第九章色谱技术

1、第九章第九章 色谱技术色谱技术生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程原料液原料液细胞分离细胞分离( (离心，过滤离心，过滤) )细胞胞内产物细胞胞内产物路线一路线一路线二路线二细胞破碎细胞破碎碎片分离碎片分离路线一路线一A A路线一路线一B B清液胞外产物清液胞外产物粗分离粗分离( (盐析、萃取、超过滤等盐析、萃取、超过滤等) )纯化纯化( (层析、电泳层析、电泳) )脱盐脱盐( (凝胶过滤、超过滤凝胶过滤、超过滤) )浓缩浓缩( (超过滤超过滤) )精制精制( (结晶、干燥结晶、干燥) )包含体包含体溶解溶解( (加盐酸胍、脲加盐酸胍、脲) )复性复性目的和要求目的和要求 了解色谱原理

2、，掌握各种常用色谱了解色谱原理，掌握各种常用色谱方法的操作与应用。方法的操作与应用。 主要讲授内容主要讲授内容n一、色谱原理与分类一、色谱原理与分类n二、色谱过程理论模二、色谱过程理论模型型n三、分离度三、分离度n四、凝胶过滤色谱四、凝胶过滤色谱n五、离子交换色谱五、离子交换色谱n六、疏水性相互作用六、疏水性相互作用色谱色谱n七、反相色谱七、反相色谱n八、流通色谱八、流通色谱n九、置换色谱九、置换色谱一、色谱原理与分类一、色谱原理与分类n识记：识记：色谱色谱方法分类方法分类 n理解：理解：色谱色谱原理原理 n概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱

3、柱的一般结构含有谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）固定相（多孔介质）和和流动流动相相，根据物质在两相间的，根据物质在两相间的分配行为不同分配行为不同（由于亲（由于亲和力差异），和力差异），经过多次分配经过多次分配（吸附（吸附- -解吸解吸- -吸附吸附- -解吸解吸），达到分离的目的。），达到分离的目的。固定相（固定相（stationary phase）流动相（流动相（mobile phase）1. 定义（定义（chromatograph）n色谱是根据混合物中溶质在互不混溶的两相间色谱是根据混合物中溶质在互不混溶的两相间分分配行为的差别配行为的差别引起移动速度的不同，而进行分离引起移动速度的

4、不同，而进行分离的方法。的方法。2、原理、原理 色谱操作中互不混溶的色谱操作中互不混溶的两相分别称为两相分别称为固定相固定相和和流流动相动相。固定相固定相填充于柱内填充于柱内形成固定床，在柱的入口形成固定床，在柱的入口端加入料液后，连续输入端加入料液后，连续输入流动相流动相，料液中溶质在流，料液中溶质在流动相与固定相之间扩散传动相与固定相之间扩散传质，产生分配平衡质，产生分配平衡在色谱过程中，分配系数在色谱过程中，分配系数大的溶质在固定相上存在大的溶质在固定相上存在的的概率大概率大，随流动相，随流动相移动移动速度小速度小。由此，溶质之间。由此，溶质之间由于移动速度的不同而得由于移动速度的不同而

5、得到分离。到分离。（1）流动相分类）流动相分类n气相气相色谱色谱n液相液相色谱色谱n超临界超临界色谱色谱 色谱泵自动进样器自动进样器 检测器废液数据处理系统（2）固相分类）固相分类n类型类型 分配色谱（固定相为液相）分配色谱（固定相为液相） 吸附色谱（固定相为固相）吸附色谱（固定相为固相）n形状形状 纸色谱纸色谱 薄层色谱薄层色谱 柱色谱柱色谱纸层析薄层层析两相溶剂中的一相涂覆在硅两相溶剂中的一相涂覆在硅胶载体上，作为固定相填充胶载体上，作为固定相填充与色谱柱中，另一相与固定与色谱柱中，另一相与固定相不相混溶，作为流动相。相不相混溶，作为流动相。（3）操作压力分类）操作压力分类n低压液相色谱（

6、低压液相色谱（4.0 MPa）（4）流动相流动方式分类）流动相流动方式分类n轴向流色谱轴向流色谱n径向流色谱径向流色谱（5）分离操作方式分类）分离操作方式分类n洗脱洗脱色谱色谱（洗脱展开）（洗脱展开）（elution development ）n迎头迎头色谱色谱（frontal analysia）n置换色谱（置换展开）（置换色谱（置换展开）（displacement development）n洗脱洗脱色谱色谱（洗脱展开）（洗脱展开）n料液中的溶质根据其在固定相和流动相（洗脱剂）间的分配行为的料液中的溶质根据其在固定相和流动相（洗脱剂）间的分配行为的不同，在色谱柱出口处被展开形成相互分离的色谱峰

7、。不同，在色谱柱出口处被展开形成相互分离的色谱峰。ABn这种方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，这种方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是色谱法除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是色谱法中中最常用最常用的一种方法。的一种方法。ABn迎头分析法迎头分析法 迎头分析法与一般的固定床吸附操作相同，大量迎头分析法与一般的固定床吸附操作相同，大量的料液连续输入到色谱柱中，直到在出口处发生溶的料液连续输入到色谱柱中，直到在出口处发生溶质穿透。质穿透。 迎头分析中各溶质按其在固定相和流动相间分配迎头分析中各

8、溶质按其在固定相和流动相间分配系数的大小次序穿透，因此，只有最先穿透的（分系数的大小次序穿透，因此，只有最先穿透的（分配系数最小）组分能以纯的状态得到部分回收。配系数最小）组分能以纯的状态得到部分回收。n该法在分离多组分混合物时，除第一组分外，其余均非纯态，因此该法在分离多组分混合物时，除第一组分外，其余均非纯态，因此仅适用于从含有微量杂质的混合物中切割出一个高纯组分（组分仅适用于从含有微量杂质的混合物中切割出一个高纯组分（组分A），而不适用于对混合物进行分离。），而不适用于对混合物进行分离。n置换展开置换展开n置换展开即置换色谱，与普通的洗脱色谱所不同的是，置换色谱所置换展开即置换色谱，与普

9、通的洗脱色谱所不同的是，置换色谱所采用的洗脱液（流动相）中含有与固定相的亲和作用比料液中的各采用的洗脱液（流动相）中含有与固定相的亲和作用比料液中的各个组分都要大的物质（置换剂）。它将料液中所含溶质按其与固定个组分都要大的物质（置换剂）。它将料液中所含溶质按其与固定相亲和力的大小不同，从固定相上依次置换（洗脱）下来，彼此得相亲和力的大小不同，从固定相上依次置换（洗脱）下来，彼此得以分离。以分离。ABn此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分；其此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分；其缺点是经一次使用后，缺点是经一次使用后，柱子就被样品或顶替剂饱和柱子就被样品或顶替剂饱和，必须更换柱子或除去被柱子吸

10、附的物，必须更换柱子或除去被柱子吸附的物质后，才能再使用。质后，才能再使用。AB（6）机理分类）机理分类n凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱n离子交换色谱离子交换色谱n反相色谱反相色谱n疏水性相互作用色谱疏水性相互作用色谱n亲和色谱亲和色谱（7 7）色谱流出曲线及有关术语）色谱流出曲线及有关术语（一）色谱流出曲线和色谱峰（一）色谱流出曲线和色谱峰 n由检测器输出的由检测器输出的信号强度信号强度对对时间时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。曲线上突起部分就是色谱峰。n如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分如果进样量很小，浓度很低，

11、在吸附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的。配等温线（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的。（二）基线（二）基线 在实验操作条件下，在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是，稳定的基线应该是一条水平直线。一条水平直线。（三）峰高（三）峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h h）表示。表示。 n色谱流出曲线和色谱峰色谱流出曲线和色谱峰n基线（基线（a）n峰高（峰高（h）信号信号进样空气峰ha色谱流出曲线色谱流出曲线色谱峰

12、色谱峰（四）保留值（四）保留值 .死时间死时间t tM M 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图它正比于色谱柱的空隙体积，如下图。信号进样tM 因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其其流动速度将与流动相流动速度相近。流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动测定流动相相平均线速平均线速 时，可用柱长时，可用柱长L L与与t tM M的比值计算，的比值计算，即即 = L/tM. 保留时间保留时间tR 试样

13、从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为间，称为保留时间保留时间，如下图。，如下图。信号信号进样进样tR.调整保留时间调整保留时间t tR R 某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的的调整保留时间调整保留时间， 即即 tR = tR tM 由于组分在色谱柱中的保留时间由于组分在色谱柱中的保留时间t tR R包含了组分包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，中滞留所须的时间，所以所以t tR R实际上是组分在固定实际上是组分在固定相中保留的总

14、时间。相中保留的总时间。 保留时间是色谱法定性的基本依据，保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。来表示保留值。.死体积死体积V V0 0 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小可忽略及检测器的空间的总和。当后两项很小可忽略不计时，不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载死体积可由死时间与色谱

15、柱出口的载气流速气流速F Fcoco（cmcm3 3minmin-1-1）计算）计算。 V0 = tMFco 式中式中 Fco为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。流速。仅适用于气相色谱仅适用于气相色谱，不适用于液相色，不适用于液相色谱谱。. . 保留体积保留体积V VR R 指从进样开始到被测组分在指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极柱后出现浓度极大点大点时所通过的流动相的体积。保留时间与时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系：保留体积关系： VR= tR Fco .调整保留体积调整保留体积V VR R 某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分某组分

16、的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。的调整保留体积。 VR = VR V0 = tR Fco .相对保留值相对保留值r r2,12,1 某组分某组分2 2的调整保留值与组分的调整保留值与组分1 1的调整保留的调整保留值之比，称为相对保留值。值之比，称为相对保留值。 r2,1= tR2 / tR1 = VR2 / VR1 由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛广泛用作定性

17、的依据用作定性的依据。 在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s s），然后再求其它峰（），然后再求其它峰（i i）对这个峰的相对）对这个峰的相对保留值，此时可用符号保留值，此时可用符号 表示，表示，即即 = tR (i) / tR (s) 相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。又称选择因子。 ( (五五) ) 区域宽度区域宽度 色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的

18、动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种三种方法方法。（）标准偏差）标准偏差 即即0.6070.607倍峰高处倍峰高处色谱峰宽色谱峰宽的的一半。一半。（）半峰宽）半峰宽Y Y1/21/2即峰高一半处对应的峰宽。它即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为与标准偏差的关系为 Y Y1/21/2=2.354=2.354 （）峰底宽度）峰底宽度Y Y即色谱峰两侧拐点上的切线在即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差基线上截距间的距离。它与标准偏差 的关系是的关系是 Y = 4 Y = 4 从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：从色谱流出曲线中，可

19、得许多重要信息：(i) (i) 根据色谱峰的个数根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的，可以判断样品中所含组分的最少个数；最少个数；(ii) (ii) 根据色谱峰的保留值根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；，可以进行定性分析；(iii) (iii) 根据色谱峰的面积或峰高根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；，可以进行定量分析；(iv) (iv) 色谱峰的保留值及其区域宽度色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱，是评价色谱柱分离效能的依据；分离效能的依据；(v) (v) 色谱峰两峰间的距离色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相），是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。选择

20、是否合适的依据。 色谱分析的色谱分析的目的目的是将样品中是将样品中各组分彼此分离各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。即与色谱过程的热力学性质有关。 但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱

21、过程的动力学性质有关。因此，谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。力学两方面来研究色谱行为。 色谱色谱过程理论模型过程理论模型cqKd 迁移距离流动相在色谱系统中的溶质的迁移距离fRsdmmfAKAARAs为固定相的平均截面积为固定相的平均截面积,Am为流动相的平均截面积为流动相的平均截面积sdmeVKVVVm为色谱柱中流动相体积；为色谱柱中流动相体积； Vs为色谱柱中固定相的体积为色谱柱中固定相的体积塔板理论塔板理论nMartin和和Synge最早提出塔板理论，将色谱柱比最早提出塔板理论，将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由许多小作蒸馏

22、塔，把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间为固定相占段组成。在每一小段内，一部分空间为固定相占据，另一部分空间充满流动相。据，另一部分空间充满流动相。n组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。并假定在每一组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。并假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡，这样一个小段称作小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡，这样一个小段称作一个一个理论塔板理论塔板(theoretical plate),一个理论塔板的长度称为一个理论塔板的长度称为理论塔理论塔板高度板高度（theoretical plate height）H。n

23、经过多次分配平衡，分配系数小的组分，先离经过多次分配平衡，分配系数小的组分，先离开蒸馏塔，分配系数大的组分后离开蒸馏塔。开蒸馏塔，分配系数大的组分后离开蒸馏塔。n由于色谱柱内的塔板数相当多，因此即使组分由于色谱柱内的塔板数相当多，因此即使组分分配系数只有微小差异，仍然可以获得好的分分配系数只有微小差异，仍然可以获得好的分离效果。离效果。22/1)(54. 5WtNR2)(16bRWtN NLH 三、分离度三、分离度n识记：识记：分离度的概念分离度的概念 n理解：理解：如何分离度判断两个相邻洗脱峰的分如何分离度判断两个相邻洗脱峰的分离程度离程度 （1）定义及表述）定义及表述n定义定义 分离度又称

24、分辨率，是表达两种洗脱曲线相邻的溶分离度又称分辨率，是表达两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度质相互分离的程度 n分离度的表达分离度的表达nGaussGauss洗脱曲线的分离度洗脱曲线的分离度21122WWRRRS1221122 2SF mmNRm Fm FR平均洗平均洗脱时间脱时间m分配系分配系数数W为底线处为底线处切线峰宽切线峰宽F=(1-c)/ cc为色谱柱为色谱柱空隙率空隙率（2）分离度的其它表征方法）分离度的其它表征方法n容量因子容量因子k k 容量因子是固定相与流动相间溶质分配量之比，用容量因子是固定相与流动相间溶质分配量之比，用k k表示表示n选择性选择性 选择性为洗脱峰相邻的两

25、种溶质的容量因子之比选择性为洗脱峰相邻的两种溶质的容量因子之比22114121kkNRS121224 1SkkRNk)1 (4)(s2122/1FmNmmFR(7.35a)四、凝胶过滤四、凝胶过滤色谱色谱n理解：理解：凝胶过滤的原理和操作，凝胶过滤介凝胶过滤的原理和操作，凝胶过滤介质的要求和影响分离特性的因素质的要求和影响分离特性的因素 n应用：应用：掌握凝胶掌握凝胶色谱色谱的应用及特点的应用及特点 （1）定义）定义n凝胶过滤色谱利用凝胶粒子为固定相，是根据料液中溶质相对分子凝胶过滤色谱利用凝胶粒子为固定相，是根据料液中溶质相对分子量的差别进行分离的液相色谱法。量的差别进行分离的液相色谱法。n

26、Gel filtration chromatography，GFCn又称又称尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱（Size exclusion chromatography， SEC）（2）原理）原理n在在GFCGFC柱中，分子量大的溶质柱中，分子量大的溶质不能进入凝胶介质，而沿介质不能进入凝胶介质，而沿介质空隙流过空隙流过n分子量很小的溶质能够进入所分子量很小的溶质能够进入所有的细孔中，其洗脱体积接近有的细孔中，其洗脱体积接近柱体积柱体积n分子两介于两者之间的溶质能分子两介于两者之间的溶质能够进入部分细孔中。够进入部分细孔中。分离过程分离过程（3）分配系数）分配系数n凝胶过滤色谱的分配系数可用下式表示凝

27、胶过滤色谱的分配系数可用下式表示00tVmVVV n料液中溶质料液中溶质1的相对分子质量很大的相对分子质量很大,不能进入到凝不能进入到凝胶的细孔中胶的细孔中,因而从凝胶间的床层空隙流过因而从凝胶间的床层空隙流过,洗脱洗脱体积为色谱柱的空隙体积体积为色谱柱的空隙体积V0；n对于溶质对于溶质4,其相对分子质量很小其相对分子质量很小,能够进入到凝胶能够进入到凝胶的所有细孔中的所有细孔中,因而其洗脱体积接近柱体积因而其洗脱体积接近柱体积Vt;n相对分子质量介于溶质相对分子质量介于溶质1和溶质和溶质4之间的溶质之间的溶质2和和3可进入到凝胶的部分细孔中可进入到凝胶的部分细孔中, 故其洗脱体积介于故其洗脱

28、体积介于V0和和Vt之间。之间。nGFC可分离洗脱体积介于可分离洗脱体积介于V0 和和Vt之间的溶质之间的溶质,即分配系数为即分配系数为0m1。因此因此,GFC的分离精度有限的分离精度有限,料液的处理量也很小。料液的处理量也很小。（4）影响分配系数因素）影响分配系数因素n相对分子质量相对分子质量 相对分子量一定的溶质的相对分子量一定的溶质的m值为常数，为凝胶介质对该溶质的有效值为常数，为凝胶介质对该溶质的有效孔隙率孔隙率p； 分配系数随相对分子量的增加而降低；分配系数随相对分子量的增加而降低；n分子形状分子形状n凝胶结构（孔径分布）凝胶结构（孔径分布）nm与所有洗脱液的与所有洗脱液的pH和离子

29、强度等物性无关和离子强度等物性无关（5）凝胶过滤色谱介质应满足条件）凝胶过滤色谱介质应满足条件n亲水性高，表面惰性亲水性高，表面惰性n稳定性好，在较宽的稳定性好，在较宽的pH和离子强度范围及化学试剂和离子强度范围及化学试剂中保持稳定，使用寿命长；中保持稳定，使用寿命长；n具有一定的孔径分布范围；具有一定的孔径分布范围；n机械强度高，允许较高的操作压力（流速）；机械强度高，允许较高的操作压力（流速）；（6）常用的）常用的GFC介质介质n葡聚糖凝胶介质葡聚糖凝胶介质 葡聚糖（右旋糖酐）与环氧氯丙烷合成葡聚糖（右旋糖酐）与环氧氯丙烷合成n琼脂糖凝胶介质琼脂糖凝胶介质 琼脂糖与环氧氯丙烷合成琼脂糖与环

30、氧氯丙烷合成n其他亲水性高分子合成的凝胶介质其他亲水性高分子合成的凝胶介质n多种多糖制备的凝胶介质多种多糖制备的凝胶介质Sephadex GSepharose CL/FFTSKSuperose（7）凝胶特性参数）凝胶特性参数n排阻极限排阻极限(exclusion limit) 不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量n分级范围分级范围(fractionation range) 能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子量范围相对分子量范围n溶胀率溶胀率 介质溶胀后每千克干凝胶所吸收的水分的

31、百分数介质溶胀后每千克干凝胶所吸收的水分的百分数其他参数其他参数 凝胶粒径、床体积凝胶粒径、床体积(bed)、空隙体积、空隙体积(void volume)（8）影响分离的因素）影响分离的因素n线速度线速度n料液体积料液体积n料液浓度料液浓度n分子量与分配系数关系分子量与分配系数关系n凝胶粒径凝胶粒径（9）凝胶过滤色谱的应用凝胶过滤色谱的应用n分离纯化分离纯化nGFC可用于相对分子质量从几百到可用于相对分子质量从几百到106数量级的数量级的物质的分离纯化物质的分离纯化,是蛋白质、肽、脂质、抗生素、是蛋白质、肽、脂质、抗生素、糖类、核酸以及病毒糖类、核酸以及病毒(50-400nm)的分离与分析中的

32、分离与分析中频繁使用的液相色谱法。频繁使用的液相色谱法。n此外此外,GFC还可用于医药产业中无热原水的制备还可用于医药产业中无热原水的制备以及低分子生物制剂中抗原性杂质的除去。以及低分子生物制剂中抗原性杂质的除去。n脱盐脱盐nGFC的另一主要用途是生物大分子溶液的脱盐的另一主要用途是生物大分子溶液的脱盐,以及除去其中的低以及除去其中的低相对分子质量物质。例如相对分子质量物质。例如,经过盐析沉淀获得的蛋白质溶液中盐浓经过盐析沉淀获得的蛋白质溶液中盐浓度很高度很高,一般不能直接进行离子交换色谱分离一般不能直接进行离子交换色谱分离,可首先用可首先用GFC脱盐。脱盐。n用于溶解目标产物的缓冲液的交换用

33、于溶解目标产物的缓冲液的交换n生物物质的分离纯化需要多步操作，上一步操作所用缓冲液有时不生物物质的分离纯化需要多步操作，上一步操作所用缓冲液有时不适合手下一步单元操作的有效实施适合手下一步单元操作的有效实施(例如例如,某些盐离子抑制蛋自质在某些盐离子抑制蛋自质在亲和吸附剂上的吸附亲和吸附剂上的吸附),必须进行缓冲液的交换。若将缓冲液必须进行缓冲液的交换。若将缓冲液A换成换成缓冲液缓冲液B,可先用可先用B液冲洗液冲洗GFC柱柱,上样后用上样后用B液洗脱，即可完成缓冲液洗脱，即可完成缓冲液的交换。液的交换。相对分子量测定相对分子量测定n在凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配系数在凝胶过滤介质的分级

34、范围内蛋白质的分配系数(或洗脱体积或洗脱体积)与相对分子质量的对数呈线性关系与相对分子质量的对数呈线性关系,所以所以CFC可用于未知物质相对分子质量的测定。可用于未知物质相对分子质量的测定。操作过程操作过程n首先用标准蛋白质如细胞色素首先用标准蛋白质如细胞色素C(12500,指相对分子质量指相对分子质量)、肌红蛋、肌红蛋白白(16900)、胰凝乳蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(23200)、卵白蛋白、卵白蛋白(45000)和血红蛋白和血红蛋白(64500)等分别进行凝胶过滤色谱实验等分别进行凝胶过滤色谱实验,确定分配系数与相对分子质确定分配系数与相对分子质量的关系式。量的关系式。n然后测定未知物质的洗脱

35、体积然后测定未知物质的洗脱体积(分配系数分配系数),就可推算其相对分子质量。就可推算其相对分子质量。（10）特点）特点n溶质与介质溶质与介质不发生任何形式的相互作用不发生任何形式的相互作用，因此可采，因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率接近接近100%；n分离结束后分离结束后无需苛刻的介质清洗或再生无需苛刻的介质清洗或再生，循环操作，循环操作易实现，提高了产品纯度；易实现，提高了产品纯度；n作为脱盐手段，作为脱盐手段，GFC比透析法速度快、精度高；比透析法速度快、精度高；与超滤法相比，剪切应力小，蛋白活性收率高；与超滤法相比，剪切应力

36、小，蛋白活性收率高；n分离机理简单，操作参数小，规模放大容易；分离机理简单，操作参数小，规模放大容易；（11）不足）不足n仅根据溶质间相对分子质量的差异进行分离，仅根据溶质间相对分子质量的差异进行分离，选择选择性低，料液处理量小性低，料液处理量小，一般为柱体积的，一般为柱体积的5%；n经经GFC洗脱展开后产品洗脱展开后产品被稀释被稀释，因此需要在其它浓，因此需要在其它浓缩作用的单元操作后使用。缩作用的单元操作后使用。五、离子交换五、离子交换色谱色谱nIon exchange chromatography，IECn理解：理解：离子交换色谱的原理和操作，线离子交换色谱的原理和操作，线性梯度洗脱过程

37、和逐次洗脱过程性梯度洗脱过程和逐次洗脱过程 n应用：应用：掌握离子交换色谱的应用特点掌握离子交换色谱的应用特点（1）概念）概念 离子交换色谱是利用离子交换色谱是利用离子交换剂为固定相，离子交换剂为固定相，根据根据荷电溶质与离子荷电溶质与离子交换剂之间的静电相交换剂之间的静电相互作用力互作用力的差别进行的差别进行溶质分离的洗脱色谱溶质分离的洗脱色谱法。法。（2）分配系数）分配系数n溶质在离子交换剂上的分配系数可表示为溶质在离子交换剂上的分配系数可表示为其中其中m为离子强度无限大时溶质的分配系数为离子强度无限大时溶质的分配系数n分配系数对分配系数对I很敏感，很敏感， I 微小的变化都会引起分配系微

38、小的变化都会引起分配系数的改变；数的改变；n不同蛋白质不同蛋白质B值相差很大值相差很大 mIAImBI为流动相的离子强度为流动相的离子强度A、B为常数为常数主要阴离子交换配基主要阴离子交换配基二乙胺乙基，二乙胺乙基，Diethylaminoethyl (DEAE) Quaternary aminoethyl (QAE)季胺乙基，季胺乙基，Quaternary ammonium (Q)主要阳离子交换配基主要阳离子交换配基羧甲基，羧甲基，Carboxymethyl (CM)磺丙基，磺丙基，Sulphopropyl (SP)Methyl sulphonate (S)（3）线性洗脱法）线性洗脱法n线形

39、洗脱法（线形洗脱法（linear gradient elution) 流动相的离子强度流动相的离子强度线性线性增大，因此溶质的分配系数连续降低，增大，因此溶质的分配系数连续降低，移动速度逐渐增大移动速度逐渐增大n特点特点 难于洗脱的溶质在较小流动相体积下洗脱；难于洗脱的溶质在较小流动相体积下洗脱； 改变流动相离子强度增大速度可调节溶质的洗脱体积；改变流动相离子强度增大速度可调节溶质的洗脱体积； 流动相离子强度（盐浓度）连续增大，不出现干扰峰，操作流动相离子强度（盐浓度）连续增大，不出现干扰峰，操作范围广；范围广； 需要特殊调配浓度梯度的设备。需要特殊调配浓度梯度的设备。（4）阶跃梯度洗脱法）阶

40、跃梯度洗脱法n阶跃梯度洗脱法（阶跃梯度洗脱法（Stepwise elution） 流动相的离子强度流动相的离子强度阶跃增大阶跃增大，溶质的分配系数的降低和移动，溶质的分配系数的降低和移动速度的增大也是速度的增大也是阶段式阶段式的。的。n特点特点 当阶跃速度很快，则其接近线性梯度洗脱；反之，则接近恒当阶跃速度很快，则其接近线性梯度洗脱；反之，则接近恒定洗脱；定洗脱； 利用切换不同盐浓度的流动相进行洗脱，不需要特殊梯度设利用切换不同盐浓度的流动相进行洗脱，不需要特殊梯度设备，操作简便；备，操作简便； 流动相浓度不连续变化，易出干扰峰；流动相浓度不连续变化，易出干扰峰； 易出现多组分洗脱峰重叠现象；

41、易出现多组分洗脱峰重叠现象；（5）洗脱时间）洗脱时间线性梯度洗脱过程中线性梯度洗脱过程中溶质的迁移速度溶质的迁移速度vp为为 1ppdzuvdtmHIm(I)不再为常数，不再为常数，而是而是I的函数的函数 由于与生物大分子相比，由于与生物大分子相比，IEC柱内盐离子在固定相粒子内柱内盐离子在固定相粒子内传质非常快，盐离子在两相间的平衡瞬间完成，则传质非常快，盐离子在两相间的平衡瞬间完成，则mcHfudtdzv1sIIm I对盐离子而言，可有如下的方程：对盐离子而言，可有如下的方程：22SzIIIIIDuFtzzt对线性梯度而言对线性梯度而言Iz常数220Iz洗脱时间洗脱时间 通过测定不同流动相

42、离子强度梯度下溶质洗脱位置通过测定不同流动相离子强度梯度下溶质洗脱位置离子强度离子强度Ip值，可获得值，可获得Ip与与GH之间的关系曲线之间的关系曲线 0GHpIIIpfdIm ImI0GHtIVVV其中其中01pIRIILFmtIV Fu洗脱时间为洗脱时间为：（P169 图图7-20）GH：离子强度梯度与：离子强度梯度与柱内固相体积的积柱内固相体积的积可推算溶质的洗脱时间可推算溶质的洗脱时间 I/V流动相的离子强度梯度流动相的离子强度梯度F=(1- c )/ cc 色谱柱色谱柱空隙率空隙率mI分配系数分配系数（6） IEC柱内溶质迁移柱内溶质迁移n在线性梯度洗脱条件下，在线性梯度洗脱条件下，

43、IEC柱内溶质区带的后部柱内溶质区带的后部移动速度高于前部，即线性梯度洗脱具有移动速度高于前部，即线性梯度洗脱具有区带浓缩区带浓缩作用；作用；n随着区带宽度的增加，区带前后溶质运动速度差增随着区带宽度的增加，区带前后溶质运动速度差增大，即浓缩作用增大；大，即浓缩作用增大；n当区带宽度增至一定值后，浓缩与分散作用达到平当区带宽度增至一定值后，浓缩与分散作用达到平衡，区带将以一定的宽度向下移动。衡，区带将以一定的宽度向下移动。（7） 分离度分离度n当离子强度梯度一定时，分离度与柱高无关当离子强度梯度一定时，分离度与柱高无关n当柱高一定时，分离度随离子强度梯度的降低而增大当柱高一定时，分离度随离子强

44、度梯度的降低而增大n分离度与分离度与 成反比；与成反比；与 成正比。成正比。11221011HETPHETPCSRIVIVLVA12pd uAc为为IEC柱的截面积；柱的截面积；HEPT：理论板当量高度：理论板当量高度L柱长；柱长；V0柱的空隙体积柱的空隙体积I/V离子强度梯度离子强度梯度u流动相的线速度流动相的线速度dp固相粒子直径固相粒子直径GH：离子强度梯度与柱内固相体积的积：离子强度梯度与柱内固相体积的积（8）特点）特点n料液处理量大，具有浓缩作用；料液处理量大，具有浓缩作用；n应用范围广泛，通过优化条件可大幅度提高分离的应用范围广泛，通过优化条件可大幅度提高分离的选择性，所需柱长短；

45、选择性，所需柱长短；n吸附作用机理明确，非特异性吸附小，产品回收率吸附作用机理明确，非特异性吸附小，产品回收率高；高；n离子交换剂种类多，选择余地大，价格远低于亲和离子交换剂种类多，选择余地大，价格远低于亲和吸附剂；吸附剂；n影响分离特性因素复杂；影响分离特性因素复杂；六、疏水性相互作用六、疏水性相互作用色谱色谱n(hydrophobic interaction chromatography，HIC)n理解：原理，影响疏水性吸附的因素理解：原理，影响疏水性吸附的因素 n应用：掌握疏水性相互作用色谱方法对应用：掌握疏水性相互作用色谱方法对蛋白质分离蛋白质分离（1）定义）定义 疏水性相互作用色谱疏

46、水性相互作用色谱利用表面偶联弱疏水性基团利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋（疏水性配基）的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用弱疏水性相互作用的差的差别，进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱色谱别，进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱色谱法。法。（2）原理）原理n组成蛋白质的氨基酸中包括一些组成蛋白质的氨基酸中包括一些疏水性氨基酸疏水性氨基酸基基团，如苯丙氨酸，酪氨酸；团，如苯丙氨酸，酪氨酸；n这些基团大部分处于蛋白质内部，但有这些基团大部分处于蛋白质内部，但有部分疏水部分疏水基团暴露于蛋白质表面基团暴露

47、于蛋白质表面；n在在高离子强度高离子强度盐溶液中，蛋白质表面的盐溶液中，蛋白质表面的水化层被水化层被破坏破坏，更多的疏水部分暴露在外；更多的疏水部分暴露在外；n这些暴露在外的这些暴露在外的疏水基团疏水基团与介质上的与介质上的弱疏水性配基弱疏水性配基发生疏水性作用，发生疏水性作用，被固定相吸附被固定相吸附n蛋白质在疏水性吸附剂上的蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数分配系数随流动相盐析随流动相盐析盐浓度盐浓度的提高而的提高而增大增大nHIC采用采用高盐下吸附，低盐下洗脱高盐下吸附，低盐下洗脱。原理示意图原理示意图（3）疏水性吸附剂）疏水性吸附剂n常用配基常用配基 苯基、短链烷基、苯基、短链烷基、 烷

48、氨基、聚乙二醇聚醚烷氨基、聚乙二醇聚醚n修饰密度修饰密度 疏水配基修饰密度一般在疏水配基修饰密度一般在1040 mol/mL 疏水性吸附作用与配基的疏水性和配基目的成正比，疏水性吸附作用与配基的疏水性和配基目的成正比，故配基的修饰密度应根据配基的疏水性而异故配基的修饰密度应根据配基的疏水性而异。（4）影响疏水性吸附的因素）影响疏水性吸附的因素离子强度、种类和破坏水化作用的物质离子强度、种类和破坏水化作用的物质n离子强度及种类离子强度及种类 蛋白质的疏水性吸附作用随离子强度提高而增大；蛋白质的疏水性吸附作用随离子强度提高而增大； 离子的种类也对蛋白质疏水性吸附有着重要影响离子的种类也对蛋白质疏水

49、性吸附有着重要影响n破坏水化作用的物质破坏水化作用的物质 离子半径大、电荷密度低的阴离子可减弱水分子间相互作用，离子半径大、电荷密度低的阴离子可减弱水分子间相互作用，具有破坏水化作用的性质（离液离子）具有破坏水化作用的性质（离液离子） 离液离子存在下疏水性作用减弱；离液离子存在下疏水性作用减弱； 乙二醇和丙三醇等含羟基的物质也具有影响水化的作用，降乙二醇和丙三醇等含羟基的物质也具有影响水化的作用，降低蛋白疏水性吸附作用，作为洗脱促进剂；低蛋白疏水性吸附作用，作为洗脱促进剂；影响疏水性吸附的因素影响疏水性吸附的因素离液离子及顺序离液离子及顺序离液效应离液效应破坏水化破坏水化作用作用盐析效应盐析效

50、应在离液离子存在离液离子存在下疏水性吸在下疏水性吸附减弱附减弱,蛋白质蛋白质易于洗脱。易于洗脱。摩尔表面张力摩尔表面张力影响疏水性吸附的因素影响疏水性吸附的因素表面活性剂及温度表面活性剂及温度n表面活性剂表面活性剂 表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，从而从而减弱蛋白质的疏水性吸附减弱蛋白质的疏水性吸附。n温度温度 一般吸附为放热过程，而一般吸附为放热过程，而疏水性吸附的结合作用随疏水性吸附的结合作用随温度升高而增大温度升高而增大2ln0dKHdTRT蛋白质的分离应用蛋白质的分离应用nHIC基于疏水性吸附分离纯化蛋白质类生物大分子，与基于疏水

51、性吸附分离纯化蛋白质类生物大分子，与IEC的离子的离子交换作用完全不同。交换作用完全不同。nHIC不仅是一种有效的分离纯化手段不仅是一种有效的分离纯化手段,而且还可与而且还可与IEC互补短长互补短长,分离分离纯化利用纯化利用IEC难于分离的蛋白质。难于分离的蛋白质。n但是但是,由于疏水性相互作用机理比较复杂由于疏水性相互作用机理比较复杂,吸附剂的选择和洗脱分离吸附剂的选择和洗脱分离条件不易掌握。条件不易掌握。n因此因此,在利用在利用HIC分离蛋白质的混合物时分离蛋白质的混合物时,需事先利用各种小型预装需事先利用各种小型预装柱进行吸附与洗脱实验柱进行吸附与洗脱实验,确定最佳吸附剂和洗脱分离溶剂。

52、确定最佳吸附剂和洗脱分离溶剂。（5）特点）特点n 由于在高浓度盐溶液中疏水性吸附作用较大由于在高浓度盐溶液中疏水性吸附作用较大,因因此此HIC 可可直接分离盐析后的蛋白质溶液。直接分离盐析后的蛋白质溶液。n 可通过调节疏水配基链长和密度调节吸附力可通过调节疏水配基链长和密度调节吸附力,因因此可根据目标产物的性质选择适宜的吸附剂。此可根据目标产物的性质选择适宜的吸附剂。n 疏水性吸附剂种类较多疏水性吸附剂种类较多,选择余地大选择余地大,价格与离子价格与离子交换剂相当。交换剂相当。七、反相七、反相色谱色谱nreversed-phase liquid chromatography，RPLCn理解理解

53、：反相色谱技术的原理及操作，：反相色谱技术的原理及操作，n应用应用：了解反相色谱技术的应用范围及优缺点：了解反相色谱技术的应用范围及优缺点（1 1）定义）定义n利用表面利用表面非极性非极性的反相介质为固定相，的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水极性有机溶剂的水溶液为流动相，溶液为流动相，是根据溶质极性（疏水性）的差别进行分是根据溶质极性（疏水性）的差别进行分离纯化的洗脱层析法。离纯化的洗脱层析法。与与HIC的异同的异同n反相层析中溶质亦通过疏水性作用分配于固定相表面；反相层析中溶质亦通过疏水性作用分配于固定相表面；n反相层析固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现强烈的疏水性；反相层析固定相表面

54、完全被非极性基团所覆盖，表现强烈的疏水性；n必须采用极性有机溶剂或其水溶液进行洗脱。必须采用极性有机溶剂或其水溶液进行洗脱。（2 2）分配系数）分配系数n溶质在反相色谱中分配系数取决于溶质在反相色谱中分配系数取决于溶质的疏水性溶质的疏水性，疏水性越大，分配系数越大；疏水性越大，分配系数越大；n当固定相一定时，可通过调节流动相的组成调整当固定相一定时，可通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数；溶质的分配系数；n流动相的极性越大，溶质的分配系数越大，因此流动相的极性越大，溶质的分配系数越大，因此反相层析多采用反相层析多采用降低流动相极性的线性梯度洗脱降低流动相极性的线性梯度洗脱法。法。（3 3）常

55、用介质）常用介质n载体载体 硅胶、高分子聚合物微球硅胶、高分子聚合物微球n配基配基 丁烷基丁烷基(C4)、辛烷基、辛烷基(C8)、十八烷基、十八烷基(C18)或苯基或苯基n修饰方法修饰方法n通过硅烷化反应在硅胶表面键合非极性分子层制备。硅烷化反应式通过硅烷化反应在硅胶表面键合非极性分子层制备。硅烷化反应式为为n硅烷化试剂中的硅烷化试剂中的R1和和R1多为多为甲基甲基，R为为C4、C8、C18烷基或苯基，烷基或苯基，其中利用其中利用C18硅烷化试剂制 备 的 反 相 介 质 最 多硅烷化试剂制 备 的 反 相 介 质 最 多 ,通 称通 称 ODS (Octadecyl silica)，其次是，

56、其次是C8和和C4。n残留的硅羟基可采用反应活性高的三甲基氯硅烷覆盖残留的硅羟基可采用反应活性高的三甲基氯硅烷覆盖(capping),使使表面达到完全非极性。表面达到完全非极性。（4 4）特点）特点n反相介质性能稳定，分离效率高；反相介质性能稳定，分离效率高；n应用广泛，可用于分离蛋白质、肽、氨基酸、多糖、应用广泛，可用于分离蛋白质、肽、氨基酸、多糖、植物碱等，应用于科学研究、临床诊断、工业检测植物碱等，应用于科学研究、临床诊断、工业检测和环境保护等各个行业；和环境保护等各个行业；n作为产品纯化制备手段，多限于实验室规模的应用。作为产品纯化制备手段，多限于实验室规模的应用。八、流通八、流通色谱

57、色谱nFlow-through chromatography，FCn理解：理解：流通流通色谱色谱技术的原理及操作技术的原理及操作 n应用：应用：了解了解流通色谱流通色谱技术的应用范围及优缺点技术的应用范围及优缺点（1）定义）定义n流通色谱流通色谱指利用含有指利用含有对流孔对流孔( (convective pores)的的介质为固定相的液相色谱法介质为固定相的液相色谱法, ,其分离模式包括前其分离模式包括前述的各种吸附色谱述的各种吸附色谱,如离子交换色谱、疏水性相如离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、亲和色谱和反相色谱等。互作用色谱、亲和色谱和反相色谱等。流通色谱作为一种分离模式，可包括各种吸附色

58、谱，流通色谱作为一种分离模式，可包括各种吸附色谱，如如IEC、HIC、AFC和和RPLC传统色谱的缺陷传统色谱的缺陷n传统的吸附传统的吸附色谱介质孔径较小色谱介质孔径较小，一般在，一般在100 nm以下，以下，流体阻力大；流体阻力大；n通常的色谱操作压力下流体无法进入固定相介质的通常的色谱操作压力下流体无法进入固定相介质的孔内，孔内传质为扩散传质；孔内，孔内传质为扩散传质；n柱效随流速增大而迅速下降，动态吸附容量亦如此；柱效随流速增大而迅速下降，动态吸附容量亦如此；（2）介质结构）介质结构n穿透孔穿透孔(flow-through pores)（贯穿孔贯穿孔） 孔径在孔径在600800 nm,

59、孔内流孔内流动为动为对流对流形式；形式；n扩散孔扩散孔(diffusive pores) 孔径在孔径在50100 nm, 孔内传孔内传质为质为扩散传质扩散传质；（3）介质结构的特点）介质结构的特点n流通色谱介质穿透孔之间以扩散孔相连，保证了介流通色谱介质穿透孔之间以扩散孔相连，保证了介质大的质大的比表面积比表面积和和溶质吸附量溶质吸附量n扩散孔长度大大缩短，降低了扩散传质阻力；扩散孔长度大大缩短，降低了扩散传质阻力；n色谱操作线速度大于色谱操作线速度大于500 cm/h。柱效柱效n色谱柱效的普遍化公式为色谱柱效的普遍化公式为n在在u 很大时，很大时，n其中其中n因此因此CuBuAHETPepDudCCuHETP222pporepporeeduduDDpporepdCuudCHETPHETP仅是粒径的函数仅是粒径的函数,与与流速无关。说明流通色谱流速无关。说明流通色谱在高流速下操作而不影响在高流速下操作而不影响柱效。柱效。HETP理论理论板当量高度板当量高度（4）介质制备）介质制备nPOROS流通流通色谱色谱介质介质 首先合成微球，然后通过聚集形成聚集体，最终首先合成微球，然后通过聚集形成聚集体，最终经聚集体的再聚合形成所需粒径的分离介质经聚集体的再聚合形成所需粒径的分离介质n联合致孔法联合致孔法 通过固、液联合致孔方法合成双分