RNAi and QPCR RNA干扰

1、RNAiRNAi实验原理与方法实验原理与方法 RNAi 发现历程：发现历程：1990年，曾有科学家给矮牵牛花插入一种催生红色素的基因，希望能够让花朵更鲜艳。但意意想不到想不到的事发生了：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色！1995年 康奈尔大学 Guo等在对线虫C.elegans的研究中，应用正义链RNA作为对照，研究par-1基因的表达，意外的发现，正义链RNA与反义链RNA同样能够抑制目的基因的表达。1998年，Andrew Fire等首次将正义链反义链RNA混合注入线虫C.elegans中，观察到更强的基因表达抑制。首次提出了RNA interference的概念。A control: n

2、ot stainedB: wtC: wt + antisense RNAD: wt + ds RNAMex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridization2006年的诺贝尔生理学奖获得者：年的诺贝尔生理学奖获得者：RNAi的分子机制的分子机制 将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。 RNA干扰包括起始阶段和

3、效应阶段干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)起始阶段：起始阶段：加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3端都有2个碱基突出。 RNAiRNAi效应阶段：效应阶段：siRNA双链结合一个核酶复合物从而

4、形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。 RNAi pathwaySiRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。 MicroRNA（miRNA,微RNA）即为长

5、度为22nt左右的5端带磷酸基团、3端带羟基的非蛋白编码的调控小RNA家族。miRNA广泛存在于真核生物中，不具有开放阅读框架，不编码蛋白质，一般长20-24nt。 1. 二者的长度都约在22 nt左右；2. 二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点；3. 二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在；4. 二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰， 如二者在介导沉默机制上有重叠；5. miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的。 miRNA与与siRNA相同之处相同之处：1.1.根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；

6、而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。2.2.结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。3.3.Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。4.4.在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3-UTR区，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。5.5.在作用方式上，miRNA可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。6.6.mi

7、RNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。 miRNA与与siRNA的不同点的不同点：MicroRNA geneTransposons , transgenes, viruses, heterochromatic DNAMicroRNAs and Short Interfering RNAs(一一)siRNA的设计的设计 1、提供在线或技术服务的公司、提供在线或技术服务的公司2、RNAi目标序列的选取目标序列的选取 (1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3端的19个碱

8、基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。 Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5和3端的非编码区，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。 (2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。 (3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。 一个完整的siRNA实验应该有阴

9、性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。 3 3、阴性对照阴性对照 http:/ /Stu/shilin/rnai.html 4 4、目前已证实的目前已证实的siRNAsiRNA可以在下面的网页找到：可以在下面的网页找到：目前为止较为常用的方法有通过化学合成，体外转录，长片段dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)体外制备si

10、RNA；以及通过siRNA表达载体或者病毒载体，PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。 ( (二二)siRNA)siRNA的制备的制备1.1.化学合成化学合成 许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成34对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。 最适用于：最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究。 不适用于不适用于：筛选siRNA等长时间的研究。2.2.体外转录体外转录 以DNA O

11、ligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。 最适用于：最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。 不适用于：不适用于：实验需要大量的，一个

12、特定的siRNA。长期研究。 其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是2001000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。 3.用用RNase I

13、II 消化长片断双链消化长片断双链RNAdsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，节省时间和金钱（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。 最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型 。 不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗 。 前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于PC

14、R的表达框架则属于：从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。 体内表达体内表达多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载

15、体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。4. siRNA表达载体表达载体siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。 病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。 最适用于：最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。 不适用于：不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）

16、。 siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建s

17、iRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。 5. siRNA表达框架表达框架这个方法的主要缺点是这个方法的主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中；不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。 最适用于：最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子 不适用于：不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后可以） 将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：1. 磷酸钙共沉淀 2. 电穿孔法3. DEAE-葡聚糖和polybrene4. 机械法5. 阳离子脂质体试剂 (三三)siR

18、NA的转染的转染将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。1.磷酸钙共沉淀磷酸钙共沉淀电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。

19、一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。2.电穿孔法电穿孔法带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。 3.DEAE-葡聚糖和葡聚糖和polybrene转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。 4.机械法机械法在优化条件下

20、将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。现存对DNA转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体 。5.阳离子脂质体试剂阳离子脂质体试剂为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意为了达到高的转染

21、效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点：以下几点： 1.纯化纯化siRNA 在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免避免RNA酶污染酶污染 微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。 3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性健康的细胞培养物和严格的操作确保

22、转染的重复性 通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。 4.避免使用抗生素避免使用抗生素 推荐从细胞种植到转染后72小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到最佳转染效果。 5.选择合适的转染试剂选择合适的转染试剂 针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。 6.通过合适的阳性对照优化转染和

23、检测条件通过合适的阳性对照优化转染和检测条件 对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞（同样适合实验靶siRNA），转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。 RNAi实例：Target gene：c-myc 查找靶基因mRNA 利用网络在线支持，寻找siRNA序列 根据目的选择实现RNAi的策略：推荐载体法。 根据查找的siRNA序列，合成长链oligo 构建载体 转染 检测效应（包括干扰效应和生物学效应）目的基因目的基因mRNA获取：获取：2、http:/www.ncbi.nlm.nih

24、.gov/ 3、http:/ or http:/ 1、检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对）RNAi 的应用： 功能基因组学 药物靶筛选和验证 细胞信号传导通路分析 基因治疗的新策略（1）在功能基因组中的应用）在功能基因组中的应用 在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降低突变，以确在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降低突变，以确定其功能。定其功能。由于由于RNAi具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此功能丧失或降低突变，因此RNAi可以作为一种强有力的研究工具，用可以作为一

25、种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。于功能基因组的研究。将功能未知的基因的编码区（外显子）或启动子区，以反向重复的方式将功能未知的基因的编码区（外显子）或启动子区，以反向重复的方式由同一启动子控制表达。这样在转基因个体内转录出的由同一启动子控制表达。这样在转基因个体内转录出的RNA可形成可形成dsRNA，产生，产生RNA干涉，使目的基因沉默，从而进一步研究目的基因干涉，使目的基因沉默，从而进一步研究目的基因的功能，这种技术即为的功能，这种技术即为RNAi技术。技术。根据所选用序列的不同，可将其分为根据所选用序列的不同，可将其分为编码区编码区RNAi和和启动子区启动子区RNAi技术。技术。

26、 （2）在基因治疗中的应用在基因治疗中的应用 治疗治疗HIV 感染：感染：由于由于RNAi是机体中古老而天然的抗病毒机制，是机体中古老而天然的抗病毒机制，HIV病毒感染是我病毒感染是我们亟待解决的问题，将们亟待解决的问题，将RNAi技术应用于艾滋病治疗是顺理成章技术应用于艾滋病治疗是顺理成章之事。之事。针对针对HIV病毒研究有病毒研究有Jacque等设计的抑制等设计的抑制HIV 1长末端重复序列、长末端重复序列、附件基因附件基因vif和和nef表达的表达的siRNA，Lee等针对等针对rev转录子设计的转录子设计的siRNA及及Novina等等针对针对HIV病毒病毒gag基因设计的基因设计的s

27、iRNA，其基本，其基本策略都是选择策略都是选择HIV病毒或宿主细胞基因为靶点病毒或宿主细胞基因为靶点。治疗肝炎病毒感染：治疗肝炎病毒感染：斯坦福医学院的研究人员，把dsRNA放进小老鼠的肝细胞，dsRNA被小老鼠体內的核酸酶分解成许多siRNA。研究发现siRNA具有高度专一性，会与小老鼠体內的丙型肝炎病毒的mRNA相结合，使mRNA分解并失去转译蛋白质的功能。斯坦福医学院运用此技术来治疗丙型肝炎的研究，已从体外试管实验阶段推进至体內的动物实验。且在小老鼠身上，看到丙型肝炎病毒被阻断的明显效果。 应用RNAi技术抑制肿瘤细胞（如肝癌细胞、胆管癌细胞等）中血管生长因子如血管生成素如angi1、

28、angi2、angi3及VEGF等或其受体的表达，以及抑制肿瘤细胞中如癌基因bcl2、RAS、Tp53等突变基因及其蛋白的表达而不影响非突变基因的表达，可达到很好的抗肿瘤生长及抗肿瘤转移的目的。 治疗肿瘤：治疗肿瘤： 细胞间粘附分子-1（ICAM-1）是重要的介导细胞粘附和T细胞激活的分子，应用与ICAM-1基因序列特异的siRNA阻断 ICAM-1 mRNA和蛋白的表达，可以明显降低大鼠同种移植心的移植物血管病的发生的程度和缺血再灌注损伤。 抗器官移植排斥反应：抗器官移植排斥反应：实时荧光定量实时荧光定量PCR技术技术 荧光定量荧光定量PCRPCR与常规与常规PCRPCR的区别的区别 常规常

29、规PCRPCR技术：技术： 对PCRPCR扩增反应的终产物进行定性及定量分析 荧光定量荧光定量PCRPCR技术：技术： 对PCRPCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量分析实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的特点的特点特异性 荧光定量PCR具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高。 敏感性 荧光定量PCR的敏感度通常达102拷贝/ml，对数期分析，线性范围很宽，为0-1011拷贝/ml。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-1010/拷贝，在此范围内荧光定量PCR定量较为准确，标本不需稀释。 重复性 荧光定量PCR结果相当稳定，因为域值设置在指数扩增期.在此阶段，各反应

30、组分浓度相对稳定，没有副作用，CT与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比CT值能更稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数。 自动化 无PCR后续操作步骤，降低产物污染的风险性。 Real-Time Quantitative PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR技术的发展过程中，两个重要的发现推动了荧光定量技术的大力发展：在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光标记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能；此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应

31、管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展推动实时荧光定量PCR方法在研究工作中的运用。 定量原理定量原理 PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在实时荧光定量PCR反应中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景

32、明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。 基线（基线（BaselineBaseline）是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。 光域值光域值thresholdthreshold一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。 CTCT值值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷

33、贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 数学原理：数学原理：Ct值极具重现性终点处检测产物量不恒定；终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性值则极具重现性Ct与初始模板的关系固定循环数后，荧光信号与模板数成正比固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比初始DNA量越多, 荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct值)越少起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量0.000.50

34、1.001.502.002.503.001416182022242628303234363840CycleRnThreshold104103102常用的荧光定量常用的荧光定量PCRPCR试剂试剂 SYBR Green I Taqman水解探针 分子信标结合到双链DNA的小沟部位染料只有和双链DNA结合后才发荧光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAABound SYBR Green IUnbound SYBR Green IPCR探针探针荧光素荧光素淬灭剂淬灭剂水解型杂交探针水解型杂交探针q目标特异性探针q5 为荧光素， 3 为淬灭剂5 荧光素3淬灭剂与目标序

35、列互补RQReporterQuencherRQIntact probe - reporter quenched by FRETFRRQDuring PCR, probe hybridizes to target sequenceRQProbe is partially displaced during extensionRQProbe cleaved by 5- 3 nuclease activity of polymeraseRQFree reporter exhibits unquenched fluorescence发夹型杂交探针发夹型杂交探针茎由互补配对的序列组成茎由互补配对的序列组成环与目标序列完全配对环与目标序列完全配对茎茎荧光素荧光素淬灭剂淬灭剂环环模板定量有两种策略；相对定量和绝对定量。相对定量指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化。绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量。目前最常用的有 三种定量方法定量策略定量策略 1. 标准曲线法的绝对定量，此方法是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。标