5.2.DNA的粗提取与鉴定修改

1、 选用一定的物理或化学方法，分离具有不同选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。物理或化学性质的生物大分子。在物理和在物理和化学性质方面的差异化学性质方面的差异从下列材料中选取从下列材料中选取2 23 3种种菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌在液体培养基中培养的大肠杆菌蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分大量蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分大量进入血细胞，使血细胞胀裂；进入血细胞，使血细胞胀裂；加上搅拌作用，加速

2、鸡血细胞细胞膜、核膜破裂，从加上搅拌作用，加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂，从而释放出而释放出DNADNA。为了纯化提取的为了纯化提取的DNADNA需要将滤液作进一步处理。需要将滤液作进一步处理。利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNADNA与蛋白质分开；与蛋白质分开；利用利用DNADNA和蛋白质对高温耐受性的不同，使蛋白质变性与和蛋白质对高温耐受性的不同，使蛋白质变性与DNADNA分离。分离。为什么反复地溶解与析出为什么反复地溶解与析出DNADNA，能够去除杂质？，能够去除杂质？用玻璃棒用玻璃棒沿一个方向沿一个方向搅搅拌，拌，（以利于（以利于DNA分子分子的附着和缠

3、绕）的附着和缠绕）卷起丝卷起丝状物，并用滤纸吸取上状物，并用滤纸吸取上面的水。面的水。观察你提取的观察你提取的DNADNA颜色，如果不是白色丝状物，颜色，如果不是白色丝状物，说明说明DNADNA中的杂质较多；中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色，说明实验基本成功，二苯胺鉴定出现蓝色，说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的如果不呈现蓝色，可能所提取的DNADNA含量低，或含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备是实验操作中出现错误，需要重新制备1、请解释提取、请解释提取DNA的实验操作中主要的步骤的目的。的实验操作中主要的步骤的目的。（1 1）材料的选取，其目的是一定要选取材料的选取，其

4、目的是一定要选取DNADNA含量较高的含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；成检测的困难；（2 2）DNADNA的释放和溶解，是实验成功与否的关键，要尽的释放和溶解，是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的可能使细胞内的DNADNA全部溶解；全部溶解；（3 3）DNADNA的纯化，根据的纯化，根据DNADNA的溶解特性、对酶及高温的的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将耐受性的不同等特性，最大限度地将DNADNA与杂质分开；与杂质分开；（4 4）对）对DNADNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的

5、检测。进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。 共有共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌三次过滤，两次析出，七次搅拌”加入加入“两次蒸馏水，两次蒸馏水，三次三次NaClNaCl溶液溶液，一次酒精，一次酒精”方法步骤方法步骤加入物质加入物质实验原理及现象实验原理及现象1.制备鸡血细胞液制备鸡血细胞液柠檬酸钠溶液柠檬酸钠溶液防止血液凝固防止血液凝固2.提取鸡血细胞细胞核物质提取鸡血细胞细胞核物质蒸馏水蒸馏水使血细胞过度吸水而破裂使血细胞过度吸水而破裂3.溶解细胞核内的溶解细胞核内的DNA2 m1L的的NaCI溶液溶液DNA在高浓度在高浓度NaCI溶液溶液中溶解度大中溶解度大4.析出含析出含DNA的黏稠

6、物的黏稠物蒸馏水蒸馏水将将NaCl溶液稀释至溶液稀释至0.14mol/L，使得使得DNA最大限度地释出最大限度地释出5.滤取含滤取含DNA的黏稠物的黏稠物使含使含DNA的黏稠物留在纱布上的黏稠物留在纱布上6.将将DNA的黏稠物再溶解的黏稠物再溶解2 molL的的NaCl溶液溶液同同37.过滤含过滤含DNA的的NaCl溶液溶液除去含除去含DNA的滤液中的杂质的滤液中的杂质8.提取含有杂质较少的提取含有杂质较少的DNA冷却的冷却的95的酒精的酒精50 mLDNA不溶于酒精，出现沉淀不溶于酒精，出现沉淀9.DNA的鉴定的鉴定(1)向两支试管中各加入向两支试管中各加入2 molL的的NaCl溶液溶液5

7、mL(2)将丝状物放入将丝状物放入A试管试管中，搅拌使其溶解中，搅拌使其溶解(3) 向两支试管中各加入向两支试管中各加入4 mL二苯胺试剂。二苯胺试剂。混合均匀后沸水浴混合均匀后沸水浴5minA出现蓝色出现蓝色，B无变化无变化2、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取DNA一样容易吗？一样容易吗？提取蛋白质比提取提取蛋白质比提取DNA的难度大。的难度大。（1）与）与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；等条件要敏感得多，很容易失活；（2）并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性）并且蛋白质的空间结

8、构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。件，设计特定的方法。OOPOHO碱基碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基533553利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因一、基础知识一、基础知识蛋白质提取与分离的依据蛋白质提取与分离的依据:(:(蛋白质的物化理性质蛋白质的物化理性质) )形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别。亲和力等千差万别。 提取提取分离

9、分离方法方法凝胶色谱法凝胶色谱法 凝胶电泳法凝胶电泳法 1.1.凝胶色谱法凝胶色谱法 （1 1）原理：）原理：大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。（2 2）材料）材料: :多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 （3 3）分离过程）分离过程 混合物混合物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子流动慢小分子流动慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子 洗脱：洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，从色

10、谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。促使蛋白质分子的差速流动。 由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如如H H2 2COCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3，HC/NaCHC/NaC，NaHNaH2 2POPO4 4/Na/Na2 2HPOHPO4 4等等（4 4）缓冲溶液洗脱剂）缓冲溶液洗脱剂组成：组成：配制：配制：作用：作用：调节酸和盐的用量，可配制不同调节酸和盐的用量，可配制不同pHpH的缓冲液。的缓冲液。抵制外界酸碱对溶液抵制外界酸碱对溶液pHpH的干扰而保持的干扰而保持 pHpH稳定。稳定。2凝胶电泳法：1）原理：）原理： 不同蛋白质微粒不

11、同蛋白质微粒带电性质带电性质（正电荷或负电荷）（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力不同，在电场中受到的作用力大小、大小、方向、阻力方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场（或介质）不同，导致不同蛋白质在电场（或介质）中的中的运动方向运动方向和和运动速度运动速度不同。不同。思考思考：蛋白质为什么带有电荷？蛋白质为什么带有电荷？在一定的在一定的PH下下，蛋白质可电离的基团会带上电荷，蛋白质可电离的基团会带上电荷 决定决定运动方向运动方向电场电场作用作用力力介质中形介质中形成阻力成阻力决定决定运动速率运动速率电荷性质电荷性质电荷量电荷量分子形状分子形状分子大小分

12、子大小2）蛋白质分子在电场作用下运动的影响因素）蛋白质分子在电场作用下运动的影响因素3）方法）方法:a.琼脂糖凝胶电泳（如PCR产物的检测） b.聚丙酰胺凝胶电泳（测蛋白质分子量的方法） c.聚苯乙烯凝胶电泳如：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 “蛋白质SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 二、实验操作样品处理样品处理和粗分离和粗分离纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定 血液组成成分血液组成成分 1.洗洗 涤涤 红红 细细 胞胞 2.释放血红蛋白释放血红蛋白 3.分离血红蛋白分离血红蛋白 4.透析血红蛋白透析血红蛋白血液组成成分阅读思考：1. 血液由_和_两部分组成。2. 血细胞中_细胞数量最多

13、，细胞中含量最高的化合物是_。3. 血红蛋白是由 _和_构成的（4条肽链），每条肽链环绕一个能与O2和CO2结合的_基团。血浆血浆血细胞血细胞红细胞红细胞血红蛋白血红蛋白2条条-肽链肽链2条条-肽链肽链 亚铁血红素亚铁血红素1. 红细胞洗涤 血液血液100mL3g柠檬酸钠柠檬酸钠低速离心低速离心2 min红细胞红细胞血血 浆浆吸出血浆吸出血浆红细胞红细胞5倍体积生理盐水倍体积生理盐水搅拌搅拌10min重复洗涤重复洗涤3次，直至上清液没有黄色次，直至上清液没有黄色目的：洗去血浆蛋白目的：洗去血浆蛋白滤纸滤纸过滤过滤脂类物质脂类物质3.分离血红蛋白红细胞红细胞混合液混合液高速离心高速离心10min 离心管离心管烧杯烧杯有机溶剂有机溶剂血红蛋白血红蛋白2.释放血红蛋白操作目的分析：1. 蒸馏水的作用是_。2. 加入甲苯的作用是_。3. 充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂20mmol/L磷酸缓冲液4.透析血红蛋白透析的目的：透析的目的：1mL1mL1mL去除血红蛋白中的小分子杂质去除血红蛋白中的小分子杂