蛋白质与酶工程5-6

1、第五章第五章 酶的固定化酶的固定化 游离酶的缺点： 稳定性差(热、酸碱、有机溶剂对其有影响)； 不能回收反复使用； 产物中混杂酶蛋白，分离纯化困难。 酶的固定化 (enzyme immobilization)就是通过吸附、交联、包埋、共价键结合等物理、化学手段将酶被束缚于水不溶的载体上或一定空间内但仍具有酶活性。（上世纪60年代） 酶管、酶膜、酶板 第一节 酶的固定化方法一、固定化酶的优缺点 1、优点 酶与底物、产物易分开，简化了提纯工艺； 可反复使用，利于连续化、管道化； 反应过程可控，利于自动化； 提高了酶的稳定性（绝大多数情况）； 酶的使用效率高、产率高、产品质量高、成本低。 2、缺点

2、损失酶活力2）不适应非水溶性底物和大分子底物 不适于多酶反应二、酶的固定化方法 吸附法、共价结合法、交联法、包埋法 1、吸附法 吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。 物理吸附法 通过氢键、疏水作用和、电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上，从而制成固定化酶。 常用的载体有： 有机载体：纤维素(玻璃纸或胶棉膜 )、淀粉等，吸附量大 无机载体：氧化铅、皂土、多孔玻璃等，吸附量小，易脱落 离子交换吸附法 将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合而达到固定化。 阴离子交换剂：二乙基氨基乙基（DEAE）-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶 DEAE-Sephadex A25固定氨基酰化酶：溶胀，然后用0

3、.5mol/LNaOH和水洗涤，加酶混匀，于低温下搅拌过夜，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15molL醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4备用。 阳离子交换剂：羧甲基（CM）-纤维素 吸附法的优点：a、操作简单；b、载体选择范围广；c、吸附过程可以同时纯化酶；d、固定化酶在使用过程失活后可重新活化；e、载体可以回收再利用。 吸附法的缺点：a、由于有些机理不十分明了，在给酶量、吸附程度与固定化酶活力回收的关系不可预见性大。b、由于吸附法制备的固定化酶酶易脱落，影响产物纯度和酶的操作稳定性。 2、包理法 包埋法是将载体聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂（包括交联剂）的作用进行单体聚合，酶被包埋在

4、载体聚合物中以达到固定化。 分为凝胶包理法和微囊包埋法 凝胶包理法 凝胶包埋法（基质包埋法）是将酶分子包埋在凝胶网络的格子中。 海藻酸钙凝胶（海藻酸钠）、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、卡拉胶 微囊包埋法 微囊包埋法是将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内。此法在医疗上极为有用 人造细胞、红血球包埋法、脂质体包埋法 包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法。 优点：操作简单，条件温和；无反应，不改变酶的空间结构，固定化酶的活力高；适用性广。 缺点： 只适宜于小分子底物，对大分子底物不适宜； 凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化。 3、共价结合法（共价偶联法） 就是酶蛋白的侧链基团和载体表

5、面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。 优点：酶与载体结合牢固，酶不易脱落。 缺点：但反应条件较激烈，酶易失活，同时，制作手续亦较繁琐。 酶分子和载体连接的功能基团 酶分子：-NH3、-COOH、苯环基、 -OH、-SH、咪唑基、吲哚基 载体：芳香氨基，羧基，羧甲基等 载体的选择 载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般要求是： a、一般亲水载体都优于疏水载体（结合量、活力、稳定性） ； b、载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度； c、载体必须带有在温和条件与酶共价结合的功能基团； d、载体没有或很少有非专一性吸附； e、载体来源容易，便宜，并能反复使用。 如如: :天然高分子

6、衍生物天然高分子衍生物: : 纤维素纤维素 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差亲和性好，机械性能差 琼脂糖琼脂糖 合成聚合物：合成聚合物： 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 聚苯乙烯聚苯乙烯 性能好，但有疏水结构性能好，但有疏水结构 尼龙尼龙 偶联反应 有13类反应，但必须考虑偶联效率，固定化酶总活力，操作简便以及成本等因素。 常用的偶联反应：重氮化法、叠氮法、溴化氰法、芳香烃化法等。 a、重氮法 是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸酸处理成重氮盐衍生物，再在偏碱(pH8-9)条件下与酶蛋白的氨基、酚基、咪唑基发生偶联反应，得到固定化酶。多糖类的芳香族氨基衍生物载体（对-硫酸脂乙砜基胺多

7、糖）氨基酸共聚体如L-Leu和对氨基-DL-苯丙氨酸共聚物聚丙烯酰胺衍生物苯乙酰树脂多孔玻璃的氨基硅烷衍生物Y-氨基丙基三氧乙烷硅第一步：第二步：对硝基苯酚氯 b、叠氮法 将带有羧基或羟基、羧甲基等的载体在酸性条件下用甲醇处理使之酯化，再用水合肼处理形成酰肼，最后在HNO3作用下转变成叠氮衍生物。在低温下可与酶蛋白的氨基、羟基、酚基、巯基等反应羧甲基纤维素、CMSephadex c、溴化氰法 含有羟基的载体（如纤维素、葡聚糖、琼脂等）在碱性条件下，载体的羟基与CNBr反应，生成活泼的亚胺碳酸盐，在弱碱条件下，可与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。 d、芳香烃化法 具有羟基的载体可以通过烷基化、芳

8、香基化引入活泼的卤素基后，在碱性条件下，与酶分子上的氨基、酚基、巯基等反应。 纤维素载体均三氯三嗪3-F-4，6-二硝基苯 4、交联法 利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与惰性蛋白间进行交联反应制备固定化酶。 最常用的交联试剂是戊二醛，其他如苯基二异硫氰、双重氮联苯胺-2，2-二磺酸、1，5-二氟-2，4-二硝苯、己二酰二胺二甲脂等。 戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应，使酶蛋白交联。 缺点： 反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。 制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。各种固定化方法的比较交联法常与吸附法、包埋法结合使用。 第二节 固定化酶的性质 由于固定的方

9、法不同，固定化酶的活力和性质也有所不同。 一、固定化酶的活力下降 原因：酶的结构或构象发生变化(特别是酶活性中心)；酶与底物间的相互作用受到空间位阻(屏蔽效应)；微环境影响；底物、产物的分配不均效应；底物、产物的扩散限制效应 活力测定、偶联效率、活力回收、相对活力 二、固定化酶的稳定性提高 原因： 固定化增加了酶活性构象的牢固程度， 可防止酶分子伸展变形； 抑制蛋白酶降解； 固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。 但如果固定化触及到酶稳定性区域，也可能导致酶稳定性下降。 1、热稳定性提高 氨基酰化酶：溶液酶在75保温15min，活力为0；DEAE-Sephadex固定化酶在同样条件下仍有80

10、；DEAE-纤维素固定化酶在同样条件下还有60活力。 2、对蛋白酶的抵抗力提高 氨基酰化酶：在胰蛋白酶作用下活力仅存20，而将其固定于DEAE纤维素上在同样条件下仍有80的活力。 3、对变性剂、抑制剂的抵抗能力提高 氨基酰化酶：溶液酶在6mol、2mol弧、1 SDS和4mmol丙酮溶液中相对活力分别为 9、49、1和55，而后者在相应溶液中相对活力则分别为146%、117%、35%和138%。 4、操作稳定性提高 固定化酶在操作中可以长期使用，半衰期较长。 青霉素酰化酶：37 催化77天，活力仍为100% 5、贮藏稳定性提高 木瓜蛋白酶：在4下，120天溶液酶活力只保留有70%，而固定化酶（

11、琼脂）活力无变化。三、固定化酶的催化特性改变 1、最适温度 固定化酶反应的温度一般较溶液酶的高，如用CM-纤维素固定的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最适温度比溶液酶高515。 （但也有例外） 2、最适pH 最适pH的变动依据载体的电荷性质而定。 带负电荷载体：最适pH 向碱性偏移。 带正电荷载体：最适pH 向酸性偏移。 DEAE-纤维素或DEAE-葡聚糖固定化氨基酰化酶与其游离酶比较，低0.5个pH而偏向酸性方向。CM-纤维素固定化的胰蛋白酶、糜蛋白酶的最适pH与游离酶比较，向碱性方向偏移0.51个pH单位。 3、Km（反应动力学） 多数固定化酶的Km有一定变化，与活性中心的构象改变及载体的电荷性质有关

12、。 载体与底物电荷相反，固定化酶的Km值降低。 载体与底物电荷相同，固定化酶的Km值显著增加。 4、专一性 大多数固定化酶的专一性与溶液酶相同，但也有例外。 第六章第六章 酶酶(蛋白质蛋白质)分子的化学修饰分子的化学修饰（蛋白质水平的分子改造） 酶分子的化学修饰就是在体外通过人工的方法将酶分子与一些化学基团或化学物质(修饰试剂 )进行共价连接从而改变酶的结构和性质。 基础研究：探测酶活性必需氨基酸的性质和数目；探测酶蛋白的结构变化与功能的关系；测定酶蛋白部分区域的构象状态；探索酶的作用机理和催化反应历程；研究酶的固定化技术。 应用研究： 提高酶的稳定性； 改善酶的催化特性；提高蛋白药物在体内不

13、稳性、 消除免疫原性及靶向性（病灶细胞）。 第一节 酶化学修饰的基本条件 必须对被修饰酶的性质、修饰原理、修饰剂和反应条件等方面有足够的了解 一、被修饰酶的性质 1、基本性质 热、酸碱稳定性，最适温度、pH，pI，抑制剂，蛋白酶水解部位等。 2、酶活性中心 氨基酸残基数目、性质及其地位、有无辅助因子及种类。 3、被修饰氨基酸侧链基团的性质及反应性 常被修饰的侧链基团：巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等 巯基的修饰试剂 烷基化试剂：碘乙酸、碘乙酸胺、巯基乙醇、谷胱甘肽 汞试剂：HgCl2、对氯汞苯甲酸、2-氯汞硝基苯酚 Ellman试剂：5，5-二硫-二-2-硝

14、基苯甲酸 氨基的修饰试剂 乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、2，4-二硝基氟苯、苯异硫氰酸酯、碘乙酸 羧基的修饰试剂 甲醇、硼氟化三甲锌盐（-COOCH3） 咪唑基的修饰试剂 碘乙酸、碘乙酸胺 吲哚基的修饰试剂 光敏试剂（打开吲哚环）、4-硝基苯硫氯 甲硫氨酸侧链基团的修饰试剂 碘代乙酰胺、H2O2或光敏试剂(E-S-CH3的硫氧化) 二硫键的修饰试剂 二硫苏糖醇、2-巯基乙醇 酚基的修饰试剂 N-乙酰咪唑、二异丙基氟磷酸 胍基的修饰试剂 丁二酮、苯乙二醛（结合在胍基的两个氨基上） 二、修饰反应的条件 酶稳定、修饰率高、活力回收高(实验探索确定) 1、pH与离子强度 决定了侧链基团的解离状态和

15、反应性能 有些修饰试剂在不同pH条件下与同一基团可形成不同产物。 2、修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。 3、反应体系中酶与修饰剂的比例 第二节 酶化学修饰的方法 酶表面修饰、酶内部修饰 金属离子置换修饰, 大分子修饰(共价/非共价) 侧链基团修饰（小分子修饰） 肽链有限水解修饰 固定化修饰 1、金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。 -淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2

16、+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+) 若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。金属离子置换修饰的过程 a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。 b. 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法

17、，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。 c. 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。 金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。 用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。 2、大分子修饰 大分子非共价修饰 大分子物质与酶非共价地相互作用，有效地保护酶的活力和稳定性 修饰试剂：聚乙二醇、多元醇、多糖、多聚氨基酸、蛋白质等 大分子共价修饰 大分子物质通过共价键连接于酶分子的表面形成一层覆盖层有效地保护酶的活力和稳定性。 修饰试剂：聚乙

18、二醇。右旋糖苷、肝素等大分子共价修饰的过程 修饰剂的选择修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。 修饰剂的活化修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。 修饰修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。 分离分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。 3、侧链基团修饰 利用一些适宜的小分子修饰剂通过化学法使酶蛋白表面的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。 非催化活性基团修饰：最主要的，侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。 催化活性基团修饰：氨基酸转变(化学突变法 )， 例如Ser转变为Cys(-OH-SH)。现在已被蛋白工程所取代。 操作过程繁琐复杂，一般用于基础研究，但也可提高酶的稳定性。 经这种方法修饰后的蛋白酶和脂肪酶在洗涤剂工业中显示出巨