结构基因2A、3CD串联起来, 同时加入脑心肌炎病毒(EMCV ) 内部核糖体进入位点( IRES), 并通过免疫荧光和免疫斑点技术检测到病毒蛋白在体外表达和加工, 利用基因枪注射到猪皮肤中, 部分猪可以抵抗FMDV 强毒的攻击。L i 21 构建了以嗜酸乳酸菌基因组为载体插入FMDV O/XJ1VP1基因的DNA疫苗, 肌肉注射免疫BALB /C小鼠后可诱生特异性抗体。Ma等 22利用FMDV 2A蛋白自身裂解性和双启动真核表达载体, 构建了FMDV P122A、猪IL218 和FMDV 3C 共表达的核酸疫苗pVIR2P12

46、A IL1823C 和不携带猪IL218 的核酸疫苗pVIR2P12A23C, 研究结果表明, 两个核酸苗均对同源FM2DV对猪的攻毒具有很好的保护性。Wang等 23用IL215与FMD DNA疫苗混合后联合免疫猪, 用活毒攻击后100% 得到保护。目前除了用佐剂与DNA 疫苗联合免疫, 有研究表明补体与DNA疫苗的联合免疫动物抵抗活毒的效果明显, 这为开发DNA疫苗嵌合体提供了新的技术途径DNA 疫苗遴选方面的研究是20世纪90 年代才开始的, 被誉为疫苗生物技术的第三次革命。美国梅岛动物病毒研究所在口蹄疫DNA疫苗研究中作了大量工作, 构建了不同基因组合的DNA 疫苗, 通过小鼠和猪体试

47、验, 显示较好的效果,但大部分实验室仍在探索之中可饲疫苗随着基因工程的发展，人们开始利用植物来生产药物和疫苗。MasonH S 等39提出了利用转基因植物生产可饲疫苗的概念。随后的研究认为转基因植物疫苗对预防和消除某些疾病有广阔的应用前景。利用转基因植物生产疫苗已受到高度重视，是当前新型疫苗研究的热点之一。早在1998年，Carrillo 等用FMDV 的主要保护性抗原基因VP1 获得了转基因拟南芥，用叶浸提取物免疫小鼠，可诱导产生特异性抗体，所有免疫的小鼠都能抵抗FMDV 强毒半数致死量的攻击，这是有关转基因植物表达的病毒抗原使免疫动物全部获得保护的首篇报道40。Wigdorovitz A

48、等41用表达FMDVVP1 的转基因苜蓿口服免疫或非经肠道免疫小鼠产生了相似的病毒特异性免疫反应，用FMDV 强毒进行攻毒试验，小鼠得到了完全的保护。随后，Dus Santos M J 等42 又用表达FMDV P1 全长和3C 蛋白酶的转基因苜蓿，非经肠道免疫小鼠产生了免疫反应， 用FMDV 强毒进行攻毒试验， 小鼠保护率可达100%。Carrillo等43利用花椰菜花叶病毒（CaMV）35S单/双启动子在马铃薯中成功地表达了FMDV VP1 基因， 免疫动物后能引起特异性抗体应答并能保护动物抵抗强毒的攻击。此外，国内很多学者也成功地在玉米、胡萝卜、番茄等作物中实现了FMDV 免疫原性基因的表达，并获得了动物保护性试验的成功。可饲( 食) 疫苗即利用农杆菌或基因枪等技术,将免疫原性基因导入植株中, 获得能表达免疫原基因的植株。FMD 转基因植物可饲疫苗是研究较早