重离子辐照玉米的SSR分子标记分析

1、1试验材料 选取由zC6+离子束辐照处理的玉米自交系CSR24001-1,鲁9801、金象4C-1和郑58、478、308。1.1样品采集 供试材料选取籽粒饱满的玉米种子，用水浸泡3-5 h,蒸馏水冲洗，置铺于有蛙石的培养皿中，于25 0C培养箱暗培养，待幼苗长至5-6 d后剪取叶片迅速放入冰盒，以免水分散失。2.1技术路线 该实验选取田间经不同能量、不同通量和不同处理的zC6+离子束辐照处理和未辐射对照玉米种子实验室种植，选取幼嫩叶片为材料，进行玉米基因组DNA的提取，选用可扩增引物进行PCR扩增，通过SSR分子标记的分析研究辐照植株与未辐射对照植株之间的遗传变异并进行类群的划分，选出具有较

2、大差异的材料。2.2药品试剂及试验设备2.2.1药品试剂 本试验所用化学试剂均为分析纯:TaqDNA聚合酶，琼脂糖，dNTPs溟化乙锭，选用玉米通用SSR引物。2.2.2仪器设备高速低温离心机， PCR扩增仪电冰箱，水浴锅，电泳仪，凝胶成像系统。2.3。1基因组DNA的提取1 SDS快速提取法2 CTAB法2.3. 2DNA的检测用TU-1810紫外分光光度计和0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。2.4随机引物的筛选在一定条引物逐一扩增，扩增产物经聚丙烯酞胺凝胶电泳后，再经银染，观察结果，从中筛选出扩增条带数较多，扩增清楚的引物，用这些引物对供试材料再作进一步扩增。2.5 SSR反应体系的优化 SS

3、R体系的优化是以获得最佳的扩增能力SSR的扩增能力为尺度对模板DNA或其他因素进行调整。2.6 PCR扩增扩增条件及PCR所用的程序包括:变性、复性和扩增的温度、时间以及循环的次数。理论上扩增能够无限制地长期进行，但实际上受各种因素的制约。当循环次数少时扩增产物的量对于某种分析太少，当循环次数过多时，扩增的量不再增加。通常在30-45个循环。2.7扩增产物检测2.7.1胶的制备加5-7 u1扩增产物与2 u1溟酚称取定量的10 % PAGE用干净的玻璃棒搅拌均匀.2.7.2加样加5-7 u1扩增产物与2 u1溟酚蓝于封口膜上混合 2.7.3电泳接通电源，电压110 V，电泳1h2.7.4银染固

4、定:(1)电泳结束后，小心分开两块玻璃板(胶会紧贴在玻璃板上)，将凝胶置cm培养皿中，加入适量25%乙醇中，摇床固定5 min，此时胶己完全脱离玻璃板(2)水洗:将胶置于适量蒸馏水摇床漂洗1 min o(3)氧化:将胶置于适量1 % HNO:中摇床4-6 min(4)染色:将胶置于适量新配的2 % AgNO:中染色(5)显影:加入100 ml新配的显色液(3g NaC03容至100 ml中轻轻摇动至条带完全出现。(6)定影:将显出条带的胶置于适量10%乙酸中1酸，保存拍照进行条带分析。3数据分析用蒸馏水冲洗2-3次。20-30 min，用蒸馏水冲洗1次。 200 u1甲醛，10 u1硫代硫酸钠

5、定2min左右，用自来水冲洗残留乙醇，SSR扩增带型以0, 1统计，建立数据库。在相同迁移率位置上，有带的记为A，无带的记为B，统计每条引物扩增出的总带数和其中的多态性带数。采用NTSYS-pcversion-2.0统计软件，按照NEh:法计算遗传距离，并利用UPGMA法进行聚类分析，绘制树状图。4结果与分析4.1提取DNA的检测基因组DNA的有效提取是进行任何DNA下游工作的前提和基础，有效提取指的是得到的基因组DNA(总DNA)有足够的量，尽可能少的降解和不含有影响下一步酶反应的杂质。 DNA在260 nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280 nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230 n

6、m处。因此，可以用260 nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50 ug/ml双链DNA。如用1 cm光径，用HZO稀释DNA样品n倍并以HZO为空白对照，根据此时读出的OD26。值即可计算出样品稀释前的浓度:DNA ( ng/ml卜50 X OD26。读数X稀释倍数/1000 o DNA纯品的OD26o/ ODZs。为1.8，故根据OD26o/ ODZs。的值可以估计DNA的纯度。若比值大于1.8说明含有DNA纯度高，比值较低说明有残余蛋白质存在 4.1.1 DNA浓度检测 本试验所采用的CTAB法和SDS法。结果表明:2种方法均可从样本中提取到一定纯度的DNAo SDS法提

7、出的DNA的OD26。是 0.083 , ODZg。是0.062, OD26o/ODZgo是1.34，此法操作简单，过程简便，所以损失的DNA最少，但也因为纯化步骤较少对应的杂质含量也较高，用CTAB法提取的总DNA的OD26。是0.074, ODZg。是0.04,OD26o/ODZs。是1.875, RNA和蛋白质含量也很低，DNA质量合乎要求。有研究认为，DNA中含有少量的RNA和蛋白质对扩增影响不大。所以我们采用此方法用于本试验SSR研究所需DNA样品的提取。4.1.2 DNA电泳检测 将提取DNA用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测提取效果。图谱显示，电泳谱带清晰，无明显拖尾现象，提取的DN

8、A纯度均一，为下一步扩增提供了有力保障。 由下图可知，用CTAB法所提取的玉米DNA带型整齐、清晰、且无降解，基本没有RNA和其他杂质，完全符合该试验的要求。4.2.5 Mg2+浓度对稳定性的影响M gz+作为维持Taq酶活性的重要辅助因子间接影响扩增效果。当Mgz+用量增加 根据试验结果统计，18对SSR引物共检测到56个等位位点的变异，每对引物检测等位基因位点2-6个，平均3.11个。其中，引物umc 1741 k7扩增出的多态性最高，检测出6个等位基因变异;bnlg 1792k8检出5个;bn1g1754w3检出4个;bn1g1450k2,bn1g1702k1、umc2084w2、bn1

9、g2291k4, phi080k15、bn1g439w1、phi065k9、umc2163k5、umc1705w1, bn1g125k1, bn1g439w1, phi0724k4检出3个;bnlg 1940k9 , umc21 OSk3 ,phi072k4, bn1g161k8检出2个。4.3.3聚类结果分析 以SSR遗传相似系数为原始数据，按UPGMA方法对37份材料进行聚类分析，共分为四类:F30与其它材料相比具有较大的差异，故单独成为一类;E10 E20E30 E40 E50 Eck为一类群。在这一组中，E10 E30为一亚类，说明在自交系308中，辐射剂量为IOGy, 30Gy的处理

10、遗传相似系数很近，在遗传上具有很大的同源性;辐照剂量为40 Gy的308与对照处理为同一亚类;E20 E50同理。A10 A15A20 A30 Ack, C30 D20 D25 D30亚类，B25 Dck, F10 F20 F50 Fck与C20 C25 Cck, D10 D15 F40三个亚群组成了另一类群;A25 C10 C15与B10B15 B20 Bck, B30 CS两个亚群组成了另一类群(图2)05.3重离子辐照玉米的SSR分析 一般SSR引物在每一个自交系中只能检测出1个等位基因变异94。但是由于材料纯合度不高、DNA污染或基因组内存在同源位点等原因，有时也会检测出1个以上等位基因变异。如属前两种情况，只会偶尔则检测出一个以上的等位基因变异，如引物umc 1741 k7在F