cDNA差示分析法

1、分子生物学分子生物学大连大学生物工程学院大连大学生物工程学院 迟彦迟彦 2SNP概述概述单核苷酸多态性单核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphism ,SNP) ： 基因组序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态基因组序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。性。 3单体型（单体型（Haplotype)： 位于染色体上某一区域的一组相关联的位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位等位位点被称作单倍型。点被称作单倍型。相邻相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体信息传递给后的等位位点倾向于以一个整体信息传递给后代。代。 4SNP分类分类基因编码区基因编码区SN

2、P（cSNP） 同义同义cSNP 非同义非同义cSNP基因调控区基因调控区SNP （pSNP）基因间随机非编码区（基因间随机非编码区（rSNP） 5同义同义cSNPSNP所导致的编码序列改变并不影响其所翻译的蛋所导致的编码序列改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基和未突变碱基的含义白质的氨基酸序列，突变碱基和未突变碱基的含义相同。相同。 6非同义非同义cSNP碱基序列的改变可以使其为蓝本翻译的蛋白质序列碱基序列的改变可以使其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响蛋白质的功能。发生改变，从而影响蛋白质的功能。 7SNP检测技术检测技术基因芯片基因芯片Taqman 技术技术分析信标分

3、析信标焦磷酸测序焦磷酸测序 8Taqman 技术原理技术原理探针设计上，利用荧光共振能量转换探针设计上，利用荧光共振能量转换 （FRET）技）技术，探针术，探针5和和3端分别用特殊的染料标记，称为供体端分别用特殊的染料标记，称为供体-受体染料对或引爆受体染料对或引爆-猝灭猝灭 染料对。染料对。正常情况下，由于探针正常情况下，由于探针5端荧光基团和端荧光基团和3端猝灭基团端猝灭基团紧邻在一起，供体所发荧光由于其光谱在空间上接紧邻在一起，供体所发荧光由于其光谱在空间上接近受体染料而被猝灭，只有当两者分离时才能检测近受体染料而被猝灭，只有当两者分离时才能检测到供体所发出的荧光。到供体所发出的荧光。

4、9 10Taqman 技术技术该技术的基本原理是利用该技术的基本原理是利用Taq酶的酶的5核酸外切酶活性核酸外切酶活性,在这在这个个PCR反应中除了两个传统反应中除了两个传统的的PCR引物引物P1 、P2 外外,还有还有第三个引物第三个引物P3 即等位特异性即等位特异性Taqman探针探针,含有待检测的含有待检测的SNP位点位点,特异结合在特异结合在P1结合结合位点的下游。位点的下游。P3探针的探针的5端端和和3端分别标有荧光基团和猝端分别标有荧光基团和猝灭基团灭基团,因因P3的的3端被猝灭基端被猝灭基团封阻而不能以自身为引物团封阻而不能以自身为引物进行扩增。进行扩增。 11Taqman 技术

5、技术在在PCR反应中反应中, Taq酶以酶以P1为引物合成新的为引物合成新的DNA链链,随着反应的进行随着反应的进行Taq酶酶接触到接触到P3并激发其并激发其53外切酶活性外切酶活性,使使P3 从从5端端开始降解开始降解,最后最后DNA链得链得以延伸而以延伸而P3探针上的荧探针上的荧光基团和猝灭基团由于不光基团和猝灭基团由于不再在一个分子上了再在一个分子上了,荧光荧光基团释放荧光信号。基团释放荧光信号。 12分子信标技术分子信标技术分子信标由称为分子信标由称为“茎茎”(stem)和和“环环”(loop) 的两部的两部分构成分构成,茎部分是由寡核苷酸探针两端互补的序列形茎部分是由寡核苷酸探针两端

6、互补的序列形成的成的,又可称之为手臂又可称之为手臂,环则是探针的中间部分环则是探针的中间部分,其序其序列和待扩增的目的片段互补并含有要检测的列和待扩增的目的片段互补并含有要检测的SNP 位位点。点。 13分子信标技术分子信标技术在手臂的两个末端分别在手臂的两个末端分别通过共价的方式结合上通过共价的方式结合上一个荧光分子和一个荧一个荧光分子和一个荧光猝灭基团光猝灭基团,这样当分子这样当分子信标游离在溶液时信标游离在溶液时,它以它以发卡结构存在发卡结构存在,荧光分子荧光分子与猝灭基团在空间距离与猝灭基团在空间距离上挨在一起上挨在一起,十分接近十分接近,荧荧光分子被猝灭光分子被猝灭,此时溶液此时溶液

7、无荧光信号。无荧光信号。 14相反当分子信标和其完全相反当分子信标和其完全互补的目的片段杂交时互补的目的片段杂交时,其发卡结构被拉开而使荧其发卡结构被拉开而使荧光分子和荧光猝灭基团在光分子和荧光猝灭基团在空间上分开从而发射出荧空间上分开从而发射出荧光光,其信号可提高其信号可提高900倍。倍。 15 16焦磷酸测序法焦磷酸测序法核心：核心： 由四种酶催化的同一反应体系中的酶级联反应由四种酶催化的同一反应体系中的酶级联反应四种酶分别为四种酶分别为: DNA 聚合酶聚合酶(DNA poly merase) ATP 硫酸化酶硫酸化酶(ATP sulfurylase) 荧光素酶荧光素酶(lucifera

8、se) 双磷酸酶双磷酸酶(apyrase) 反应底物反应底物 5- 磷酰硫酸磷酰硫酸(adenosine 5-phosphosulfate ,APS) 、荧光、荧光素素(luciferin) , 17具体原理具体原理在每一轮测序反应中，只加入一种在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。）。PPi可最终转化为可见光信号，并由可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷为一

9、个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续，继续DNA链的合成。链的合成。 18APS荧光荧光素素氧化型荧光素氧化型荧光素 19第第1步：步： 1个特异性的测序引物和单链个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，模板结合，然后加入酶混合物然后加入酶混合物(包括包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和和Apyrase)和底物混合物和底物混合物(包括包括APS和和Luciferin)。 20第第2步：向反应体系中加入步：向反应体系中加入1种种dNTP，如果它刚好，如果它刚好能和能和DN

10、A模板的下一个碱基配对，则会在模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚聚合酶的作用下，添加到测序引物的合酶的作用下，添加到测序引物的3末端，同时释末端，同时释放出一个分子的焦磷酸放出一个分子的焦磷酸(PPi)。 21第第3步：在步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以可以和和APS结合形成结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成；在荧光素酶的催化下，生成的的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比

11、。的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。 22第第4步：步： 反应体系中剩反应体系中剩余的余的dNTP和残留和残留的少量的少量ATP在在Apyrase的作用下的作用下发生降解。发生降解。 23第第5步：步： 加入另一种加入另一种dNTP，使第，使第24步反应重复进行，根据获步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。序列信息。 24 25SNP应用应用人类基因单体型图的绘制人类基因单体型图的绘制SNP与疾病易感基因的相关性分析与疾病易感基因的相关性分析指导用药与药物设计指导用药与药物设计 26 27cDNA差示分析法克隆基因差示分析法克隆基因-

12、RDA代表性差异分析代表性差异分析 representational difference analysis RDA 28RDARDA法充分发挥了法充分发挥了PCR以指数形式扩增双链以指数形式扩增双链DNA模模板，而以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低板，而以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特两端接头等方法，特异扩增了目的基因片段。异扩增了目的基因片段。 29RDA因为试验对象（因为试验对象（Tester）和供试探针（）和供试探针（Driver）在接）在接受差示分析前均经一个受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平碱基切

13、割酶处理，形成平均长度均长度256bp的代表群（的代表群（representation），保证绝），保证绝大部分遗传信息能被扩增。大部分遗传信息能被扩增。 每次每次T减减D反应中两者反应中两者物质的量比就要求达到物质的量比就要求达到1：100或更高，经过或更高，经过2-3次重次重复，复，T群体非特异性序列几乎没有偶然逃脱的可能群体非特异性序列几乎没有偶然逃脱的可能性。性。 30 31Gateway大规模克隆技术大规模克隆技术 32 33 34 35图位克隆图位克隆一、通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个一、通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的染

14、色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或或RAPD分子标记。分子标记。二、通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶二、通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记。通过染色体步移技术将位于这两个标标记。通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来。记之间的基因片段克隆并分离出来。 三、根据基因功能互作原理鉴定目的基因。三、根据基因功能互作原理鉴定目的基因。 36 37双向电泳双向电泳等电聚焦等电聚焦 等电点等电点SDS-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 分子质量分子质量 38等电聚焦等电

15、聚焦蛋白质在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳蛋白质在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性定的线性pH梯度中电泳。蛋白质分子在偏离其等电梯度中电泳。蛋白质分子在偏离其等电点的点的pH条件下带有电荷，因此可以在电场中移动；条件下带有电荷，因此可以在电场中移动；当蛋白质迁移至其等电点位置时，其净电荷数为零，当蛋白质迁移至其等电点位置时，其净电荷数为零，在电场中不移动，据此将蛋白质分离。在电场中不移动，据此将蛋白质分离。 39蛋白质的质谱分析技术蛋白质的质谱分析技术基质辅助激光解吸附电离基质辅助激光解吸附电离-飞行质谱仪飞行质谱仪 MALDI-TOF电喷雾质谱电喷雾质谱ESI-MS 40从

16、从2D胶中分离得到的或其他来源的蛋白质酶解成小胶中分离得到的或其他来源的蛋白质酶解成小肽后与基质混合，将样品混合物点到金属靶表面上肽后与基质混合，将样品混合物点到金属靶表面上并使之干燥结晶，然后用激光轰击，将呈离子化气并使之干燥结晶，然后用激光轰击，将呈离子化气体的待分析物从靶表面喷射出去。体的待分析物从靶表面喷射出去。离子化的气体中每个分子带有一个或更多的正电荷，离子化的气体中每个分子带有一个或更多的正电荷，这些气体肽段在电场中被加速后到达检测器的时间这些气体肽段在电场中被加速后到达检测器的时间由肽段的质量和其所带电荷数的比值由肽段的质量和其所带电荷数的比值(m /z)决定。决定。 41生物

17、质谱的一般流程生物质谱的一般流程蛋白酶解成肽段蛋白酶解成肽段肽段分离肽段分离离子进入质谱，得到质谱图离子进入质谱，得到质谱图用计算机软件将质谱图与蛋白数据库进行比对，从用计算机软件将质谱图与蛋白数据库进行比对，从而鉴定出蛋白。而鉴定出蛋白。 42 43 44基因表达系列分析技术基因表达系列分析技术Serial analysis of gene expression, SAGE 是一种以是一种以DNA序列测定为基础定量分析全基因组表序列测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术，能够直接读出任何一种细胞类型或达模式的技术，能够直接读出任何一种细胞类型或组织的基因表达信息。组织的基因表达信息。在转录

18、组水平上，任何长度超过在转录组水平上，任何长度超过9-10个碱基的核苷酸个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物。片段都可能代表一种特异性的转录产物。Long SAGE Short SAGE 45因此，用特定限制性核酸内切酶分离转录产物中具因此，用特定限制性核酸内切酶分离转录产物中具有基因特异性的有基因特异性的9-10个碱基的核苷酸序列并制成标个碱基的核苷酸序列并制成标签。签。将这些序列标签连接、克隆、测序后，根据其占总将这些序列标签连接、克隆、测序后，根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。 46原位杂交技术原位杂交技术

19、in situ hybridization, ISH是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位或相对定量研究的一种手段。行定位或相对定量研究的一种手段。分为分为RNA原为杂交和染色体原位杂交原为杂交和染色体原位杂交 47RNA原位杂交原位杂交用放射性或非放射性（地高辛、生物素等）标记的用放射性或非放射性（地高辛、生物素等）标记的特异性探针与特异性探针与被固定的组织切片反应被固定的组织切片反应，若细胞中存，若细胞中存在与探针互补的在与探针互补的mRNA 分子

20、，两者杂交产生双链分子，两者杂交产生双链RNA，就可通过检测放射性标记或酶促免疫反应显，就可通过检测放射性标记或酶促免疫反应显色，对该基因的表达产物在细胞水平上做出定性定色，对该基因的表达产物在细胞水平上做出定性定量分析。量分析。 48荧光原位杂交（荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH)FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如如果被检测的果被检测的染色体或染色体或DNA纤维切片纤维切片上的靶

21、上的靶DNA与所与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火退火-复复性，即可形成靶性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，来确定该异亲和素之间的免疫化学反应，来确定该DNA序列序列在染色体上的位置。在染色体上的位置。 49 50基因定点突变技术基因定点突变技术重叠延伸介导的定点诱变重叠延伸介导的定点诱变大引物诱变法大引物诱变法 51

22、52 53酵母单杂交系统酵母单杂交系统是是20世纪世纪90年代中期发展起来的新技术，常用于研年代中期发展起来的新技术，常用于研究究DNA-蛋白质之间的相互作用。其特点是可识别蛋白质之间的相互作用。其特点是可识别稳定结合于稳定结合于DNA上的蛋白质，可在酵母细胞内研究上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核生物中真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过蛋白质之间的相互作用，并通过筛选筛选DNA文库直接获得与靶序列相互作用蛋白的编文库直接获得与靶序列相互作用蛋白的编码基因。码基因。此外，该体系也是分析鉴定细胞中转录调控因子与此外，该体系也是分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作用的有效方法

23、。顺式作用元件相互作用的有效方法。 54酵母单杂交系统（酵母单杂交系统（yeast one-hybrid system)将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子(minimal promoter， Pmin)上游，把报告基因连接到上游，把报告基因连接到Pmin下游。然后，下游。然后，将编码待检测转录因子将编码待检测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin启动子，使

24、报告基启动子，使报告基因得到表达。因得到表达。 55 56酵母双杂交系统（酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system)原理：原理：真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的，即能上独立的结构域组成的，即 DNA结合域（结合域（BD）和转录激活域（和转录激活域（AD）。）。单独地单独地BD能与特定基因地启动区结合，但不能激活能与特定基因地启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录因子的基因的转录，而由不同转录因子的BD和和AD所形成所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。

25、 57具体实验过程：具体实验过程：1. 实验中，首先运用基因重组技术把编码已知蛋白的实验中，首先运用基因重组技术把编码已知蛋白的DNA序序列连接到带有酵母转录因子列连接到带有酵母转录因子BD编码区的表达载体上。编码区的表达载体上。2. 导入酵母细胞中使之表达带有导入酵母细胞中使之表达带有BD的杂蛋白，与报告基因上的杂蛋白，与报告基因上游的启动调控区相结合，准备作为游的启动调控区相结合，准备作为“诱饵诱饵”捕获与已知蛋捕获与已知蛋白相互作用的基因产物。白相互作用的基因产物。3. 此时，若将此时，若将AD的的DNA与待筛选的与待筛选的cDNA文库中不同插入片文库中不同插入片段相连接，获得段相连接，

26、获得“猎物猎物”载体，转化含有载体，转化含有“诱饵诱饵”的酵母的酵母细胞细胞 584. 一旦酵母细胞中表达的一旦酵母细胞中表达的“诱饵诱饵”蛋白与蛋白与“猎物猎物”载体中表达的某个蛋白质发生相互作用，不同转载体中表达的某个蛋白质发生相互作用，不同转录调控因子的录调控因子的AD和和BD结构域就会被牵引靠拢，激结构域就会被牵引靠拢，激活报告基因表达。活报告基因表达。5. 分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所需要的分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所需要的“猎物猎物”载体，获得与已知蛋白相互作用的新基载体，获得与已知蛋白相互作用的新基因因 59 60AD:Activation domain DNA-

27、BD:Binding domain 61 62RNAi（RNA interference, RNA)技术技术利用双链小利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。失的表型。这些小的双链这些小的双链RNA称为称为siRNA （Small /short interfering RNA ，siRNA） 。 63发现发现RNA干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类

28、的几乎所有的真核生物中细胞。又先后发现小鼠早期几乎所有的真核生物中细胞。又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在干扰现象胚胎中和大肠杆菌中也存在干扰现象 64siRNA在细胞内在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶再与体内一些酶(包括包括内切酶、外切酶、解旋酶等内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成结合形成RNA诱导的诱导的沉默复合物沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC - RNA-induced silencing complex. （RNA诱导的

29、沉默复合物）诱导的沉默复合物） 65 66 RISC与目的与目的mRNA的同源区进行特异性结合，的同源区进行特异性结合，RISC具有具有核酸酶核酸酶的功能，在结合部位切割的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些胞针对这些mRNA的降解反应。的降解反应。 67siRNA不仅能引导不仅能引导RISC切割同源单链切割同源单链mRNA，而且，而且可作为引物与靶可作为引物与靶RNA结合并在结合并在RNA聚合酶聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更作用下合成更多新的多新的dsRNA，新合成的，新合成的dsRNA再由再由Dicer切割产切割产生大量的次级生大量的次级siRNA，从而使，从而使RNAi的作用进一步放的作用进一步放大，最终将靶大，最终将靶mRNA完全降解完全降解。 68 69原理：在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的原理：在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DN