Western Blot 黄强开

1、Western Blot同济大学附属同济医院黄强开1Western blotting23 . 能够从复杂的样品中，获得较明确的蛋 白信息2. 灵敏 简单 结果认可1. 是蛋白质分析的最流行的技术之一60% 生命科学工作者使用该方法WB的基本原理WB的基本操作过程和注意事项WB的常见问题及分析3基本原理通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后转移到杂交膜上分离的蛋白可以通过一抗/二抗复合物进行检测 (直接法与间接法)45优点：快速 特异缺点：信号弱 昂贵直接法6优点：信号强二抗选择多缺点：非特异结合需条件优化间接法7一、 蛋白处理二、 SDS-PAGE三、 转膜四、 封闭五、 一抗作用六、 标

2、记二抗作用七、 结果检测Western blotting 基本步骤基本步骤8一、蛋白处理：提提取测蛋白定量调调平浓度煮制样9蛋白提取1. 细胞总蛋白的提取A 倒掉培养液B PBS洗3次C 400 l 含 PMSF（蛋白水解酶抑制剂 ） 的裂解液（ 1ml 裂解液加 10 l PMSF）（100mM） 冰上 摇晃 30min 刮棒D 离心管 4下 12000rpm 离心 5min（提前开离心机预冷） 102. 组织中总蛋白的提取称量100mg加裂解液1:5-10剪碎（匀浆器中球状部位 ）（PBS清洗）匀浆 1min 低温离心（12000g 10min 4 ）取上清分装 -80度保存 蛋白定量方法

3、:匀浆法机械法研磨法超声法反复冻融法蛋白定量制作标准曲线（酶标仪）BSA 13超微量分光光度计（Nanodrop） 需样本量少 快速，简单分光光度计测蛋白浓度会受到核酸 （A260大量吸收）及不溶性颗粒（340nm大量吸收）对光吸收影响，14蛋白调平调平是否成功内参(GAPDH, beta-actin或beta-tubulin) 内参作用：是检测整个WB实验过程及体系是否正常工作半定量的标准15制样loading buffer 1x100 510分钟 ，离心 上样16loading buffer 溴酚蓝 显色 甘油 蛋白下沉SDS 界面活性剂， 断氢键，破二、三级结构，17SDS聚丙烯酰胺凝胶

4、电泳原理原理： 分子被解聚成多肽链- SDS胶束多肽链消除不同分子的电荷差异SDS：带强负电 蛋白质带电价一致 泳动率按分子量大小18+-大蛋白大蛋白小蛋白小蛋白19分子栅栏分子大小成为决定因素根据待测蛋白分子量大小确定凝胶（分离胶）浓度20蛋白分子量（kDa）凝胶浓度（）4-402012-451510-7012.515-1001025-200821Marker22制胶事前准备：1、防护（很重要）2、试剂？3、其他耗材？4、仪器正常？23制胶24丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺水SDS配胶的Tris缓冲液TEMED过硫酸铵 APS凝胶成份负极25浓缩胶分离胶加样孔正极 5% 80V 8%15%

5、 120V清洗玻璃板，晾干玻璃板对齐，卡紧，上架配分离胶，灌胶（APS和TEMED最后加，避免气泡）水封（折射线）配浓缩胶，插梳子（避免气泡）上样电泳26安装玻璃板对齐，加紧配胶 ，按顺序加，上下层胶一起配，节省时间和枪头，最后加APS和TEMED。要混匀，但不要过度，防止氧化注意温度，温度与凝胶速度成正比1、APS 4 保存，约1周，现配2、TEMED 室温避光，易挥发氧化失效3、APS与TEMED放多，胶易碎灌胶，下层胶 5-6ml左右边混匀边加从边上缓慢加枪头液体不要打完防止进空气有少许气泡不用担心加水液封时要慢，否则胶会被冲变型凝胶 一般为30min1h（37度孵箱 15min）要放水

6、平 出现折光线即可 表示胶凝配上层胶，先不加TEMED倒出水，滤纸吸干，加TEMED，上上层胶配好上层胶 ，胶加满 ，可溢出插梳子梳子两边加少量胶液 防止第一空变形等待胶凝时，融化，离心样品拆下玻璃板，用水冲洗安装电泳装置，小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板，加电泳液，外液40cm高拔梳子，左右手均匀用力，垂直向上加样经验：不要吸进气泡，枪头插至加样孔中，慢快慢，重要的样品后加，电泳：上层胶80V下层胶120V， Prestain Marker 做指示。拆下玻璃板，用水冲洗安装电泳装置，小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板加滤纸可防漏液

7、加电泳液，内液加满，外液40cm（500ml 1 电泳液）电泳液）拔梳子要均匀用力左右同起缓慢向上拔出加样经验：不要吸进气泡，对光加样，枪头插至加样孔中一半的位置慢快慢，边加边退重要的样品后加先顶后下滑样品一般在1.0mm厚的胶加样50-100ug/lane在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。电泳：上层胶80V下层胶120V（仅供参考），Prestain Marker 做指示。时间不宜太长，如时间较长，可选择冰浴。注意正负极不要插反清水冲洗胶板，小心取出胶44PVDF膜膜NC膜膜尼龙膜尼龙膜灵敏度和分辨率高高高背景低低较高蛋白结合能力100-200ug/cm2（适用于SDS存在时与

8、蛋白结合）80-100ug/cm2400ug/cm2机械强度强干的膜易脆软而结实溶剂抗性强差差使用前是否需要浸润100%甲醛润湿缓冲液润湿缓冲液润湿适用染色方法胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁不能用阴离子染料适用检测方法显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测显色法、化学发光、荧光、放射性显色、化学发光、放射性适用范围 普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用价格高较低低选择合适的膜湿转将凝胶

9、和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中系统复杂 时间长半干转将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间。简便时间短SDS PAGE电泳过程中，开始转膜前准备工作1. 配新的 transfer buffer 500ml 预冷2. 备滤纸 尺子 剪刀 转膜海绵 平口镊3. 用甲醇浸泡PVDF膜至透明15s，放入transfer buffer 中 浸泡 至少5min（PVDF表面厌水，甲醇让其亲水带正电，表面厌水，甲醇让其亲水带正电， 更好结合蛋白）更好结合蛋白） VS（转膜液中甲醇作用：（转膜液中甲醇作用：10%-20%既可以固定胶的形态不 至于变形，也可以使蛋白结合到膜上更稳

10、定。 ）湿转浓度越大的胶，越韧，6%的胶要小心操作，不能有破损按胶大小裁剪膜，和滤纸安装黑胶膜胶背面向上 膜光面向下记住正反面黑胶不能有气泡戴手套操作保护好胶和膜的表面膜安装转膜装置注意：正负极 冰浴冷却（10g）一抗/二抗浓度过大69高背景抗体浓度过高优化/降低一抗二抗浓度。封闭液不合适比较不同封闭液。封闭不完全1、封闭液的选择。2、增加封闭液的蛋白浓度。3、优化封闭时间。抗体与其他蛋白交叉反应1、更换封闭液。2、降低二抗浓度。70洗涤不完全增加洗涤次数和时间曝光时间过长缩短曝光时间缓冲液污染更换缓冲液71斑点状高背景抗体浓度过高优化降低抗体浓度。二抗聚集更换二抗。封闭不完全同前抗体与其他蛋白发生交叉反应同前膜没有正确湿润缓冲液污染仪器污染有残留胶7273无信号或信号弱转膜不完全1、染胶确定转膜效率 2、保证膜和胶充分结合。3、确保电极正确，滤纸膜胶滤纸。4、正确湿润膜。5、防止电转过热。6、优化电转时间。7、使用Marker。蛋白和膜结合不充分1、缓冲液补充甲醇。2、更换小孔径