PCR原理及特点--检验科

1、聚合酶链反应（聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是指在）是指在DNA聚合酶催化下，以母链聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互互补的子链补的子链DNA的过程。是一项的过程。是一项DNA体外合成放体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离可用于基因分离克隆克隆，序列分析，基因表达调控，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。基因多态

2、性研究等许多方面。 概念概念PCR的最早设想的最早设想 核酸研究已有核酸研究已有100多年的历史，多年的历史，20世纪世纪60年代末、年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过经过DNA变性，与合适的引物杂交，用变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可引物，并不断重复该过程便可克隆克隆tRNA基因基因”。 PCR技术简史技术简史PCR的发展可以说是从DNA合成酵素的发现缘起。DNA合成酵素最早于1955年发现 (DNA

3、 polymerase I), 而较具有实验价值及可得性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现, 但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素, 因此不符合一连串的高温连锁反应所需。现今所使用的酵素 (简称 Taq polymerase), 则是于1976年从热泉 Hot spring中的细菌(Thermus Aquaticus) 分离出来的。 它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酵素，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR的原始雏形概念是类似基因修复复制 (DNA repair replication)，它是于1971年由

4、 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表第一个单纯且短暂性基因复制 (类似PCR前两个周期反应) 的实验。 而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于一家物科技研究公司 (Perkin-Elmer Cetus Corporation). 目前这家公司在PCR的相关仪器及原料上占有很大的巿场。Dr.Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。在 1989 年，Science 将PCR中的DNA合成酵素命

5、名为当年的风云分子 (Molecule of the year)，而PCR本身则列为年度的重要科学发明产物。当然，它的原发明者更在往后获得诺贝尔的桂冠。1985年美国年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室公司人类遗传研究室的的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，的体内复制，只是在试管中给只是在试管中给 DNA的体外合成提供几种的体外合成提供几种合适的条件合适的条件-摸板摸板DNA，寡核苷酸引物，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、变性、复性及延伸的温度与时

6、间。复性及延伸的温度与时间。 PCR的改进与完善的改进与完善Mullis最初使用的最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的的 Klenow片段，其片段，其缺点是：缺点是：Klenow酶不耐高温，酶不耐高温，在在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得技术操作程序添了不少困难。这使得 PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。引物链延伸反应在引物链延伸反应在37

7、下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其其PCR产物特异性较差，合成的产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。片段不均一。引物引物引物引物1988年年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热中提取到一种耐热DNA聚合酶。聚合酶。此酶具有以下此酶具有以下特点：特点：耐高温耐高温，在，在70下反应下反应2h后其残留活性大于原来的后其残留活性大于原来的90%，在在93下反应下反应2h后其残留活性是原来的后其残留活性是原来的 60%，在，在95下反应下反应2h后其残

8、留活性是原来的后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命片段区别，将此酶命名为名为Taq DNA多聚酶多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使。此酶的发现使PCR广泛的被应用。广泛的被应用。 类

9、似于类似于DNA的天然复制过程，其特异性依的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性由变性-退火退火-延伸三个基本反应步骤延伸三个基本反应步骤构成：构成：1.变性变性(denaturation) ：高温使双链高温使双链DNA解离形成单链解离形成单链（94，30s）2.退火退火(annealling) ：低温下，引物与模板低温下，引物与模板DNA互补区结互补区结合（合（55，30s）3.3.延伸延伸(extension) ：中温延伸。中温延伸。DNA聚合酶催化以引物聚合酶催化以引物为起始点的为起始点的DNA链延伸反应链延伸反应

10、（7072，3060s）。PCR技术的基本原理技术的基本原理复温PCR的三个反应步骤反复进行，使的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。扩增量呈指数上升。反应最终的反应最终的DNA 扩增量的计算：扩增量的计算： Y(1X)n Y代表代表DNA片段扩增后的拷贝数，片段扩增后的拷贝数，X表示平表示平(Y)均每次的扩增效率，均每次的扩增效率，n代表循环次数。代表循环次数。平均扩增效率的理论值为平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率，但在实际反应中平均效率达不到理论值。达不到理论值。PCR的反应动力学的反应动力学反应初期，靶序列反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着

11、片段的增加呈指数形式，随着PCR产物产物的逐渐积累，被扩增的的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现增长期或静止期，即出现“停滞效应停滞效应”，这种效应称平台期。，这种效应称平台期。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 标准的标准的PCR反应体系反应体系10扩增缓冲液扩增缓冲液10l4种种dNTP混合物混合物各各200mol/L引物引物10100pmol模板模板DNA0.12gTaq DNA聚合酶聚合酶2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至加双或三蒸水至100lPCR反应

12、五要素反应五要素1. 引物引物（primer）2. 酶酶 （Taq DNA polymerase） 3. dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 4. 模板模板 （template） 5. Mg2+ （magnesium）1.引物引物引物是引物是PCR特异性反应的关键，特异性反应的关键，PCR 产物的产物的特异性取决于引物与模板特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板就可将模板DNA在体外大量扩增。在体

13、外大量扩增。引物长度：引物长度： 15-30bp，常用为，常用为20bp左右；左右；引物扩增跨度：引物扩增跨度： 以以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至为宜，特定条件下可扩增长至10kb；引物碱基：引物碱基：G+C含量以含量以40-60%为宜，为宜，G+C太少扩增效果不佳，太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免最好随机分布，避免5个以上的个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；避免引物内部出现二级结构：避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是避免两条引物间互补，特别是3端的互端的互补，否则会形

14、成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；引物引物3端的碱基应严格要求配对：端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败；失败；引物中有或能加上合适的酶切位点引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处；切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处；引物的特异性：引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性；引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性；引物设计

15、的原则引物设计的原则目前有两种目前有两种Taq DNA 聚合酶供应：聚合酶供应：天然酶：天然酶：从栖热水生杆菌中提纯从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：基因工程酶：大肠菌合成大肠菌合成一个典型的一个典型的 PCR反应约需酶量反应约需酶量 2.5U（指总反（指总反应体积为应体积为100l时）；时）；浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。成产物量减少。2.酶及其浓度酶及其浓度dNTP的质量与浓度和的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系：扩增效率有密切关系：dNTP呈颗粒状呈颗粒状， 保存不当易变性失活保存不当易变性失活dNTP溶液呈酸性溶液呈酸

16、性，使用时应小量分装，使用时应小量分装，-20冰冻保冰冻保存。多次冻融会使存。多次冻融会使dNTP降解降解在在PCR反应中反应中，dNTP应为应为50200umol/L，尤其是，尤其是 注意注意4种种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制的浓度要相等（等摩尔配制 ），）， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或 偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR 产物的产量产物的产量dNTP 能与能与Mg2+结合结合，使游离的，使游离的Mg2+浓度降低浓度降低3.dNTP的质量与浓度的质量与浓度4.模板（靶基因，模板（靶基

17、因，target gene）模板核酸的量与纯化程度，是模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一；成败的关键环节之一；传统传统DNA纯化方法：纯化方法：采用采用SDS和蛋白酶和蛋白酶K来消化处理标本；来消化处理标本； SDS：是溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细：是溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细 胞膜，并解离细胞中的核蛋白，胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白结合的组蛋白, 再用有再用有 机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和

18、其它细胞组份，用乙醇或异丙醇机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇 沉淀核酸提取的核酸即可作为模板用于沉淀核酸提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。反应。临床检测标本临床检测标本：可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原：可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于于PCR扩增；扩增；RNA模板提取：模板提取：采用异硫氰酸胍或蛋白酶采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止法，要防止RNase降解降解RNA5.Mg2+浓度浓度Mg2+是是DNA聚合酶的激活剂，聚合酶的激活剂，对对PCR扩增的特异扩增

19、的特异性和产量有显著的影响性和产量有显著的影响;Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，扩增， 浓度过低会降低浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，聚合酶的活性，使反应产物减少。使反应产物减少。在一般的在一般的 PCR反应中，反应中，dNTP浓度为浓度为200mol/L时，时，Mg2+浓度为浓度为1.52.0 mmol/L为宜为宜;PCR反应条件的选择反应条件的选择温度温度 / 时间时间 / 循环次数循环次数1.温度与时间的设置温度与时间的设置变性变性-退火退火-延伸三个温度点延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法，双链标准反应中采用三温度点

20、法，双链DNA在在9095变性，再迅速冷却至变性，再迅速冷却至4060，引物退火并，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸二温度点法二温度点法对于较短靶基因（长度为对于较短靶基因（长度为100300bp时），时）， 将退将退火与延伸温度合二为一，一般采用火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，变性，65左右退火与延伸左右退火与延伸 变性温度与时间变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的失败的最主要原因最主要原因 一般一般

21、9394 1min足以使模板足以使模板DNA变性变性 若低于若低于93则需延长时间则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。响。 此步若不能使靶基因模板或此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变产物完全变性，就会导致性，就会导致PCR失败失败 退火温度是影响退火温度是影响PCR特异性的较重要因素；特异性的较重要因素； 变性后温度快速冷却至变性后温度快速冷却至4060，可使引物和，可使引物和模板发生结合。由于模板模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互引物和模板之间的碰撞结

22、合机会远远高于模板互补链之间的碰撞；补链之间的碰撞； 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度；及其浓度，还有靶基因序列的长度； 对于对于20个核苷酸，个核苷酸，G+C含量约含量约50%的引物，的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。为选择最适退火温度的起点较为理想。 退火退火(复性复性)温度与时间温度与时间 复性温度复性温度=Tm值（解链温度）值（解链温度）-（510） 在在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高减少引物和模板间的非特异

23、性结合，提高PCR反反应的特异性应的特异性 复性时间一般为复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板，足以使引物与模板之间完全结合之间完全结合引物的复性温度引物的复性温度 延伸温度：一般选择在延伸温度：一般选择在7075之间之间 常用温度为常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。和模板的结合。高于高于90时，时，DNA合成几乎合成几乎不能进行不能进行 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的以内的DNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min（足够）（足够） 34kb的靶序列需的靶序列需34min 扩增扩增1

24、0Kb需延伸至需延伸至15min 延伸进间过长会导致非特异性扩增，对低延伸进间过长会导致非特异性扩增，对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些 延伸温度与时间：延伸温度与时间：2.循环次数循环次数决定决定PCR扩增程度扩增程度;主要取决于模板主要取决于模板DNA的浓度的浓度;选在选在3040次之间，循环次数越多，非特异性次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多产物的量亦随之增多PCR反应特点反应特点 特异性强特异性强 灵敏度高灵敏度高 简便、快速简便、快速 对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低1.1.特异性强特异性强 关键：引物与模板的正确结合关键：引物与模板的正确结合 引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的原则的 合成反应的忠实性及合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较