植物利用光能的生理基础(2013级)

1、综合实验综合实验1 植物利用光能的生理基础植物利用光能的生理基础一、实验教学目的一、实验教学目的 学习叶绿体色素的提取和定量测定的方法，并掌学习叶绿体色素的提取和定量测定的方法，并掌握分光光度计的使用方法。握分光光度计的使用方法。 了解叶绿体色素在植物光合作用中的光能吸收、了解叶绿体色素在植物光合作用中的光能吸收、传递和转换中的重要作用。传递和转换中的重要作用。 掌握叶绿体色素提取、分离方法，并了解它们的掌握叶绿体色素提取、分离方法，并了解它们的一些重要理化性质。一些重要理化性质。综合实验综合实验1 植物利用光能的生理基础植物利用光能的生理基础二、实验意义二、实验意义植物体内叶绿素与光合作用及

2、氮素营养有密切植物体内叶绿素与光合作用及氮素营养有密切关系，在科学施肥、育种及植物逆境生理等关系，在科学施肥、育种及植物逆境生理等研究上常需对其进行测定。研究上常需对其进行测定。 综合实验综合实验1 植物利用光能的生理基础植物利用光能的生理基础三、实验基本原理三、实验基本原理(一）提取和分离一）提取和分离1.提取提取高等植物叶绿体内的色素包括叶绿素高等植物叶绿体内的色素包括叶绿素(叶绿素叶绿素a和和叶绿素叶绿素b)和类胡萝卜素和类胡萝卜素(叶黄素和胡萝卜素叶黄素和胡萝卜素)两两大类，它们不溶于水，但溶于有机溶剂，故常大类，它们不溶于水，但溶于有机溶剂，故常用丙酮或酒精等有机溶剂来提取。用丙酮或

3、酒精等有机溶剂来提取。综合实验综合实验1 植物利用光能的生理基础植物利用光能的生理基础三、实验基本原理三、实验基本原理(一）提取和分离一）提取和分离2.分离分离纸层析法分离叶绿体色素是一种最简便的方法，纸层析法分离叶绿体色素是一种最简便的方法，其原理是当溶剂不断地从纸上流过时，由于混其原理是当溶剂不断地从纸上流过时，由于混合物中各成分在两相合物中各成分在两相(流动相和固定相流动相和固定相)具有不同具有不同的的分配系数分配系数，其移动速率不同，经过一定时间，其移动速率不同，经过一定时间后，可以将样品中不同色素分开。后，可以将样品中不同色素分开。综合实验综合实验1 植物利用光能的生理基础植物利用光

4、能的生理基础综合实验综合实验1 植物利用光能的生理基础植物利用光能的生理基础三、实验基本原理三、实验基本原理（二）定量分析（二）定量分析根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可计算出提取液中各种色素的含量。即可计算出提取液中各种色素的含量。综合实验综合实验1 植物利用光能的生理基础植物利用光能的生理基础三、实验基本原理三、实验基本原理（三）理化性质（三）理化性质1.皂化反应皂化反应叶绿素是一种双羧酸叶绿素是一种双羧酸(叶绿酸叶绿酸)与甲醇和叶绿醇形与甲醇和叶绿醇形成的

5、复杂酯。在碱的作用下，发生皂化作用，成的复杂酯。在碱的作用下，发生皂化作用，生成醇生成醇(甲醇与叶绿醇甲醇与叶绿醇)和叶绿素的盐和叶绿素的盐(皂化叶绿皂化叶绿素素)。生成的盐能溶于水，故可将叶绿素与类。生成的盐能溶于水，故可将叶绿素与类胡萝卜素分开。胡萝卜素分开。叶绿素是叶绿素是双羧酸酯双羧酸酯, ,其中一个羧基被甲醇所酯化其中一个羧基被甲醇所酯化, ,另一个被叶醇另一个被叶醇所酯化所酯化 。叶绿素及其结构特点叶绿素及其结构特点综合实验综合实验1 植物利用光能的生理基础植物利用光能的生理基础三、实验基本原理三、实验基本原理（三）理化性质（三）理化性质2.取代反应取代反应在弱酸作用下，叶绿素分子

6、中的镁为在弱酸作用下，叶绿素分子中的镁为H+所取代，所取代，生成褐色的去镁叶绿素，后者遇乙酸铜则形成生成褐色的去镁叶绿素，后者遇乙酸铜则形成蓝绿色的铜代叶绿素。铜代叶绿素很稳定，在蓝绿色的铜代叶绿素。铜代叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多汁植光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。物的浸渍标本。 叶绿素分子含有一个叶绿素分子含有一个卟卟啉环啉环的的“头头部部”和一个和一个叶绿叶绿醇醇( (植醇植醇) )“尾尾巴巴”。卟啉环由。卟啉环由四个吡咯环以四个甲烯基四个吡咯环以四个甲烯基(-(-CH=)CH=)连接而成。连接而成。 吡咯环的中央结合着一吡咯环的中央结合着一

7、个镁离子。镁离子带正电荷个镁离子。镁离子带正电荷, ,而与其相连的氮原子则带负而与其相连的氮原子则带负电荷电荷, ,因而具有极性因而具有极性, ,是是亲水亲水的。的。 卟啉环上的共轭双键和中卟啉环上的共轭双键和中央镁离子央镁离子易易被光激发而引起被光激发而引起电子得失电子得失, ,使叶绿素具有特殊使叶绿素具有特殊的光化学性质。的光化学性质。叶绿素及其结构特点叶绿素及其结构特点综合实验综合实验1 植物利用光能的生理基础植物利用光能的生理基础三、实验基本原理三、实验基本原理（三）理化性质（三）理化性质3.荧光现象荧光现象叶绿素吸收光量子转变成激发态的叶绿素分子，叶绿素吸收光量子转变成激发态的叶绿素

8、分子，很不稳定，当其回到基态时可发出荧光。很不稳定，当其回到基态时可发出荧光。色素分子的激发与退激色素分子的激发与退激激发激发 处于基态的色素分子，吸收光量子后，处于基态的色素分子，吸收光量子后，其中的电子由基态跃迁到激发态。其中的电子由基态跃迁到激发态。电子跃迁的能级电子跃迁的能级状态由所吸收的状态由所吸收的能量决定：能量决定：蓝光蓝光第二单线态第二单线态红光红光第一单线态第一单线态三线态三线态电子自旋方向相同。电子自旋方向相同。电子自旋电子自旋方向相反方向相反综合实验综合实验1 植物利用光能的生理基础植物利用光能的生理基础四、仪器试剂四、仪器试剂玻璃仪器：玻璃仪器： (1)(1)大试管大试

9、管5 5根、中试管根、中试管2 2根根(2)(2)烧杯和漓管烧杯和漓管(3)25ml(3)25ml容容量瓶量瓶4 4个个(4)(4)量筒量筒2 2个个(5) (5) 指型管指型管2 2根根(6) (6) 毛细管毛细管2 2根根(7)(7)康维皿康维皿1 1个个(8) (8) 移液管移液管5 5根根(9) (9) 吸液球吸液球2 2个个试剂：试剂： (1)96% (1)96% 乙醇乙醇(2) 15% KOH(2) 15% KOH甲醇溶液甲醇溶液 (3) (3) 蒸馏水蒸馏水 (4) 30%(4) 30%醋酸醋酸(5) (5) 苯苯(6) (6) 醋酸铜粉末醋酸铜粉末综合实验综合实验1 植物利用光

10、能的生理基础植物利用光能的生理基础五、实验材料五、实验材料1 1、水稻、小麦、玉米、大豆、棉花、蓖麻、烟草、向日、水稻、小麦、玉米、大豆、棉花、蓖麻、烟草、向日葵等农作物叶片；葵等农作物叶片；2 2、黄瓜、茄子、辣椒、豆角、大白菜、萝卜等蔬菜绿叶、黄瓜、茄子、辣椒、豆角、大白菜、萝卜等蔬菜绿叶、心叶、菜心、菜帮等；心叶、菜心、菜帮等；3 3、八仙花、红叶石楠、大叶黄杨、海桐、木芙蓉、紫荆、八仙花、红叶石楠、大叶黄杨、海桐、木芙蓉、紫荆、珊瑚树等园林植物叶片；珊瑚树等园林植物叶片；4 4、枫香、木荷、梧桐、泡桐等林木叶片。、枫香、木荷、梧桐、泡桐等林木叶片。综合实验综合实验1 植物利用光能的生理

11、基础植物利用光能的生理基础六、实验设计六、实验设计 测定叶绿体色素测定叶绿体色素(叶绿素叶绿素a、叶绿素、叶绿素b和类胡萝卜素和类胡萝卜素)含量，比较不同植物的光合特性：含量，比较不同植物的光合特性： 1 1、C C3 3、C C4 4和和CAMCAM植物；植物； 2 2、草本和木本植物；、草本和木本植物； 3 3、不同颜色植物；、不同颜色植物； 4 4、同一种植物在不同环境；、同一种植物在不同环境； 5 5、同一种植物不同处理；、同一种植物不同处理； 6 6、同一种植物不同生长时期等。、同一种植物不同生长时期等。 称取剪至细丝状植物材料，每份称取剪至细丝状植物材料，每份0.10.2g放入试管

12、，加放入试管，加96%乙醇乙醇1015ml6070水浴中提取，水浴中提取，直至叶片成黄白色直至叶片成黄白色提取液提取液转移至转移至25ml容量瓶中，容量瓶中，将试管中的叶绿体色素全部将试管中的叶绿体色素全部洗入容量瓶中，直至洗液中无绿色为止洗入容量瓶中，直至洗液中无绿色为止用用96乙醇定容至乙醇定容至25ml，摇匀，摇匀分别在波长分别在波长665 nm、649 nm、470 nm及及652nm比色比色七、实验步骤七、实验步骤（一）叶绿体色素的提取及定量测定（一）叶绿体色素的提取及定量测定称重、水浴操作步骤取一张长滤纸条取一张长滤纸条(1 cm2 cm)用毛细吸管吸取浓的叶绿体色素提取液涂抹滤纸

13、条一侧长边用毛细吸管吸取浓的叶绿体色素提取液涂抹滤纸条一侧长边重复重复2030次，风干后卷成纸捻次，风干后卷成纸捻插入圆形滤纸中央小孔中，使之刚刚与圆形滤纸齐平插入圆形滤纸中央小孔中，使之刚刚与圆形滤纸齐平把插有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸捻下端浸入推动剂中把插有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸捻下端浸入推动剂中迅速将一培养皿盖在康维皿上迅速将一培养皿盖在康维皿上（二）叶绿体色素的分离及理化性质观察（二）叶绿体色素的分离及理化性质观察1.叶绿体色素的分离叶绿体色素的分离取取3mL叶绿体色素提取液放入试管内叶绿体色素提取液放入试管内加入加入1ml 20 KOH甲醇溶液，摇匀甲醇溶液，摇匀

14、先后加入先后加入3ml苯、苯、1ml蒸馏水，摇匀蒸馏水，摇匀静置静置分层分层（二）叶绿体色素的分离及理化性质观察（二）叶绿体色素的分离及理化性质观察2.叶绿体色素的理化性质叶绿体色素的理化性质（）皂化反应（）皂化反应皂化反应现象记录皂化反应现象记录2.叶绿体色素的理化性质叶绿体色素的理化性质（）叶绿素的荧光现象（）叶绿素的荧光现象将浓的叶绿体色素提取液放入试管内，在直射光下观察色将浓的叶绿体色素提取液放入试管内，在直射光下观察色素溶液在透射光下及反射光下的颜色有何不同？素溶液在透射光下及反射光下的颜色有何不同？（）光对叶绿素的破坏作用（）光对叶绿素的破坏作用将前面实验纸层析所得的色谱图纸，对半

15、剪开，一半夹入将前面实验纸层析所得的色谱图纸，对半剪开，一半夹入书中，另一半放在强光下，书中，另一半放在强光下，0.51 h后，观察四种色素后，观察四种色素的颜色有何变化？的颜色有何变化？（二）叶绿体色素的分离及理化性质观察（二）叶绿体色素的分离及理化性质观察取取3mL叶绿体色素提取液放入试管内叶绿体色素提取液放入试管内加入加入30%醋酸摇匀至变色醋酸摇匀至变色倾出一半于另一试管，加少许醋酸铜粉末倾出一半于另一试管，加少许醋酸铜粉末水浴加热水浴加热12min再次变色再次变色（二）叶绿体色素的分离及理化性质观察（二）叶绿体色素的分离及理化性质观察2.叶绿体色素的理化性质叶绿体色素的理化性质（4）

16、取代反应）取代反应取代反应现象记录取代反应现象记录（一）叶绿体色素的提取及定量测定一）叶绿体色素的提取及定量测定 按下式计算样品中各叶绿体色素的浓度按下式计算样品中各叶绿体色素的浓度(mgL-1) ： Ca=13.95ACa=13.95A6656656.88 A6.88 A649649 Cb=24.96A Cb=24.96A6496497.32 A7.32 A665665 Cx.c=(1000A Cx.c=(1000A4704702.05Ca2.05Ca114.8Cb)/245114.8Cb)/245 如果仅在如果仅在652 nm波长下比色，则用波长下比色，则用 CT(mgL-1)=( A65

17、21000)/34.5计算叶绿素总浓度计算叶绿素总浓度八、结果与分析八、结果与分析（一）叶绿体色素的提取及定量测定（一）叶绿体色素的提取及定量测定按下式计算样品中各色素的含量：按下式计算样品中各色素的含量：各种叶绿体色素的各种叶绿体色素的含量含量( (mgg-1) ) = (C= (CV)/WV)/W其中其中: : C为为上述各种叶绿体色素的浓度上述各种叶绿体色素的浓度(mgL-1) ； V为提取液总量为提取液总量(ml，若比色前进行了稀释，则应乘以，若比色前进行了稀释，则应乘以 稀释倍数稀释倍数)； W为样品鲜重为样品鲜重(g) 。八、结果与分析八、结果与分析综合实验综合实验2 植物对逆境的生理响应植物对逆境的生理响应实验设计实验设计要求学生自带玉米、烟草、羊蹄等植物材料利要求学生自带玉米、烟草、羊蹄等植物材料利用实验室条件人为设置逆境与正常条件形成用实验室条件