荧光定量PPT学习教案

1、会计学1内 容rmiRNA的特点及检测的特点及检测r荧光定量荧光定量PCR检测检测第1页/共50页第2页/共50页3AAAAAAAA5capmiRNA作用靶点编码区编码区mRNAmicroRNA分子功能第3页/共50页第4页/共50页第5页/共50页一个miRNA可调节多个基因一个基因可受多个miRNA调控60%人类蛋白基因受miRNA调控第6页/共50页第7页/共50页miRNA 与 siRNA的异同第8页/共50页第9页/共50页第10页/共50页第11页/共50页必要性：不排除miRNA从前体到成熟体，从核内转运到核外的过程中存在调控机制的可能。第12页/共50页第13页/共50页基本原

2、理影响RNA分子与硅胶柱结合的因素 离液剂chaotropic agent，如盐酸胍 离子强度，如NaCl 小分子有机溶剂，如乙醇精心调整各组份配比，达成大、小RNA与硅胶柱结合的区分条件，分离去除大分子量RNA，富集小分子量RNA小RNA提取第14页/共50页 M 1 2 3M：Marker#1：康为柱式分离的小片段：康为柱式分离的小片段RNA#2：康为柱式分离的总：康为柱式分离的总RNA#3：沉淀法得到的总：沉淀法得到的总RNA第15页/共50页优点：简单直接，高效。一次逆转录获得的cDNA可用于多个目标分子的检测。第16页/共50页优点：特异引物逆转录，理论上效率更高，检测更灵敏缺点：茎

3、环引物设计复杂；特异引物逆转录不便多基因检测第17页/共50页第18页/共50页康为miRNA产品小RNA提取试剂盒加尾法 miRNA cDNA第一链合成试剂盒miRNA荧光定量PCR检测试剂盒CW0627CW2141CW2142第19页/共50页第20页/共50页(Real time Quantitative PCR)rmiRNA的特点及检测的特点及检测r荧光定量荧光定量PCR检测检测内 容第21页/共50页 Use of LSD Synthesis and self-testing of novel psychoactive substances Belief in astrology第2

4、2页/共50页起点定量起点定量终点定量终点定量起点定量检测： - 起点量是样本中未经PCR放大之前的模板量- 具有重现性，误差小- “加入了500个拷贝”终点定量检测：- 终点产物量经过PCR放大的DNA量- 不恒定，误差大- “生成了500，0000，0000个拷贝”第23页/共50页扩增曲线 - Ct值：q模板DNA量越多，荧光强度达到检测域值所需的循环数越少， 即Ct值越小。确定模板初始数量？第24页/共50页非特异性荧光标记：非特异性荧光标记： SYBR Green I 特异性荧光标记：特异性荧光标记：水解探针：水解探针： TaqMan非水解探针：非水解探针：Molecular bea

5、con RQReporterQuencherRQ第25页/共50页5353SGSGSGSG5353SGSGSGSGEmission ExcitationlSYBR Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料。lSYBR Green I只与双链DNA结合才能发出荧光。l荧光信号的强度与反应体系中所有双链DNA分子成正比。第26页/共50页 在退火过程中，探针与靶序列结合在退火过程中，探针与靶序列结合探针被探针被TaqTaq酶的酶的5 5- 3- 3 外切酶活性剪切成片断外切酶活性剪切成片断游离报告基团发出荧光游离报告基团发出荧光在延伸过程中，探针部分与靶序列分离在延伸过程中，探针部分与

6、靶序列分离荧光信号强度与结合探针的荧光信号强度与结合探针的DNADNA分子成正比。分子成正比。第27页/共50页 染料法 通用性好- 对DNA模板没有选择性 使用方便，成本低- 仅需设计两个引物 有假阳性现象- 通过融解曲线判断第28页/共50页第29页/共50页test sample处理样本处理样本target gene目的基因reference gene内参基因total RNAcDNAcalibrator sample对照样本对照样本target gene目的基因reference gene内参基因qPCR以各自样本中内参基因为标杆，比较两样本中目的基因的相对丰度。数据分析qPCRcDN

7、Atotal RNA第30页/共50页 特点特点选择内参基选择内参基因因内参基因内参基因beta-actinbeta-actin、GAPDHGAPDH、 18S rRNA18S rRNA、28S rRNA28S rRNA等等- - 文献检索文献检索- - 实验筛选实验筛选选择多个备选内参基因，以备选内参基因的几何平均数作为均一化标准选择多个备选内参基因，以备选内参基因的几何平均数作为均一化标准 内参基因内参基因Housekeeping Gene- RNA抽提、反转录为cDNA的效率不同，用于定量分析的样本初始浓度不同。对样本初始浓度差异进行均一化校正。不同环境，不同器不同环境，不同器官、组织、

8、细胞类官、组织、细胞类型之间，表达量相型之间，表达量相对恒定。对恒定。第31页/共50页不同丰度：不同丰度：高丰度高丰度 ACTBACTB、GAPDHGAPDH中等丰度中等丰度 beta2Mbeta2M低丰度低丰度 HPRT1HPRT1不同物种：不同物种：人、大鼠、小鼠、猪、牛、羊、人、大鼠、小鼠、猪、牛、羊、鸡、斑马鱼、甘蔗鸡、斑马鱼、甘蔗 等等第32页/共50页第33页/共50页CW0580CW0592CW0581CW2090A第34页/共50页一步法：简单、灵敏度高，有效减少实验操作误差和污染。每次只能做一个基因。 推荐：工作的成熟阶段，以及多个样本单个靶基因检测。第35页/共50页引物

9、引物特异性特异性反应效率反应效率Oligo dTOligo dT中中低低Random hexmerRandom hexmer低低中中Specific primerSpecific primer高高高高CW0741CW0743第36页/共50页引物设计原则EXON 1EXON 2INTRON 2DNADNAEXON 1EXON 2RNARNA第37页/共50页第38页/共50页融解曲线分析- 单一特异性产物 将温度对荧光强度的变化求导第39页/共50页 图图2 2EffciencyEffciencyslopeslope内参基因内参基因100%100%-3.32-3.32目的基因目的基因Prime

10、r 2Primer 278%78%-4.00-4.00 图图1 1EffciencyEffciencyslopeslope内参基因内参基因100%100%-3.32-3.32目的基因目的基因Primer 1Primer 195.36%95.36%-3.43-3.43标准曲线分析- 扩增效率尽量高- 目的基因尽可能接近内参基因 10%以内第40页/共50页扩增曲线分析- Ct值第41页/共50页- 热启动酶化学修饰，常温下完全没有聚合酶活性，热复活需95 10分钟 - GoldStar、HotStar非化学修饰（Oligo修饰、抗体修饰、Mg2+螯合物） 热复活仅需95几十秒 -FastStar

11、- Buffer反应增强剂 - 减少引物二聚体，进一步提高反应特异性 - 对于复杂模板，提高反应效率稳定剂- dNTP第42页/共50页ROX Passive Reference不参与、不干扰PCR反应恒定发射荧光信号用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。需参照仪器要求选择。第43页/共50页第44页/共50页满足条件：满足条件：1 1）内参基因和目标基因的扩增效率接近）内参基因和目标基因的扩增效率接近- -正负正负10%10% 2 2）内参基因和目标基因的扩增效率基本为）内参基因和目标基因的扩增效率基本为90%-110%90%-110%1 1、目标基因的、目标基因的CTCT值

12、值- -内参基因的内参基因的CTCT值值2 2、待测样本的、待测样本的CTCT值值- -对照样本的对照样本的CTCT值值3 3、计算表达水平比率：、计算表达水平比率： 2 2 CTCT=表达量的比值表达量的比值2 2- -CtCt 法法目的目的基因基因内参内参基因基因目的基因目的基因- -内参基因内参基因CtCt待测样本待测样本- -对照样本对照样本CtCt倍数值倍数值foldfold2 2- -CtCt 对照样本对照样本30.48530.48523.62523.6256.866.860 01 1待测样本待测样本27.02527.02522.6622.664.3654.365-2.495-2.

13、4955.637285.63728第45页/共50页Housekeeping geneHousekeeping gene无信号无信号RNARNA降解降解用新鲜组织提取用新鲜组织提取RNARNAHousekeeping gene Housekeeping gene 有信号有信号而目标基因无信号而目标基因无信号1. 1. 目的基因表达低。目的基因表达低。 逆转录效率不高逆转录效率不高2. PCR2. PCR引物不良引物不良1. 1. 富集富集mRNA mRNA 2. 2. 在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。3. 3. 尝试不同尝试不同PCRPCR引物。减小产物

14、大小，改换目标引物。减小产物大小，改换目标 区段，考虑不同剪接体。区段，考虑不同剪接体。4. 4. 尝试不同热循程序，降低复性温度。尝试不同热循程序，降低复性温度。Housekeeping geneHousekeeping gene反应效率正常反应效率正常, ,但但目标基因放大效率不高目标基因放大效率不高PCRPCR引物不良引物不良重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段，重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段，考虑不同剪接体考虑不同剪接体目标基因表达丰度在目标基因表达丰度在样本之间异常一致样本之间异常一致RNARNA被基因组被基因组DNADNA污染污染1.1.使用跨使用跨intron in

15、tron 引物引物2.2.用用DNaseDNase处理处理RNARNA3.3.确保确保RNARNA阴性对照表现阴性阴性对照表现阴性溶解曲线出现杂峰溶解曲线出现杂峰1.1.出现非特异出现非特异PCRPCR产物产物2.2.出现引物二聚体出现引物二聚体1.1.尝试不同尝试不同PCRPCR引物引物2.2.尝试不同热循程序，升高复性温度尝试不同热循程序，升高复性温度3.3.修改仪器设置，将检测温度设定在在引物二聚体修改仪器设置，将检测温度设定在在引物二聚体解链温度与解链温度与PCRPCR特异产物解链温度之间。特异产物解链温度之间。阴性对照在阴性对照在3030个循环个循环以内出现信号以内出现信号试剂被污染

16、试剂被污染1.1.注意区分信号是来自引物二聚体还是注意区分信号是来自引物二聚体还是PCRPCR产物产物 查找，替换污染试剂查找，替换污染试剂2. 2. 使用使用UNGUNG系统。系统。第46页/共50页 荧光定量产品-染料法FastSYBRMixture UltraSYBR MixturelGoldStar Taql特异性强l灵敏度高lCt值更低l线性范围更广l定量更准确l反应速度快l比普通反应可节省约40分钟l适合于普通和快速定量PCR程序第47页/共50页 某其它品牌某其它品牌 康为康为 UltraSYBR- cDNA- cDNA用内参用内参actinactin引物进行扩增，引物进行扩增，产物片段产物片段100bp100bp。- - 模板浓度进行模板浓度进行1010倍稀释，稀释倍稀释，稀释6 6个个梯度。梯度。第48页/共50页RNA- Trizol -超纯RNA提取试剂