膜片钳技术原理及相关基本知识0306讲课稿

1、泰山(tishn)医学院脑科研究所 2014.3第一页，共109页。第二页，共109页。第三页，共109页。 细胞电生理学细胞电生理学 Electrophysiology细胞生理学：揭示细胞的生理过程，用电生理方细胞生理学：揭示细胞的生理过程，用电生理方法法(fngf)记录生物电活动记录生物电活动测量测量离子、离子通道离子、离子通道细胞兴奋细胞兴奋生物电信号生物电信号细胞生理学细胞生理学第四页，共109页。细胞膜的结构和离子细胞膜的结构和离子通道：细胞膜由脂质通道：细胞膜由脂质双分子层和蛋白质组双分子层和蛋白质组成成(z chn)(z chn)，蛋白，蛋白质又包括整合蛋白和质又包括整合蛋白和表

2、面蛋白。表面蛋白。第五页，共109页。膜的膜的“流动镶嵌模型流动镶嵌模型”第六页，共109页。磷脂双层的磷脂双层的屏蔽屏蔽(pngb)作用作用第七页，共109页。 离子通道是一种特殊的膜蛋白，它横跨整个膜结构，是细胞内部与部外联系的桥梁和细胞内外物质交换的孔道，当通道开放时，细胞内外的一些无机离子如Na,k Ca 等带电离子可经通道顺浓度梯度或电位梯度进行跨膜扩散，从而形成这些带电离子在膜内外的不同分布态势，这种态势和在不同状态下的动态变化是可兴奋细胞静息电位和动作电位的基础(jch)。这些无机离子通过离子通道的进出所产生的电活动是生命活动的基础(jch)，只有在此基础(jch)上才可能有腺体

3、分泌、肌肉收缩、基因表达、新陈代谢等生命活动。离子通道结构和功能障碍决定了许多疾病的发生和发展。因此，了解离子通道的结构、功能以及结构与功能的关系对于从分子水平深入探讨某些疾病的病理生理机制、发现特异性治疗药物或措施等均具有十分重要的理论和实际意义.第八页，共109页。第九页，共109页。第十页，共109页。第十一页，共109页。第十二页，共109页。开放开放 状态状态open state 失活失活 状态状态Inactive state 静息静息 状态状态 restingstate 激活激活activation 失活失活 inactivation复活复活 recovery第十三页，共109页。

4、第十四页，共109页。乙酰胆碱受体乙酰胆碱受体 第十五页，共109页。电压电压(diny)门控钾离子通道门控钾离子通道 第十六页，共109页。第十七页，共109页。第十八页，共109页。第十九页，共109页。第二十页，共109页。第二十一页，共109页。赫克斯利赫克斯利Andrew Fielding Huxley英国英国(yn u)英国英国(yn u)伦敦大学伦敦大学1917年年-霍奇金霍奇金Alan Lloyd Hodgkin英国英国英国剑桥大学英国剑桥大学1914年年-1998年年第二十二页，共109页。离子通道结构研究：目前，绝大多离子通道结构研究：目前，绝大多数离子通道的一级结构得到了

5、阐明，数离子通道的一级结构得到了阐明，但最根本的还是要搞清楚各种离子但最根本的还是要搞清楚各种离子通道的三维结构，在这方面，美国通道的三维结构，在这方面，美国的二位科学家彼得的二位科学家彼得阿格雷和罗德阿格雷和罗德里克里克麦金农做出了一些开创性的麦金农做出了一些开创性的工作，他们利用工作，他们利用X X光绕射方法得到光绕射方法得到了了K K离子通道的三维结构，二位因离子通道的三维结构，二位因此此(ync)(ync)获得获得20032003年诺贝尔化学年诺贝尔化学奖。有关离子通道结构不是本奖。有关离子通道结构不是本PPTPPT的重点，可参考杨宝峰的的重点，可参考杨宝峰的离子通离子通道药理学道药理

6、学和和HillHill的的 Ionic Ionic Channels Of Excitable Membranes Channels Of Excitable Membranes . . .第二十三页，共109页。离子通道功能观察的两种技术离子通道功能观察的两种技术(jsh)(jsh)对离子通道功能的研究，主要采用记录离对离子通道功能的研究，主要采用记录离子通道电流来间接反映离子通道功能，目子通道电流来间接反映离子通道功能，目前有如下两种技术前有如下两种技术(jsh)(jsh)电压钳电压钳(Voltage clamp)(Voltage clamp)技术技术(jsh)(jsh)膜片钳膜片钳(pa

7、tch clamp)(patch clamp)技术技术(jsh)(jsh)第二十四页，共109页。电压钳技术电压钳技术(Voltage Clamp)(Voltage Clamp)：电压钳技术，是电压钳技术，是2020世纪初由世纪初由ColeCole发明，发明， Hodgkin Hodgkin和和HuxleyHuxley完善，其设计的主要目的是为了证明动作电完善，其设计的主要目的是为了证明动作电位的产生机制，即动作电位的峰电位是由于膜对钠位的产生机制，即动作电位的峰电位是由于膜对钠的通透性发生了一过性的增大过程。但当时没有的通透性发生了一过性的增大过程。但当时没有(mi yu)(mi yu)直接

8、测定膜通透性的方法，于是就用膜直接测定膜通透性的方法，于是就用膜对某种离子的电导来代表该种离子的通透性，膜电对某种离子的电导来代表该种离子的通透性，膜电导测定的依据是电学中的欧姆定律，如膜的导测定的依据是电学中的欧姆定律，如膜的NaNa电导电导GNaGNa与电化学驱动力（与电化学驱动力（Em-ENa)Em-ENa)和膜电流和膜电流INaINa的关系的关系GNa= INa/ GNa= INa/ （Em-ENa).Em-ENa).因此可通过测量膜电流，再因此可通过测量膜电流，再利用欧姆定律来计算膜电导，但是，利用膜电流来利用欧姆定律来计算膜电导，但是，利用膜电流来计算膜电导时，记录膜电流期间的膜电

9、位必须保持计算膜电导时，记录膜电流期间的膜电位必须保持不变，否则膜电流的变化就不能代表膜电导的变化。不变，否则膜电流的变化就不能代表膜电导的变化。这一条件是利用电压钳技术实现的。下张幻灯中的这一条件是利用电压钳技术实现的。下张幻灯中的右边两张图是右边两张图是HodgkinHodgkin和和HuxleyHuxley在半个世纪以前利在半个世纪以前利用电压钳记录的抢乌贼的动作电位和动作电位过程用电压钳记录的抢乌贼的动作电位和动作电位过程中的膜电流的变化图，他们的实验首次证明参与动中的膜电流的变化图，他们的实验首次证明参与动作电位的离子流由作电位的离子流由Na, k ,Na, k ,漏（漏（ClCl）

10、三种成分组成。）三种成分组成。并对这些离子流进行了定量分析。这一技术对阐明并对这些离子流进行了定量分析。这一技术对阐明动作电位的本质和离子通道的的研究做出了极大的动作电位的本质和离子通道的的研究做出了极大的贡献。贡献。第二十五页，共109页。第二十六页，共109页。电压钳的原理：用两根尖端直径电压钳的原理：用两根尖端直径0.5um0.5um的电极插入细胞内，一根的电极插入细胞内，一根电极用作记录电极以记录跨膜电电极用作记录电极以记录跨膜电位，用另一根电极作为电流注入位，用另一根电极作为电流注入电极，以固定膜电位。从而实现电极，以固定膜电位。从而实现固定膜电位的同时记录膜电流。固定膜电位的同时记

11、录膜电流。电位记录电极引导的膜电位（电位记录电极引导的膜电位（VmVm）输入电压钳放大器的负输入端，输入电压钳放大器的负输入端，而人为控制的指令电位（而人为控制的指令电位（VcVc）输）输入正输入端，放大器的正负输入入正输入端，放大器的正负输入端子等电位，向正输入端子施加端子等电位，向正输入端子施加指令电位（指令电位（VcVc）时，经过短路负）时，经过短路负端子可使膜片等电位，即端子可使膜片等电位，即Vm=Vc,Vm=Vc,从而达到电位钳制的目的，并可从而达到电位钳制的目的，并可维持一定的时间。维持一定的时间。VcVc的不同变化的不同变化将导致将导致VmVm的变化，从而引起细胞的变化，从而引起

12、细胞膜上电压依赖性离子通道的开放，膜上电压依赖性离子通道的开放，通道开放引起的离子流反过来又通道开放引起的离子流反过来又引起引起VmVm的变化，致使的变化，致使VmVc, VcVmVc, Vc与与VmVm的任何差值都会导致放大器的任何差值都会导致放大器有电压输出有电压输出(shch)(shch)，将相反极，将相反极性的电流注入细胞，以使性的电流注入细胞，以使Vc=VmVc=Vm，注入电流的大小与跨膜离子流相注入电流的大小与跨膜离子流相等，但方向相反。因而注入的电等，但方向相反。因而注入的电流被认为是标本兴奋时的跨膜电流被认为是标本兴奋时的跨膜电流值（通道电流）。流值（通道电流）。第二十七页，共

13、109页。电压钳的缺点：电压钳技术目前主要用于巨大细电压钳的缺点：电压钳技术目前主要用于巨大细胞的全细胞电流研究，特别在分子克隆的卵母细胞胞的全细胞电流研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥其它技术不能替代的作用表达电流的鉴定中发挥其它技术不能替代的作用(zuyng)(zuyng)。但也有其致命的弱点：。但也有其致命的弱点：1 1、微电极需刺破细胞膜进入细胞，以致造成细胞、微电极需刺破细胞膜进入细胞，以致造成细胞浆流失，破坏了细胞生理功能的完整性；浆流失，破坏了细胞生理功能的完整性；2 2、不能测定单一通道电流。因为电压钳制的膜、不能测定单一通道电流。因为电压钳制的膜面积很大，包含

14、着大量随机开放和关闭着的通道，面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的通道，而且背景噪音大，往往掩盖了单一通道的电流。而且背景噪音大，往往掩盖了单一通道的电流。 3 3、对体积小的细胞、对体积小的细胞( (如哺乳类中枢神经元，直径如哺乳类中枢神经元，直径在在101030m30m之间之间) )进行电压钳实验，技术上有更进行电压钳实验，技术上有更大的困难。由于电极需插入细胞，不得不将微电极大的困难。由于电极需插入细胞，不得不将微电极的尖端做得很细，如此细的尖端致使电极阻抗很大，的尖端做得很细，如此细的尖端致使电极阻抗很大，常常是常常是60608OM8OM或或120120150M150M（取决于不同（

15、取决于不同的充灌液）。这样大的电极阻抗不利于作细胞内电的充灌液）。这样大的电极阻抗不利于作细胞内电流钳或电压钳记录时在短时间（流钳或电压钳记录时在短时间（0.1s0.1s）内向细胞）内向细胞内注入电流，达到钳制膜电压或膜电流之目的。再内注入电流，达到钳制膜电压或膜电流之目的。再者，在小细胞上插入的两根电极可产生电容而降低者，在小细胞上插入的两根电极可产生电容而降低测量电压电极的反应能力测量电压电极的反应能力第二十八页，共109页。膜片钳与电压钳的区别膜片钳与电压钳的区别 膜片钳膜片钳 电压钳电压钳 相同点相同点都是通过钳制膜电位而记录离子通道电流都是通过钳制膜电位而记录离子通道电流 不同点不同

16、点 钳制方法不同钳制方法不同高阻封接高阻封接细胞内插入电极细胞内插入电极所用电极不同所用电极不同低阻抗电极低阻抗电极2-15M2-15M高阻抗电极高阻抗电极10-100M10-100M钳制面积不同钳制面积不同小片膜小片膜整个或大块细胞膜整个或大块细胞膜记录的通道数不同记录的通道数不同一个或几个一个或几个所有通道所有通道第二十九页，共109页。第三十页，共109页。第三十一页，共109页。 内尔内尔(Neher) 萨克曼萨克曼(Sakmann) （1944-） （1942-） （德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家） （德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家） 合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术

17、首次证实了细胞膜上存在离子通道。这一成合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上存在离子通道。这一成果对于研究细胞功能果对于研究细胞功能(gngnng)的调控至关重要，可揭示神经系统、肌肉系统、心血的调控至关重要，可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的发病机理，并提供治疗的新途径。管系统及糖尿病等多种疾病的发病机理，并提供治疗的新途径。 二人共获二人共获1991年诺贝年诺贝尔奖。尔奖。第三十二页，共109页。研究离子通道的一种电生理技术，是施加负压将玻璃微电极的尖端(开口直径约1 m)与细胞(xbo)膜紧密接触，形成高阻抗封接，可以精确记录离子通道微小电流。能制备

18、成细胞(xbo)贴附、内面朝外和外面朝内三种单通道记录方式，以及另一种记录多通道的全细胞(xbo)方式。 膜片钳技术实现了小片膜的孤立和高阻封接的形成，由于高阻封接使背景噪声水平大大降低，相对地增宽了记录频带范围，提高了分辨率。另外,它还具有良好的机械稳定性和化学绝缘性。而小片膜的孤立使对单个离子通道进行研究成为可能。第三十三页，共109页。膜片钳放大器的工作模式：膜片钳放大器的工作模式：(1).(1).电压钳模式：在钳制电压钳模式：在钳制细胞膜电位的基础上改变细胞膜电位的基础上改变膜电位，记录离子通道电膜电位，记录离子通道电流的变化，记录的是诸如流的变化，记录的是诸如通道电流；通道电流；EP

19、SC;IPSCEPSC;IPSC等等电流信号电流信号(xnho)(xnho)。是。是膜片钳的基本工作模式膜片钳的基本工作模式. .(2).(2).电流钳模式电流钳模式: :向细胞内向细胞内注入刺激电流，记录膜电注入刺激电流，记录膜电位对刺激电流的反应。记位对刺激电流的反应。记录的是诸如动作电位，录的是诸如动作电位，EPSP;IPSPEPSP;IPSP等电压信号等电压信号(xnho)(xnho)。第三十四页，共109页。为了记录到膜电位，电极尖端必须与要记录细胞的细胞膜形成(xngchng)紧密的封接，故又称紧密封接。电压钳位(tight-seal voltage clamp )，这种紧密封接可

20、使电阻达到千兆欧(10 9)级，故称为“千兆欧封接”( gigaseals ) 第三十五页，共109页。第三十六页，共109页。第三十七页，共109页。 膜片钳记录方法按照微电极尖端是吸住膜片钳记录方法按照微电极尖端是吸住细胞膜不损伤它，还是细胞膜不损伤它，还是(hi shi)吸出细胞膜吸出细胞膜片，或按吸出的细胞膜片是原来胞质侧还是片，或按吸出的细胞膜片是原来胞质侧还是(hi shi)细胞外侧暴露在浸泡液中，可将膜细胞外侧暴露在浸泡液中，可将膜片钳技术分为片钳技术分为4类，类， 即细胞附着膜片即细胞附着膜片(cell-attached patch )、全细胞记录全细胞记录(whole-cel

21、l recording、外膜、外膜外向外向(outside-out )和内膜外向和内膜外向(inside-out)膜片技术。膜片技术。第三十八页，共109页。第三十九页，共109页。细胞贴附式细胞贴附式全细胞记录式全细胞记录式外面向外式外面向外式内面向外式内面向外式单通道电流单通道电流膜电位或膜电流膜电位或膜电流膜片钳的几种记录模式极其(jq)形成：各种记录模式的形成各种记录模式的形成(xngchng)过程过程第四十页，共109页。第四十一页，共109页。 10M 10Ma膜片钳使用的标本膜片钳使用的标本 1. 1.单细胞：急性分散细胞和培单细胞：急性分散细胞和培养细胞养细胞2.2.脑片或组织

22、块。脑片或组织块。3.3.整体动物。整体动物。要求：膜片钳要求：膜片钳80%80%的工夫在的工夫在于制备细胞。细胞表面于制备细胞。细胞表面(biomin)(biomin)要干净要干净, ,不能有不能有胶质细胞等蛋白质物质。细胞胶质细胞等蛋白质物质。细胞状态良好，表面状态良好，表面(biomin)(biomin)光滑，无麻斑，无肿胀或皱缩。光滑，无麻斑，无肿胀或皱缩。脑片单细胞第四十二页，共109页。电流信号电流信号单通道电流单通道电流全细胞电流全细胞电流突触电流突触电流电压信号电压信号阈电位阈电位静息电位静息电位动作电位动作电位膜片钳记录膜片钳记录(jl)(jl)的信息的信息电压钳模式电压钳模

23、式(msh)电流电流(dinli)钳模式钳模式第四十三页，共109页。1. 1.单通道电流单通道电流(dinli)(dinli)1.典型的单通道电流呈一种振幅相同而持续时间不等的脉冲样变化。他有两个电导水平，即0和1，分别对应通道的关闭和开放状态。2.有的矩形脉冲簇状发放时，通道电流不在同一水平，可以明显观察到不同数目离子通道所形成的电流台阶，从而可推断出被测膜片的通道数目。3.有的通道可记录到圆滑型和方波形两种形式。4.有些通道开放活动是持续开放，中间被闪动样的关闭所中断，形成burst开放。有些通道开放活动是簇状开放与短期平静交替(jiot)出现，形成簇状发放串（Cluster)第四十四页

24、，共109页。2. 2. 全细胞全细胞(xbo)(xbo)电流电流全细胞电流是一些全细胞电流是一些(yxi)(yxi)形状各异的电流曲形状各异的电流曲线线IA currents2nA20msNa+ currentsIK currentsVh=- 80mV 40mV-60mV第四十五页，共109页。250 ms 400 pA 5.mEPSC4.sEPSC、mEPSC突触电流突触电流(dinli)(dinli)第四十六页，共109页。3.Glu受体电流受体电流(dinli)2s1nA500ms1nA第四十七页，共109页。6.6.神经元动作电位神经元动作电位 第四十八页，共109页。可以使电极阻抗

25、较低。第四十九页，共109页。第五十页，共109页。第五十一页，共109页。第五十二页，共109页。第五十三页，共109页。第五十四页，共109页。第五十五页，共109页。第五十六页，共109页。第五十七页，共109页。第五十八页，共109页。第五十九页，共109页。Electrophysiology-ApparatusFaraday cageVibration Isolation TableMicroscopeMicro-Manipulators Remote ControllerAmplifiersCCD Camera第六十页，共109页。电子学部件：由于膜片钳检测的是PA级的微电流信号，

26、因此需要特殊的放大器及模数转换器，目前国内使用的主流放大器主要是美国AXON公司的200B和Multiclamp700B放大器及德国HEKA公司的EPC10放大器。 200B是电容反馈式放大器，噪声低，适合做单通道膜片钳，Multiclamp700B和EPC10可通过软件进行(jnxng)操作，自动化程度高。第六十一页，共109页。第六十二页，共109页。200B第六十三页，共109页。第六十四页，共109页。第六十五页，共109页。第六十六页，共109页。第六十七页，共109页。第六十八页，共109页。P-2000P-2000P-97P-97SutterSutter公司公司(n s)(n s

27、)微电极拉微电极拉制器制器第六十九页，共109页。Electrophysiology-Apparatus第七十页，共109页。日本成茂公司日本成茂公司(n s)(n s)微电极拉制器和抛光仪微电极拉制器和抛光仪第七十一页，共109页。第七十二页，共109页。机械系统:由于膜片钳实验是一个微电和微操作实验，任何微小的震动都会影响电极和细胞的封接，导致(dozh)实验的失败，因此一台高质量的防震台是必须的。第七十三页，共109页。第七十四页，共109页。第七十五页，共109页。第七十六页，共109页。第七十七页，共109页。软件系统：目前软件系统：目前(mqin)(mqin)的数据采集和的数据采集

28、和分析软件系统主要是分析软件系统主要是AxonAxon公司的公司的PclampPclamp软软件和件和HEKAHEKA公司的公司的Patch MasterPatch Master软件。在实软件。在实验后期文章发表中还涉及到一些图形处理验后期文章发表中还涉及到一些图形处理软件，如软件，如OriginOrigin等软件。等软件。MDC公司公司(n s)Pclamp采集和分采集和分析软件析软件第七十八页，共109页。第七十九页，共109页。膜片钳技术的发展：全自动膜片钳技术（Automated patch clamp technique）的出现标志着膜片钳技术已经发展到了一个崭新阶段，从这个意义上说

29、，前面所讲的膜片钳技术我们称之为传统膜片钳技术（Traditional patch clamp technique），传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞（或一对细胞），对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，它不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选，也不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题，它不仅通量高，一次能记录几个甚至几十个细胞，而且从找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作(cozu)实现了自动化，免除了这些操作(cozu)的复杂与困难。这两个优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了！全自动膜片钳技术采用的标本必须是悬浮细胞，像脑片这类标本无

30、法采用。此外，全自动膜片钳技术只能进行全细胞记录模式、穿孔膜片钳记录模式以及细胞贴附式单通道记录模式，而不能进行其他模式的记录。不同的全自动膜片钳技术所采用的原理也不完全相同，大体上有如下几种： 第八十页，共109页。1. Flip-Tip翻转技术：将一定密度(md)的细胞悬液灌注在玻璃电极中，下降到电极尖端的单个细胞通过在电极外施加负压可以与玻璃电极尖端形成稳定的高阻封接，打破露在玻璃电极尖端开口外的细胞膜就形成了全细胞记录模式。德国Flyion公司的Flyscreen 8500系统采用的就是这一技术，其通量最高为6，即一次可同时记录6个细胞。它的显著特点是：（1）仍然采用玻璃毛坯作为电极；

31、（2）药物施加微量、快速。 第八十一页，共109页。 原理：硅硼玻璃制造的芯片对悬浮细胞进行钳制原理：硅硼玻璃制造的芯片对悬浮细胞进行钳制(qinzh)。芯片上有约。芯片上有约1m的孔，从芯片内侧的孔，从芯片内侧用泵施以负压使悬浮细胞被吸引到开孔处而形成封接。用泵施以负压使悬浮细胞被吸引到开孔处而形成封接。 第八十二页，共109页。2. SealChip技术：完全摒弃了玻璃电极，而是采用SealChip平面电极芯片，一定密度的细胞悬液灌注在芯片上面，随机下降到芯片上约1-2m的孔上并在自动负压(f y)的吸引下形成高阻封接，打破孔下面的细胞膜形成全细胞记录模式。采用这一技术的美国Axon（MD

32、S）公司的PatchXpress 7000A系统是高通量全自动膜片钳技术的典范，是离子通道药物研发的革命性工具，在国外实验室和制药厂广泛用于hERG通道药理学的研究。其通量最高为16，即一次可同时记录16个细胞。同时，其药物施加微量、快速，不仅用于药物筛选，还大量用于离子通道的基础研究第八十三页，共109页。3.Population Patch Clamp技术：同SealChip技术一样，完全摒弃了玻璃电极，而是采用PatchPlate平面电极芯片。该芯片含有多个小室，每个小室中含有很多1-2m的封接孔。在记录时，每个小室中封接成功的细胞数目较多，获得的记录是这些细胞通道电流的平均值。因此，不

33、同小室其通道电流的一致性非常好，变异系数很小。美国Axon（MDS）公司采用这一技术研发出了全自动高通量的IonWorks Quattro系统，成为药物初期筛选的“金标准”第八十四页，共109页。此外，同SealChip技术一样采用平面电极芯片，但只含有一个封接孔的小型全自动膜片钳设备也已经问世。这种小型设备代替了显微镜、防震台/屏蔽网和微操纵器，一次只记录(jl)一个细胞。虽然通量不高，但是由于封接破、膜等过程为自动化，工作效率也有显著提高。德国Nanion公司的Port-a-Patch就是这样的全自动膜片钳设备。 第八十五页，共109页。第八十六页，共109页。第八十七页，共109页。膜片

34、钳技术(jsh)与其它技术(jsh)相结合第八十八页，共109页。第八十九页，共109页。膜片钳技术的应用膜片钳如今已成为基础医学和临床医学的常用研究手段，目前膜片钳技术广泛应用于神经(shnjng)（脑）科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。 以下结合我们的工作，介绍一些应用实例。第九十页，共109页。第九十一页，共109页。细胞特性的研究：细胞的基本特性包括被动膜特性如膜静息电位(din wi)、膜电阻、膜电容、膜时间常数等。而对于可兴奋细胞还包括细胞的主动膜特性如动作电位(din wi)的形式、阈值、幅度、频率等.这些指标往

35、往反映细胞的成熟程度，处于不同发育时期的细胞这些指标往往是有差别的。这为我们进行某些疾病的细胞移植治疗的细胞选择提供了一些参考指标。例如，骨髓问充质干细胞(MSCs)具有多向分化的潜能，在体外培养可向心肌细胞分化，目前的研究认为MSCs是干细胞移植治疗心肌梗死的理想细胞资源 。 MSCs移植治疗心肌梗死能使心功能得到改善，但同时也可能发生心律失常。因此，明确这类MSCs在移植前具有怎样的细胞特性及其发育过程，对移植细胞的选取和干细胞移植后电生理研究具有重要意义，我们的研究发现， MSCs培养4周后其细胞特性比较接近于正常的心肌细胞，因此，笔者认为若以未诱导分化的MSCs做移植，培养4周左右(4

36、46代)的细胞不失为良好的细胞选择。而MSCs钾离子电流表达的不均一性或许是导致心律失常产生的原因之一。第九十二页，共109页。离子通道离子通道(tngdo)的鉴别：的鉴别： 利用膜片钳技术可对细胞表达利用膜片钳技术可对细胞表达的离子通道的离子通道(tngdo)进行定性和定量分析，这为我们明确进行定性和定量分析，这为我们明确某些细胞的电生理特性提供了基础。近年来，神经干细胞已某些细胞的电生理特性提供了基础。近年来，神经干细胞已成为一个研究热点，神经干细胞研究的目的就是应用它结构成为一个研究热点，神经干细胞研究的目的就是应用它结构与功能可塑的特征来修复发生损伤或退行性病变的中枢神经与功能可塑的特

37、征来修复发生损伤或退行性病变的中枢神经系统。对正在分化的神经元细胞系的定性研究表明形态学的系统。对正在分化的神经元细胞系的定性研究表明形态学的发育与功能的成熟并不是完全很好的相关。如果仅通过定性发育与功能的成熟并不是完全很好的相关。如果仅通过定性分析就假定神经干细胞来源的神经元和神经胶质细胞是充分分析就假定神经干细胞来源的神经元和神经胶质细胞是充分分化和有功能的，而无电生理或其他功能性方面的研究证据，分化和有功能的，而无电生理或其他功能性方面的研究证据， 那么这种研究是很难令人信服的，因此，功能性的成熟尤为那么这种研究是很难令人信服的，因此，功能性的成熟尤为重要。我们对培养的新生大鼠海马干细胞

38、分化的神经元的电重要。我们对培养的新生大鼠海马干细胞分化的神经元的电生理特征进行了初步的探讨，结果证实：海马干细胞分化的生理特征进行了初步的探讨，结果证实：海马干细胞分化的神经元可表达瞬时外向钾电流（神经元可表达瞬时外向钾电流（IA）；延迟整流钾电流）；延迟整流钾电流（IK）：钙电流（）：钙电流（Ica);钠电流及钠电流及NMDA受体电流，并可产受体电流，并可产生动作电位，这说明海马干细胞分化的神经元具有神经元的生动作电位，这说明海马干细胞分化的神经元具有神经元的初步的电生理特征，但与原代培养的海马神经元相比无论是初步的电生理特征，但与原代培养的海马神经元相比无论是其各种通道其各种通道(tng

39、do)表达的数量还是动作电位的特征均存表达的数量还是动作电位的特征均存在明显差别，表明其电生理特征尚不成熟。如何使其成为具在明显差别，表明其电生理特征尚不成熟。如何使其成为具有成熟电生理特征的神经元将是下一步研究的重点。有成熟电生理特征的神经元将是下一步研究的重点。第九十三页，共109页。电压门控性离子通道的动力学特性研究:细胞正常功能的维持有赖于各种离子通道数量的平衡表达和功能的精细调节，离子通道存在激活门和失活门两个门，这就决定了离子通道存在激活、关闭和失活三种状态，对这三种状态的动力学过程的研究对揭示电压门控性离子通道的功能特点有重要意义，一些疾病或一些临床药物正是通过对上述动力学过程的

40、影响(yngxing)来发挥作用的。例如SO2是一种常见的全球性大气环境污染物， SO2代谢衍生物可剂量依赖性地增大钠电流,剂量为10和100mol/L时,钠电流分别增大50.5919.08%和82.0618.51%(n=15);此外还与电压呈依赖性关系,但不具有频率依赖性; 10mol/L SO2代谢衍生物不影响(yngxing)钠电流的激活过程,却非常显著地影响(yngxing)其失活过程,作用前后的半数失活电压分别为-69.714.67和-53.274.95 mV (n=10,P0.01),但不改变失活曲线的斜率因子。实验结果提示, SO2衍生物具有类似神经毒物的作用。第九十四页，共10

41、9页。突触联系(linx)、突触传递的研究：突触后电流是神经元之间是否形成突触联系(linx)的特异性电生理指标。神经干细胞移植已成为修复损伤或退行性病变的中枢神经系统的新的治疗手段，移植的干细胞要发挥治疗作用最根本的是要能和其他的正常的神经元发生功能性的联系(linx)。通过突触素及电镜的观察表明，神经干细胞和原代培养神经元体外共培养，二者能发生形态上的突触连接，通过记录突触后电流，证实二者也能发生功能性的联系(linx)，至于干细胞体内移植，他和其他神经元能否发生功能性的突触连接有待进一步研究。 第九十五页，共109页。1. 突触可塑、学习记忆及其机制的研究： 长时程增强（LTP）是评价学

42、习记忆的及其突触可塑的常用的电生理指标。目前，海马脑片离体实验己经广泛(gungfn)用于学习记忆方面的研究，利用膜片钳技术记录脑片LTP，可在细胞水平研究学习记忆的机制。许多学者从不同方面对突触LTP与学习记忆的关系进行了大量的研究，其结果大致可概括为，一些影响LTP的因素确实对学习研究过程产生明显的影响，一些影响学习过程的因素也影响LTP形成。诱导海马脑区的LTP形成可提高学习记忆活动，学习过程中伴有海马脑区LTP的形成。丙戊酸钠是常用的抗癫痫药，但近年来发现其损伤患者的学习记忆功能。我们观察了丙戊酸钠对大鼠海马LTP的影响及其作用机制。初步表明丙戊酸钠对LTP的影响是通过突触前机制起作用。第九十六页，共109页。第九十七页，共109页。第九十八页，共109页。第九十九页，共109页。第一百页，共109页。第一百零一页，共109页。第一百零二页，共109页。第一百零三页，共109页。第一百零四页，共109页。疾病机制研究：疾病机制研究： 离子通道结构和功能的异常可导致离子通道病，人离子通道结构和功能的异常可导