药物分析-第十一章抗生素类药物的分析

1、一、概述一、概述1.抗生素（抗生素（antibiotics）：）： 在低微浓度下即可对某些生物在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）病原微生物）的生命活动有特异的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称抑制作用的化学物质的总称2.分类分类内酰胺类内酰胺类氨基糖苷类氨基糖苷类四环素类四环素类大环内酯类大环内酯类多烯大环类多烯大环类多肽类多肽类3.来源：来源： 生物合成（发酵）生物合成（发酵） 化学合成或半合成化学合成或半合成4.抗生素的特点：抗生素的特点： 化学纯度较低化学纯度较低 活性组分易发生变异活性组分易发生变异 稳定性差稳定性差生产工艺复杂生产工艺复杂发酵过程不易控发酵过程不易控制易受污

2、染制易受污染5.抗生素质量分析抗生素质量分析采用采用生物学法生物学法与与物理化学法物理化学法鉴别：鉴别：理化方法理化方法、微生物法微生物法检查：检查：水分、水分、pH值、异常毒性、热原、细菌值、异常毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等内毒素、降压物质等含量含量/效价测定：效价测定： 微生物法微生物法 ： 与临床疗效吻合与临床疗效吻合,灵敏度高；但灵敏度高；但操作复杂费时操作复杂费时 理化方法：理化方法：准确度与专属性较高准确度与专属性较高, 且操作简且操作简便；但与临床疗效有偏差便；但与临床疗效有偏差二、二、 内酰胺类内酰胺类包括青霉素类和头孢菌素类包括青霉素类和头孢菌素类1.化学结构：化学结构

3、：青霉素类：青霉素类：6-APA为母核为母核头孢菌素类：头孢菌素类：7-ACA为母核为母核*2. 主要理化性质：主要理化性质：1）酸性（羧基）：）酸性（羧基）： pKa 2.5-2.8 酸性较强酸性较强 与碱金属成盐后水溶性好与碱金属成盐后水溶性好2） UV（共轭）：（共轭）： 青霉素类：苯环取代基青霉素类：苯环取代基 头孢菌素类：母核有共轭结构头孢菌素类：母核有共轭结构3）旋光性：）旋光性： 有多个手性碳有多个手性碳4）稳定性（内酰胺）：）稳定性（内酰胺）： 干燥条件较稳定，溶液不稳定干燥条件较稳定，溶液不稳定 青霉素青霉素 降解、失效降解、失效氧化剂、酸、碱氧化剂、酸、碱酶、金属离子、酶、

4、金属离子、3. 鉴别鉴别1）羟肟酸铁反应：）羟肟酸铁反应：内酰胺类内酰胺类 羟肟酸羟肟酸 显色显色2）茚三酮反应）茚三酮反应-氨基氨基 蓝紫色蓝紫色3）双缩脲反应）双缩脲反应内酰胺类内酰胺类 紫色紫色4）光谱法（光谱法（UV、NMR）5）色谱法（）色谱法（HPLC、TLC）NH2OHHClNaOHFe3+H+茚三酮茚三酮 碱性酒石酸铜碱性酒石酸铜呈呈色色反反应应取本品50mg溶于0.5ml重水中，测定NMR光谱时，应显示3.8 附近 6.97.5 7.99.0 单峰信号 多重峰信号 多重峰信号 2 ： 3 ： 5强度比强度比头孢氨苄鉴别的TLC条件ChP(2000) 5mg/ml 2l 硅胶G

5、 0.1mol/L枸橼酸液-0.2mol/LNa2HPO4-丙酮(120:80:3)；0.1%茚三酮溶液显色USP(24) 25mg/ml 5l 硅胶 醋酸乙酯-水-乙腈-冰HAc(48:18:14:14)；短波长UV光检出BP(1999) 0.4%(W/V) 1l 硅烷化硅胶HF254 15.4% NH4Ac(pH6.2)-丙酮(85:15)；254nm检出4.特殊杂质检查特殊杂质检查聚合物、有关物质、异构体等聚合物、有关物质、异构体等头孢他啶中聚合物测定头孢他啶中聚合物测定色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试验 用葡聚糖凝葡聚糖凝胶胶G-10（40120m）为填充剂，玻璃柱玻璃柱

6、内径1.31.5cm，床体积5060ml；流动相流动相A为含为含3.5%硫酸铵的硫酸铵的0.01mol/L磷酸磷酸盐缓冲液盐缓冲液（取磷酸氢二钠2.19g和磷酸二氢钠0.54g，加水1000ml使溶解，调节pH至7.0），流动相流动相B为为0.01%十二烷基硫酸钠溶液十二烷基硫酸钠溶液；流速为每分钟1ml；检测波长为254nm。以流动相流动相A为流动相，用为流动相，用1mg/ml蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖2000溶液进样溶液进样200 l进行测定，理论板数应不低于进行测定，理论板数应不低于900，拖尾因子在拖尾因子在0.751.5，对照品溶液以流动相对照品溶液以流动相B为流动相，为流动相，重复进样重

7、复进样200 l，峰面积值的相对标准差应小于，峰面积值的相对标准差应小于5.0%对照品溶液的制备：对照品溶液的制备：取头孢他啶对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含头孢他啶100g的溶液，摇匀测定法测定法 取本品适量，精密称定，加水制成每1ml中约含头孢他啶20mg的溶液，立即进样200l，以流动相以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图为流动相进行测定，记录色谱图；另取对照品溶液取对照品溶液200 l注入液相色谱仪，以流注入液相色谱仪，以流动相动相B为流动相，记录色谱图为流动相，记录色谱图，按外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过0.3%头孢呋辛酯中头孢呋辛酯中有关物质和异构体

8、有关物质和异构体的检查的检查 色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试验：测定头孢呋辛酯的HPLC系统为ODS分析柱分析柱；0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:?38）为流动相，流速1ml/min；检测波长278 nm。要求头孢呋头孢呋辛酯辛酯A，B异构体之间，头孢呋辛酯异构体之间，头孢呋辛酯A异构异构体与头孢呋辛酯体与头孢呋辛酯2-异构体之间的异构体之间的分离度应分离度应大于大于1.5；理论板数按头孢呋辛酯A异构体峰计算，应不低于1500异构体异构体 取本品适量，配制成每1ml中约含0.25mg的甲醇-流动相(11)的溶液，取20l注入液相色谱仪，记录色谱图。B异构体异构体峰的相对

9、保留时间约为峰的相对保留时间约为0.85，A异构体峰的相异构体峰的相对保留时间为对保留时间为1.0。供供试品色谱图中试品色谱图中A异构体异构体峰的面积与峰的面积与A、B异构异构体峰的面积和之比应为体峰的面积和之比应为0.480.55。 40020600302010时间(min)峰高(mAU)65432113.95411.9192.401 有关物质有关物质 取本品适量，精密称定，加流动相制成每每1ml中约含中约含0.2mg的溶液，作为供试品溶液的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相制成每每1ml中约含中约含6 g的溶的溶液，作为对照溶液液，作为对照溶液。取对照溶液20l注入液相色谱仪，调

10、节仪器灵敏度，使主成分峰高约为调节仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的记录仪满量程的10%，再取供试品溶液和对照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色记录色谱图至主峰保留时间的谱图至主峰保留时间的2.5倍倍，供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液主峰的面积5.含量测定含量测定1）碘量法（碘量法（ChP2000）原理：原理：青霉素与头孢菌素本身不与碘反青霉素与头孢菌素本身不与碘反应，但其应，但其碱性降解产物可消耗碘碱性降解产物可消耗碘青霉素族头孢菌素族NaOH水解4I2H +8I-I2+2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6定量过量定量过量剩余剩余 反应分

11、两步进行：反应分两步进行： 水解反应水解反应 ( (按化学计算量进行按化学计算量进行) ) 氧化氧化- -还原反应还原反应 ( (无定量关系，受温度、无定量关系，受温度、pH值和时间等因素影响，应严格控制反应值和时间等因素影响，应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定条件并采用标准品平行对照测定) )空白试验空白试验因样品中杂质会消耗碘，故应作空白因样品中杂质会消耗碘，故应作空白试验试验 空白试验与经典空白试验不同：空白试验与经典空白试验不同：加入样品，不加碱加入样品，不加碱，其余试剂（醋酸，其余试剂（醋酸盐缓冲液，碘液，硫代硫酸钠）都加盐缓冲液，碘液，硫代硫酸钠）都加试验条件：（试验条件：

12、（I2氧化）氧化）弱酸性（弱酸性（pH4.5） 碱碱 I2 IO3- + I- 酸酸 某些药物与碘生成复盐沉淀某些药物与碘生成复盐沉淀温度温度（2426） 温度温度38 时未水解时未水解的供试品亦消耗碘的供试品亦消耗碘反应时间：（反应时间：（ 20分分钟）钟）20分钟后，耗碘量随分钟后，耗碘量随时间的变化较小时间的变化较小特点特点灵敏度高：灵敏度高：样品样品 : : 碘碘 = 1 : 8= 1 : 8反应条件、实验操作要求高反应条件、实验操作要求高含量含量1 1份含量份含量V对对、V对空对空V样样、V样空样空加试剂次序、反应时间、滴定速度相同加试剂次序、反应时间、滴定速度相同含量含量 对照品对

13、照品 V样空样空 - V样样 W对对 V对空对空 - V对对 W样样2）电位配位滴定法（汞量法）电位配位滴定法（汞量法） 原理：原理：青霉素不与汞盐反应，其碱性降解产物可与青霉素不与汞盐反应，其碱性降解产物可与Hg2+络和络和 Hg+ + 2R-SH (RS)2Hg + 2H+ Hg2+OOHHRHHCNCCCSCONHCHCCOOHCH3CH3ROHHHCSCONHCCOOHCH3CH3HNCHg2+OHHCHCONHHOOCROCSCH3CH3CNHHg2+O方法说明：方法说明： a 空白试验与碘量法类似，加样品，不加空白试验与碘量法类似，加样品，不加NaOH b 与碘量法相比，汞量法不需

14、对照试验与碘量法相比，汞量法不需对照试验3）酸碱滴定法）酸碱滴定法4）硫醇汞盐法）硫醇汞盐法 青霉素青霉素 青霉烯酸硫醇汞盐青霉烯酸硫醇汞盐5）羟肟酸比色法）羟肟酸比色法 内酰胺类内酰胺类 红色红色6）HPLC法：应用广泛法：应用广泛咪唑HgCl2（max 324345nm）NH2OHH+Fe3+阿莫西林克拉维酸钾片阿莫西林克拉维酸钾片色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠取磷酸二氢钠7.8g，加水，加水900 ml溶解，用磷溶解，用磷酸或酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节氢氧化钠溶液调节pH值至值至4.40.1，加水稀释至，加水稀

15、释至1000ml)-甲醇甲醇(95:5)为流动相为流动相；流速为0.7ml/min；检测波长为220nm。阿莫西林峰与克拉维酸峰的分离度应大于3.5 测定法 取本品10片，置1000ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解，制成每制成每1ml中含阿莫西林中含阿莫西林0.5mg和克拉维酸和克拉维酸0.25mg的混合溶液的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。三、氨基糖

16、苷类三、氨基糖苷类1.化学结构化学结构链霉素链霉素 都是以氨基环醇与氨基糖缩合而成的苷都是以氨基环醇与氨基糖缩合而成的苷 分子结构中都含有多羟基分子结构中都含有多羟基 均为碱性抗生素均为碱性抗生素2.性质性质1）碱性（氨基）：）碱性（氨基）：临床应用其硫酸盐临床应用其硫酸盐2）溶解度（氨基、羟基）：）溶解度（氨基、羟基）：水溶性水溶性3）旋光性（糖）：）旋光性（糖）：多个手性碳多个手性碳4）稳定性（苷）：）稳定性（苷）：强酸、碱条件均可水解强酸、碱条件均可水解3.鉴别鉴别1）茚三酮反应：）茚三酮反应： 具羟基胺类具羟基胺类,-,-氨基酸性质氨基酸性质 链霉素链霉素 + + 水和茚三酮水和茚三酮

17、 蓝紫色蓝紫色2） N-甲基葡萄糖胺（甲基葡萄糖胺（Elson-Morgan）反应：）反应： 链霉素链霉素 N-甲基葡萄糖胺甲基葡萄糖胺 红色红色水解对二甲氨基苯甲醛乙酰丙酮OH-NCHONCH3CH3+CH3CH3NCNHCH3CH3HNNCH+H+3 3）麦芽酚（麦芽酚（Maltol) )反应反应 (链霉糖特有）链霉糖特有） 链霉素链霉素 麦芽酚麦芽酚 紫红色紫红色OH-重排Fe3+Fe/3OOCH3OOOCH3OH8-羟基喹啉 NaOBr或-萘酚 OH-水解4）坂口（）坂口（Sakaguchi）反应：）反应： (链霉胍特有）链霉胍特有） 链霉素链霉素 链霉胍链霉胍 橙红橙红5）硫酸盐反应

18、）硫酸盐反应4. 检查检查1）链霉素中链霉素）链霉素中链霉素B的检查的检查 来源：发酵中产生来源：发酵中产生 BP：薄层色谱法（杂质对照品法）薄层色谱法（杂质对照品法）2）庆大霉素庆大霉素C C 组分测定组分测定 （系统适用性试验）（系统适用性试验） 色谱柱：色谱柱：ODS 流动相：流动相：H2O-HAc-MeOH配制的配制的庚烷磺酸庚烷磺酸钠钠溶液溶液(0.2M)，必要时调节甲醇的含量，必要时调节甲醇的含量 检测波长：检测波长：330nm（邻苯二甲醛柱前衍生）邻苯二甲醛柱前衍生） 要求：要求：NC2 2000，C2a峰和峰和C2峰的分离度应峰的分离度应符合要求，重复进样符合要求，重复进样RSD2.0%5. 含量含量 微生物法、微生物法、HPLC法等法等四、四环素类四、四环素类1.化学结构化学结构2.性质性质1）两性：两性： -OH：酸性酸性 N(CH3)2：碱性碱性 与酸、碱均可成盐；临床多用盐酸盐与酸、碱均可成盐；临床多用盐酸盐2 2）旋光性）旋光性3 3）UVUV和荧光：和荧光： 4 4）与金属离子络合：）与金属离子络合： 酚羟基、烯醇基与酚羟基、烯醇基与Ca2+、Mg2+络合显色络合显色5）稳定性）稳定性 易发生异构化易发