实验一 糕点中菌落总数的测定

1、1、了解细菌总数检验的意义。、了解细菌总数检验的意义。2、掌握样品稀释处理的方法和菌落总数计数的方法、掌握样品稀释处理的方法和菌落总数计数的方法3、掌握食品细菌总数的测定报告方式。、掌握食品细菌总数的测定报告方式。4、熟练无菌操作技术。、熟练无菌操作技术。实验一实验一 糕点中菌落总数的测定糕点中菌落总数的测定一、实验目的一、实验目的 1 1、电热恒温培养箱、冰箱、恒温水浴锅、托盘天、电热恒温培养箱、冰箱、恒温水浴锅、托盘天平、电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、平、电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、试管、试管架、酒精灯、均质器或乳钵、灭菌刀或试管、试管架、酒精灯、均质器或乳钵、灭

2、菌刀或剪刀、灭菌镊子、剪刀、灭菌镊子、75%75%酒精棉球、玻璃蜡笔、登酒精棉球、玻璃蜡笔、登记薄记薄 2 2、培养基和试剂：、培养基和试剂：75%75%乙醇、生理盐水乙醇、生理盐水( (蒸馏蒸馏水）、营养琼脂培养基。水）、营养琼脂培养基。二、实验材料二、实验材料菌落总数是指食品检样经过处理菌落总数是指食品检样经过处理,在一定条件下培养后在一定条件下培养后(如培基如培基成分、培养温度和时间、成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等、需氧性质等)，所得，所得1mL(g)检样检样中所含菌落的总数。中所含菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂本方法规定的培养条件下所得结果，只

3、包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。行卫生学评价时提供依据。(一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）*8规格名称数量 用途1、500ml三角瓶 1个 稀释样品（配制生理盐水）2、250ml三角瓶1个 配制营养琼脂 3、18180mm试管5支 稀释样品（9ml）4、

4、1ml移液管 5 支5、直径为90mm平皿 8套 倒营养平板6、250ml量筒 1支7、玻璃珠：直径约5mm （二）应灭菌、消毒的器材（二）应灭菌、消毒的器材 剪刀1把 不锈钢药匙1把 称量纸：适量 酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头5只 （三）应制备的培养基（三）应制备的培养基 培养基 总量 所用容器 蒸馏水 1瓶 225ml/瓶 500ml三角瓶 平板计数琼脂 1瓶 150ml/瓶 250ml三角瓶 稀释水： 每组5支 9ml/支 18180mm试管A.1 A.1 平板计数琼脂（平板计数琼脂（plate count agarplate count agar，PCAPCA）培养基）培养基A

5、.1.1 成分胰蛋白胨 5.0 g酵母浸膏 2.5 g葡萄糖 1.0 g琼 脂 15.0 g蒸馏水 1000 mLpH 7.00.2A.1.2 制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121 高压灭菌15 min。1、检验程序、检验程序菌落总数检验程序菌落总数检验程序：检样检样做成几个适当倍数的稀释液做成几个适当倍数的稀释液选择选择2-32-3个适宜稀释度个适宜稀释度各以各以1ml1ml之量分别入灭菌平皿内之量分别入灭菌平皿内每皿内加入每皿内加入46460 0C C适量营养适量营养琼脂琼脂菌落数菌落数报告报告三、实验方法三、实验方法2、检样稀释及培养检样稀释及培养（1

6、）以无菌操作，将检样）以无菌操作，将检样25g（或（或25ml）剪碎以后，放于含有）剪碎以后，放于含有225ml灭菌灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预先置适当数量的玻璃珠）生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预先置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000100000r/min的速度处理的速度处理1min，做成，做成1：10的均匀稀释液。的均匀稀释液。（2）用）用1ml灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1：10稀

7、释液稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌灭菌生理盐水或其他稀释的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下生理盐水或其他稀释的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成同），振摇试管混合均匀，做成1：100的稀释液。的稀释液。（3）另取）另取1ml的灭菌吸管，按上项操作顺序作的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用增稀释一次，即换用1支支1ml灭菌吸管。灭菌吸管。注意：注意：加入检样液时，吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部，也不得触及管内稀加入检样液时，吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部，也

8、不得触及管内稀释液，并将吸管内的液体沿管壁小心流加入，以免增加检液。释液，并将吸管内的液体沿管壁小心流加入，以免增加检液。吸管插入检样液内取样稀释时，插入深度要达吸管插入检样液内取样稀释时，插入深度要达2.5cm以上以上,调整时应使管尖调整时应使管尖与容器内紧贴与容器内紧贴每递增稀释一次，即换用另一支每递增稀释一次，即换用另一支1ml灭菌吸管灭菌吸管 （4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择23个适宜稀释个适宜稀释度，分别在作度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml

9、稀释液稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。（5）稀释液移入平皿后，应及时将凉至）稀释液移入平皿后，应及时将凉至460C营养琼脂培养基营养琼脂培养基可放置在可放置在（461）0C）水浴锅内保温）水浴锅内保温注入平皿注入平皿15ml20mL，并转动平皿使混合均，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。作空白对照。（6）等琼脂凝固后，翻转平板，置（）等琼脂凝固后，翻转平板，置（361）0C恒温箱内培养（恒温箱内培养（482）h取取出，计算平

10、板内菌落数目乘以倍数，即得出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1g（1mL）样品所含菌落总数。）样品所含菌落总数。 培养基不能触及平皿口边沿，加入培养基后可正反两个方向旋转，但不可用培养基不能触及平皿口边沿，加入培养基后可正反两个方向旋转，但不可用力过度，以免溅起触及上盖。力过度，以免溅起触及上盖。检样从开始稀释到倾注最后一个平皿，所用时间不宜超过检样从开始稀释到倾注最后一个平皿，所用时间不宜超过20min琼脂凝固后，就立即将平板放入培养箱内进行培养，以免细菌蔓延生长。琼脂凝固后，就立即将平板放入培养箱内进行培养，以免细菌蔓延生长。如果把不能立即计数，要将平板放入如果把不能立即计数，要将平板放

11、入04冰箱中，但不能超过冰箱中，但不能超过24 h。3、菌落计算方法、菌落计算方法（1）菌落计数方法）菌落计数方法 做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。数。（2）菌落计数的报告）菌落计数的报告平板菌落数的选择平板菌落数的选择 选取菌落数在选取菌落数在3030300300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有

12、较大片释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘布又很均匀，即可计算半个平板后乘2 2以代表全皿菌落数。平皿内如有以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链，可视为一链状菌落生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链，可视为一个菌落数；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作

13、为一个菌落计。个菌落数；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。 稀释度的选择稀释度的选择 应选择平均菌落数在应选择平均菌落数在3030300300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。若有两上稀释度，其生长的菌落数均在若有两上稀释度，其生长的菌落数均在3030300300之间，则视两者之比之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于如何来决定。若其比值小于或等于2 2，应报告其平均数；若大于，应报告其平均数；若大于2 2则报则报告其中较小的数字。告其中较小的数字。 若所有稀释度平均菌落数均大于若所有稀释度平均菌落数均大于300300，则应按稀释度

14、最高的平均，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。菌落数乘以稀释倍数报告之。 若所有稀释度的平均菌落数均小于若所有稀释度的平均菌落数均小于3030，则应按稀释度最低的平均，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。菌落数乘以稀释倍数报告之。 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1 1乘以最低稀释倍数报告乘以最低稀释倍数报告之。之。 若所有稀释度的平均菌落数均不在若所有稀释度的平均菌落数均不在3030300300之间，其中一部分大之间，其中一部分大于于300300或小于或小于3030时，则以最接近时，则以最接近3030或或300300的平均菌落数乘

15、以稀释倍数报的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。告之。菌落数的报告菌落数的报告 菌落数在菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于以内时，按其实有数报告，大于100时，采用二位时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。的指数来表示。思考题及实验作业思考题及实验作业食品检验为什么要测定细菌菌落总数？食品中检出的菌落总数是否代表该食品上的所有细菌数？为什么？为什么营养琼脂培养基在使用前要保持地（461）的温度？培养时为什么要把培养皿倒置培养？在

16、菌落总数测定和霉菌、酵母菌的计数中，两者在样品处理过程中有何不同？列表说明？计数时又有何异同处？双人单面垂直风超净工作台,洁净等级100级闭合工作台面,不锈钢台面材质工作区:1360*700*620mm 1. 目的 规范净化工作台操作与维护工作，确保仪器正常运作。 2. 适用范围：本实验方法适用于微生物检验中净化工作台操作与维护管理。 3. 检验人员职责：负责此仪器操作和维护管理超净工作台的使用、维护保养与清洁标准操作规程超净工作台的使用、维护保养与清洁标准操作规程 4. 4. 操作及维护规程操作及维护规程 4.1操作规程4.1.1使用工作台时，应提前50分钟开机，同时开启紫外杀菌灯，处理操作

17、区内表面积累的微生物，30分钟后关闭杀菌灯（此时日光灯即开启），启动风机。4.1.2对新安装的或长期未使用的工作台，使用前必需对工作台和周围环镜先用超静真空吸尘器或用不产生纤维的工具进行清洁工作，再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。4.1.3 操作区内不允许存放不必要的物品，保持工作区的洁净气流流型不受干扰。4.1.4 操作区内尽量避免作用明显扰乱气流流型的动作。4.1.5 操作区的使用温度不可以超过60。 4.2 维护规程及维护方法4.2.1 根据环境的洁净程度，可定期（一般23个月）将粗滤布（涤纶无纺布）拆下清洗或给予更换。4.2.2 定期（一般为一周）对环境周围进行灭菌工作，同时经常用纱布沾酒精或丙酮等有机溶剂将紫外线杀菌灯表面擦干净，保持表面清洁，否则会影响杀菌效果。4.2.3 当加大风机电压已不能使风