紫外分光光度法与紫外分光光度计的选购

1、紫外分光光度法与紫外分光光度计的选购主要内容 紫外可见光谱法应用及其发展 用好紫外可见分光光度计 紫外可见光分光光度计的选购体会一、紫外可见光谱法应用及其发展UV-VIS波长范围 190-400nm 紫外区 400-750nm 可见区 750-1100 nm 近红外区吸收光谱来源 吸收光度法：当一束连续光源通过单色器，吸收光度法：当一束连续光源通过单色器，被分解为各个波长单色光，单色光通过样被分解为各个波长单色光，单色光通过样品后被选择性吸收，用光检测器给予记录品后被选择性吸收，用光检测器给予记录不被吸收的透过光，形成的图像就是吸收不被吸收的透过光，形成的图像就是吸收光谱光谱选择性吸收 物质对

2、光光的吸收是选择性选择性的，利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性，这就是光谱法的光谱法的基础基础。 有机化合物的紫外可见吸收光谱是三种电子跃迁的结果：电子、电子、n电子。峰型及强度 最大吸收波长 峰宽 强度吸收光谱强度 I I0 0a + Ia + It t + Ir + Ir T%T%（透射率）（透射率）I It t/I/I0 0100%100% A=-lgTA=-lgT定量基础比尔定律 A（） - lgT =（）LC ：摩尔吸光系数，是物质对特定波长：摩尔吸光系数，是物质对特定波长光吸收能力的量度，其物理意义是光吸收能力的量度，其物理意义是1mol单单位浓度位浓度1cm单位光程时

3、的吸光度。单位光程时的吸光度。 L L：光程：光程 C C：浓度：浓度 成立条件：成立条件：单色光、澄清的稀溶液单色光、澄清的稀溶液 K 由于共轭性吸收带，起因与多烯、烯酮等 B 由于苯（环）性，起因于芳香族、杂芳香族化合物，有时候尚能显示精细结构 R由于自由基性吸收、起因于CO、NO2等发色基团苯环、酰基苯环、酰基CC H3On p*p p*紫外可见分光光度计的主要应用（1）定性分析（参加）定性分析（参加） （2）结构分析（参加）结构分析（参加）（3）纯度检查）纯度检查例如：例如： CCl4中有无CS2 ，只要看318nm处的吸收峰； 乙醇中是否含苯，只要看256nm的强吸收峰（4）定量分析

4、（）定量分析（Beer定律，主要应用）定律，主要应用） 例如：例如： Cr6+测定； 水中氨氮测定、土壤有效硼、维生素C（5）动力学分析）动力学分析例如：例如： 测定反应速度常数、测定催化效率、酶催化UV-VIS的应用及其最新进展 新发展之一应用领域不断扩大药品检验、医疗卫生、化学化工、环保、地质、冶金、石油、食品、生命科学、材料科学、计量科学等科研、教学及生产中，使用最多、覆盖面最广的分析仪器。 新发展之二许多分析方法衍生出专业的分析仪器：水质COD分析，水质总氮分析，全自动生化分析仪，膜厚分析仪，白度分析仪器，快速成像仪，农残快速分析仪、叶绿素分析仪、黑碳仪等等AethalometerTM

5、 黑碳仪黑碳仪 新发展之三新方法的应用化学计量学的发展（1）褶合光谱软件包（Convelution Spectrum） 第二军医大学 吴玉田教授。可以对样品不经过分离，直接应用紫外可见光度计分析含有6个不通组分的试样，这一发明，对药物分析工作来说，是一个重大突破，引起了国内外广泛注意。（2）PE公司Quset软件包，与Lambda 9紫外可见分光光度计联用，可直接分析10个组分。（3）高阶张量数据解析复杂黑白灰体系分析湖南大学 俞洳勤院士，。（4）PLS、因子分析、遗传算法 （5）导数光谱的应用新发展之多分析联用技术 生命物质等联用技术，HPLC DNA/蛋白质分析 流动注射分析 FIA联用

6、积分光度法的复兴积分球应用、材料、太阳能谱、固体粉末表面性质研究，突破了以液体为分析对象的局限，极大的扩展了分析领域紫外可见分光光度计的组成（1）光源）光源（2）单色器）单色器（3）吸收池）吸收池（4）检测器）检测器紫外可见分光光度计的分类1. 1. 单光束单光束: :一束单色光一束单色光, ,一只比色皿一只比色皿, ,一只光电转换器一只光电转换器优点优点: :结构简单结构简单, ,价格便宜价格便宜 缺点缺点: :光度准确度等主要技术指标比较差光度准确度等主要技术指标比较差, ,故分析误差较大故分析误差较大.(.(因因杂散光杂散光, ,光源波动光源波动, ,电子学的噪声等都不能抵消电子学的噪声

7、等都不能抵消) )注注: :一般要求较高的制药行业、检验行业、科研等行业不适宜。一般要求较高的制药行业、检验行业、科研等行业不适宜。2. 2. 准双光束准双光束: :二束光，只有一只比色皿。其中，一束光通过比色皿，另二束光，只有一只比色皿。其中，一束光通过比色皿，另一束光不通过比色皿（这束光主要起抵消光源波动对分析误差影响的一束光不通过比色皿（这束光主要起抵消光源波动对分析误差影响的作用）作用）优点优点: :结构较简单结构较简单, ,价格较便宜，光度准确度等指标较单光束仪价格较便宜，光度准确度等指标较单光束仪器好。器好。3. 3. 双光束：双光束：二束光，二只比色皿，一只或二只光电转换器（以一

8、只光电二束光，二只比色皿，一只或二只光电转换器（以一只光电转换器常见）如转换器常见）如1810D1810D系列和系列和1919系列系列优点优点: :光度准确度等主要技术指标好光度准确度等主要技术指标好, ,分析准确度高分析准确度高缺点缺点: :结构复杂，价格较贵。结构复杂，价格较贵。主流技术主流技术4.4.双波长：双波长：采用两个单色器采用两个单色器优点：主要适用于试样的多组分测量。优点：主要适用于试样的多组分测量。已经很少见已经很少见单光束双光束 近十年来，紫外/可见分光技术变化不大，始终没有革命性的突破。然而，随着光学设计、电子技术和软件的进步，使得仪器的复杂性降低，可靠性和分析效能提高，

9、这些都说明传统仪器也在不断发展。 高性能新器件的发展，例如氙灯光源、CCD/PDA检测器、光纤探头附件仪器新进展 目前国际上的高档紫外仪器：p PE lamdaPE lamda 900/950 900/950 （S.L. 7S.L. 710107 7，N N 0.00005A0.00005A （P-PP-P）p 热电热电 Evolution 300 Evolution 300 （S.L. 8S.L. 810107 7，N N 0.0002A0.0002A （P-PP-P）p Varian Cary 5000i Varian Cary 5000i （ S.L. 5S.L. 510107 7，N

10、N 0.0002A0.0002A （P-PP-P）p 日立日立 U-3200U-3200（S.L. 5S.L. 510106 6，N N） U-3400U-3400（S.L. 1S.L. 11010，N N）p 岛津岛津 UV-3101PCUV-3101PC（S.L. 1S.L. 110106 6，N N） UV-2401PCUV-2401PC（S.L. 1.5S.L. 1.510104 4，N N）p 北京普析通用北京普析通用 TU-1901TU-1901（S.L. 1S.L. 110104 4，N N 00035A 00035A（P-PP-P） 国际高档紫外可见分光光度计发展向5个方向追求

11、：（1）更低的杂散光 （2）更小的仪器噪声 （3）向小型化、专业化发展（4）附件的开发与发展（5）向短波、长波扩展 1753300nm（1）杂散光 定义：单色器额定通带以外的透射辐射能量与总的透射能量之比，也就是光谱通带以外“不要的”光通量就是杂散光。 测定方法：标准滤色片法 或NaI(220nm)、NaNO2(340nm)溶液。重要性：是分析误差的主要来源之一，它直接限制了被分析测试样品浓度的上限杂散光与吸光度相对误差 例：如对某生物酶检测：它的吸光度为1.95Abs，要求1%误差；如果仪器的S.L.=0.2%（0.002s），行不行？ 不行！因其误差为3.6%！只有S.L.=0.05%（0

12、.005s），才可达1%！ 杂散光的影响，会使分析测试的结果偏离比尔定律杂散光对测量线性的影响杂散光对测量线性的影响 实验技巧因为杂散光强度在边缘波段比较大，所以在波长小于220nm测试时，必须认真检查有无“假峰”出现。定义：一种随时间而变化、但又是随机的输出信号。 测定方法：开机预热、500nm处时间扫描120秒，测定P-P值，注意不是RMS值！ 主要来源：光学系统、光源、检测器、电子元器件及电路设计等。 重要性：是分析误差的主要来源之一，它直接限制了被分析测试样品浓度的下限。（2）噪声噪声与吸光度相对误差和吸光度真值的关系噪声与吸光度相对误差和吸光度真值的关系 例如，某紫外可见风光光度计的

13、噪声N=0.002A，在测试某样品吸光度真值为0.1A。则A/A0=0.002/0.2100%=2%即由仪器噪声引起的相对误差则达到2%水平比较表水平比较表厂商型号 PhotometricAccuracy(光度准确度)Stray Light（杂散光）PhotometricNoise（噪声）D r a f t（ 基 线漂移）B a s e l i n e Flatness（基线平直度）日本ShimadzuUV-310PC0.002A(0-0.5A)0.004A(0.5-1A)+0.3%T0.0001%(220nm)0.0001%(340nm)Not Listed 0.0004A/h2H后0.00

14、1A(210-800nm) SBW 2nm日本ShimadzuUV-2401PC+0.002A(0-0.5A)0.004A(0.5-1A)+0.3%T(0-100%T)0.015%(220nm)0.015%(340nm)Not Listed0.0004A/h2H后0.001ASBW 2nm低速扫描中国普析通用TU1901+ 0 . 0 0 2 A（0-0.5A）0.004A(0.5-1.0A)+0.3%T(0-100%T)0.01%(220nm,340nm)+0.00035A500nm,0A,SBW 2nm0.0004A/h2h后，500nm，SBW 2nm0.001A(200-850nm)S

15、BW 2nm0A中 、 慢 速 扫描技术指标比较技术指标比较表表主要技术指标TU-1901中国普析通用Cary50美国VarianU-3010日本 日立2401PC日本岛津波长范围190-900nm190-1100nm190-900nm190-900nm波长准确度+ 0.3nm+0.5nm+0.3nm+0.3nm光谱带度0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0nm1.5nm（固定）0.1,0.5,1,2,4,5nm0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0nm杂散光0.01%T(220nm)0.005%T(220nm)0.015%T(220nm)0 . 0 1 5 % T（220nm

16、）光度准确度+0.002A(0-0.5A)+0.004A(0.5-1A)+0.005A(1A处)+0.004A(1A处)+0.004A(1A处)光度噪声+0.0004A（P-P值）500nm. 0A0 . 0 0 0 1 A ，RMS，500nm, 0A0.0001A，RMS，500nm, 0A未给出基线漂移0.0004A/h;500nm, 0A,预热2h0.0004A/h;500nm, 预热30分钟0.0004A/h;340nm 0.0004A/h;500nm, 0A预热2h基线平直度+0.001A;SBW 2nm190-900nm+ 0.001A200-850nm + 0.001A200-

17、850nm + 0.001A200-850nm 光检测器光电倍增管（PMT）2个硅光电二极管光 电 倍 增 管（PMT）光 电 倍 增 管（PMT）（3）仪器向小型化、专业化发展 由于环境、野外、海油等分析现场测试的需要，开发专业的便携仪器成为一种趋势。国际上已经有好多制造商正在研究开发适合于各种不同使用对象的小型仪器。 美国Ocean Optic PC2000卡式分光光度计；USB接口的USB2000微型光度计；美国CID公司CI700；普析通用公司PORS15；美国HACH公司DR2400/DR2500农残速测仪器 PORS15水质分析仪水质分析仪USB2000SPAD-502叶绿素仪器叶

18、绿素仪器 农残分析仪农残分析仪（4）附件的开发与发展 附件的开发成为仪器发展的主要内容之一，附件的增加满足了很多客户特殊的测量要求。二、用好紫外可见分光光度计紫外方法分析应用中值得注意的几个问题1. 暗电流暗电流：直接造成光度准确度不好，测定误差大。包括仪器的电路部分的固有的暗电流；由于光学系统密封不好以及样品室密封不好进来的光照到接收器上产生的电流。校正条件：重装软件；电压变化；环境发生变化；发现光度准确度有差异。2. 重复性不好重复性不好：首先要检测仪器的稳定性和噪声是否合格。如不合格，检测电压是否稳定、是否可靠接地；石英比色皿与玻璃比色皿混用。比色皿不干净。比色皿制作质量挥发性强的有机溶

19、剂要加盖。溶液本身的问题。比色皿3、正确使用参比溶液与空白、正确使用参比溶液与空白 工作曲线中参比（空白）有好多种，如溶剂参比，试剂参比，样品参比，褪色参比等等 应根据不同的情况选择不同的参比溶液。（1）如果被测试液、显色剂及所用的其它试剂均无颜色，可选用蒸馏水做参比溶液。（2）如果显色剂有颜色而被测试液和其它试剂无色时，可用不加被测试液的显色剂溶液作参比溶液。（3）如果显色剂无颜色，而被测试液中存在其它有色离子，可用不加显色剂的被测试液作参比溶液。（4）如果显色剂和被测试液均有颜色，可将一份试液加入适当的掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂和其它试剂均按照操作手续加入，

20、以此作为参比溶液，这样可以消除显色剂和一些共存组分的干扰。4、光谱带宽的选择、光谱带宽的选择仪器分辨能力的指标，是分析误差的主要来源之一Owen提出：紫外可见分光光度计的光谱带宽应该小于等于自然带宽1/10时，分析准确度可达99.5%仪器带宽 nm仪器带宽/自然带宽Aobs/AAA/A100%0.40.020.99950.00040.0520.10.9950.00390. 4650.250.9710.02452设自然带宽为20nm， 实测A=0.85Abs 例：我国药典规定对青霉素钠测试使用1nm光谱带宽。 使用原则：在一定条件下，吸光度随光谱带宽变化，以获得最大吸光度值的带宽为准，同时考虑噪

21、声带来的影响带宽 nm210.30.2吸光度Abs0.8050.8250.8650.823误差 %6.94.64.95、分析波长的选、分析波长的选择与动态范围择与动态范围1、波峰 最灵敏、误差较小2、肩峰 要求仪器波长准确度好三、紫外可见光分光光度计选购体会国内外的生产厂家和主要产品欧美欧美PE Lambda 750 ，850，950等系列热电 Evolution300/600 等系列德国耶拿 SPECORD 200 ，SPEKOL 1300 等系列瓦里安 CARY50,CARY 5000 等系列日本日本岛津 UV-1700，MultiSpec-1500 UV-3150等系列 日立 U-1800，U-2800，U-3310， U-4100 国内国内 普析通用 1901系列 1810系列 T6系列瑞利 UV-2100 等系列尤尼柯 UV-3802 等系列莱伯泰科 LabTech UV-1000/1100系列上海精科 UV762等系列Lambda 950 李昌厚 紫外可见分光光度计 化学工业出版社1、适用