第一章酶工程绪论.

1、酶酶 工工 程程第一节第一节 酶的基本概念及催化特性酶的基本概念及催化特性第三节第三节 酶的分类与命名酶的分类与命名第二节第二节 酶的动力学酶的动力学第一章第一章 绪论绪论第五节第五节 酶工程简介酶工程简介第四节第四节 酶的生产方法酶的生产方法第一节第一节 酶的基本概念及催化特性酶的基本概念及催化特性 一、酶是一种生物催化剂一、酶是一种生物催化剂 二、酶的作用特点二、酶的作用特点 三、酶的活力测定三、酶的活力测定 一、酶是一种生物催化剂一、酶是一种生物催化剂 酶：是一类由酶：是一类由活细胞活细胞产生的、具有产生的、具有生物催化活生物催化活性性和和高度专一性高度专一性的生物大分子。的生物大分子。

2、酶的重要性：新陈代谢是生命活动的基础，而构成酶的重要性：新陈代谢是生命活动的基础，而构成新陈代谢的许多复杂而有规律的物质变化和能量变新陈代谢的许多复杂而有规律的物质变化和能量变化，都是在酶催化下进行的。化，都是在酶催化下进行的。 二、酶的作用特点二、酶的作用特点酶酶具有一般催化剂的特征具有一般催化剂的特征：1.只能进行热力学上允许进行的反应；只能进行热力学上允许进行的反应；2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；衡点；3.通过降低活化能加快化学反应速度。通过降低活化能加快化学反应速度。4.反应前后质量和性质不发生变化。反应前后质

3、量和性质不发生变化。 二、酶的作用特点二、酶的作用特点2 2、极高的催化效率、极高的催化效率1 1、专一性强、专一性强3 3、反应条件温和、反应条件温和酶的催化效率大约是无机催化剂的酶的催化效率大约是无机催化剂的1071013倍倍至今发现的酶有至今发现的酶有4000多种多种,每种酶只能催化每种酶只能催化一种或一类化学反应一种或一类化学反应常温、常压、常温、常压、pH近乎中性近乎中性与非酶催化剂的主要不同点与非酶催化剂的主要不同点根据专一性的不同，分为：根据专一性的不同，分为：绝对专一性绝对专一性相对专一性相对专一性立体异构专一性立体异构专一性结构专一性结构专一性酶作用的酶作用的专一性专一性键专

4、一性键专一性 基团专一性基团专一性绝对专一性：酶只作用于特定结构的底物，进行绝对专一性：酶只作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物一种专一的反应，生成一种特定结构的产物 。如：如： 脲酶：脲酶：H2NCNH2 + H2OO2NH3 + CO2相对专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底相对专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。物。RCOO- +R OH + H+酯酶酯酶：RCOR + H2OOOCH2OHOHOHOH15-葡萄糖葡萄糖苷酶苷酶O R+H2OOCH2OHOHOHOHOH15+ ROH 三、酶活力的测定三、酶活力的测定酶活力指酶在一定条件下催化某一化

5、学反应的速率。酶活力指酶在一定条件下催化某一化学反应的速率。酶是否存在、含量多少酶是否存在、含量多少不直接用重量不直接用重量或体积表示，用酶活力表示。或体积表示，用酶活力表示。规定：规定：1个酶活力单位（个酶活力单位（IU），是指在最适反应条），是指在最适反应条件下，在件下，在1min内能转换内能转换1mol底物的酶量或是转化底物的酶量或是转化底物中底物中1mol有关基团的酶量。有关基团的酶量。最适反应条件：最适温度最适反应条件：最适温度、pH及底物浓及底物浓度度等等均采用最适条件。均采用最适条件。Kat：在最适条件下，每秒钟能使：在最适条件下，每秒钟能使1mol底物转化所底物转化所需的酶量。

6、需的酶量。1kat=6107IU比活力（比活力（specific catalytic activity）：酶含量大小，）：酶含量大小，即每即每mg蛋白所具有的酶活力单位。蛋白所具有的酶活力单位。U/mg蛋白质来表蛋白质来表示。示。也有时用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力也有时用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位来表示（单位单位来表示（单位/克或单位克或单位/mL）。）。对同一种酶来说，比活力越高，表示酶越纯。对同一种酶来说，比活力越高，表示酶越纯。 酶活力的测定方法酶活力的测定方法（1）分光光度法：）分光光度法：生成有色物质或产物有紫外吸收能力。生成有色物质或产物有紫外吸收能力。

7、（2）测压法：）测压法：有气体产生。有气体产生。（3）滴定法：）滴定法：产物有酸或碱生产。产物有酸或碱生产。（4）荧光法：）荧光法：产物中有荧光物质产生或产物可与荧光试产物中有荧光物质产生或产物可与荧光试剂反应。剂反应。（5）旋光法：）旋光法：产物中有旋光物质。产物中有旋光物质。3.4 酶促反应动力学 酶的动力学酶的动力学是研究酶促反应速度及其影响是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。酶促反应的影响因素主要包括因素的科学。酶促反应的影响因素主要包括底物的浓度底物的浓度、酶的浓度酶的浓度、 pHpH、温度温度、抑制剂抑制剂和和激活剂激活剂等。等。 第二节第二节 酶动力学酶动力学一、酶与底物浓度一

8、、酶与底物浓度 为解释酶被底物饱和现象，为解释酶被底物饱和现象，Michaelis和和Menten做了大量的定量研究，积累了足够的实验数据，做了大量的定量研究，积累了足够的实验数据，提出了酶促反应的动力学方程：提出了酶促反应的动力学方程：米氏方程米氏方程1、从米氏方程可知：从米氏方程可知： 当底物浓度很低时当底物浓度很低时 S KS KS Km m ，此时此时VVVVmaxmax ，反应速度达最大反应速度达最大速度，底物浓度再增高也不影响反应速度，底物浓度再增高也不影响反应速度。速度。2.米氏常数米氏常数（1 1）物理意义物理意义： KmKm值等于酶反应速度为最大速度一半时的底物浓度。值等于酶

9、反应速度为最大速度一半时的底物浓度。（2 2）Km Km 值值愈大愈大，酶与底物的，酶与底物的亲和力愈小亲和力愈小；KmKm值值愈小愈小，酶，酶与底物与底物亲和力愈大亲和力愈大。酶与底物亲和力大，表示不需要很高。酶与底物亲和力大，表示不需要很高的底物浓度，便可容易地达到最大反应速度。的底物浓度，便可容易地达到最大反应速度。（3 3）Km Km 值是值是酶的特征性常数酶的特征性常数，只与酶的性质，酶所催化，只与酶的性质，酶所催化的底物和酶促反应条件的底物和酶促反应条件( (如温度、如温度、pHpH、有无抑制剂等有无抑制剂等) )有关，有关，与酶的浓度无关。酶的种类不同，与酶的浓度无关。酶的种类不

10、同，KmKm值不同，同一种酶与值不同，同一种酶与不同底物作用时，不同底物作用时，Km Km 值也不同。值也不同。各种酶的各种酶的 Km Km 值范围很广，值范围很广，大致在大致在 1010-1-11010-6-6 M M 之间。之间。3. Km3. Km在实际应用中的重要意义在实际应用中的重要意义（1 1）鉴定酶鉴定酶：通过测定可以鉴别不同来源或相：通过测定可以鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段、不同生理状态下催化同来源但在不同发育阶段、不同生理状态下催化相同反应的酶是否属于同一种酶。相同反应的酶是否属于同一种酶。（2 2）判断酶的最佳底物判断酶的最佳底物：如果一种酶可作用于多个：如果一种

11、酶可作用于多个底物底物, ,就有几个就有几个KmKm值，其中值，其中KmKm最小对应的底物就是酶最小对应的底物就是酶的天然底物的天然底物。如蔗糖酶既可催化蔗糖水解如蔗糖酶既可催化蔗糖水解(Km=28mmol/L),(Km=28mmol/L),也可催也可催化棉子糖水解化棉子糖水解(Km=350mmol/L),(Km=350mmol/L),两者相比，蔗糖为该两者相比，蔗糖为该酶的天然底物。酶的天然底物。（4 4）判断反应方向或趋势判断反应方向或趋势：催化正逆反应的：催化正逆反应的酶，其正逆两向的反应的酶，其正逆两向的反应的KmKm不同，如果正逆不同，如果正逆反应的底物浓度相当，则反应趋向于反应的底

12、物浓度相当，则反应趋向于KmKm小对小对应底物的反应方向。应底物的反应方向。（3 3）计算一定速度下的底物浓度计算一定速度下的底物浓度：如某一反应：如某一反应要求的反应速度达到最大反应速度的要求的反应速度达到最大反应速度的99%99%，则，则S=99KmS=99Km1. 1. 酶浓度的影响酶浓度的影响在一定温度和在一定温度和pHpH下，下，当反应系统中底物的浓当反应系统中底物的浓度足够大时，酶促反应度足够大时，酶促反应速度与酶浓度成正比，速度与酶浓度成正比，即即=kEkE 。二、酶浓度、温度、二、酶浓度、温度、pH的影响的影响 2. 2. 温度的影响温度的影响在一定范围内，在一定范围内，反应速

13、率随温度升反应速率随温度升高而加快。温度超高而加快。温度超过一定范围后，酶过一定范围后，酶蛋白受热变性，反蛋白受热变性，反应速率反而随温度应速率反而随温度上升而减慢。上升而减慢。 3. pH3. pH的影响（对酶影响显著）的影响（对酶影响显著）1 1、 激激活活剂剂三、激活剂与抑制剂的影响三、激活剂与抑制剂的影响 激活剂激活剂必须激活剂 凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为称为酶的抑制剂酶的抑制剂(inhibitor)(inhibitor)。使酶变性失活使酶变性失活( (称为称为酶的钝化酶的钝化) )的因素如强酸、强碱等，不属于抑制剂。的因素

14、如强酸、强碱等，不属于抑制剂。 通常通常抑制作用抑制作用分为分为可逆可逆抑制和抑制和不可逆不可逆抑制两类。抑制两类。 2 2、抑制剂、抑制剂（1 1）不可逆抑制）不可逆抑制 不可逆性抑制作用的抑制剂，通常以不可逆性抑制作用的抑制剂，通常以共价共价键键方式与酶的必需基团进行不可逆结合而使方式与酶的必需基团进行不可逆结合而使酶丧失活性。按其作用特点，又分酶丧失活性。按其作用特点，又分专一性专一性及及非专一性非专一性两种。两种。 抑制剂与酶以抑制剂与酶以非共价键非共价键结合，在用透析结合，在用透析等物理方法除去抑制剂后，酶的活性能恢等物理方法除去抑制剂后，酶的活性能恢复，即抑制剂与酶的结合是可逆的。

15、复，即抑制剂与酶的结合是可逆的。（2 2）可逆性抑制）可逆性抑制a.竞争性抑制竞争性抑制特点：特点： 抑制剂抑制剂I I与底物与底物S S在化学结构上在化学结构上相似，能与相似，能与底物底物S S竞争酶竞争酶E E分子活性中心的分子活性中心的结合基团结合基团. . 例如，丙二酸、苹果酸及草酰乙酸皆和琥珀酸例如，丙二酸、苹果酸及草酰乙酸皆和琥珀酸的结构相似，是的结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。 抑制程度取决于抑制剂与底物的抑制程度取决于抑制剂与底物的浓度比、浓度比、ESES和和EIEI的相对稳定性；的相对稳定性； 加大底物浓度，可使抑制作用减弱甚至消除。加大底

16、物浓度，可使抑制作用减弱甚至消除。 磺胺药物的抑菌作用磺胺药物的抑菌作用b.非竞争性抑制非竞争性抑制特点：特点： I I和和S S在结构上在结构上一般无相似之处，一般无相似之处，I I常与酶分常与酶分子上结合基团以外的化学基团结合，这种结合子上结合基团以外的化学基团结合，这种结合并不影响底物和酶的结合，增加底物浓度并不并不影响底物和酶的结合，增加底物浓度并不能减少能减少I I对酶的抑制。对酶的抑制。 非竞争性抑制剂的非竞争性抑制剂的双倒数曲线双倒数曲线：有非竞争性抑制剂：有非竞争性抑制剂存在的曲线与无抑制剂的曲线相交于横坐标存在的曲线与无抑制剂的曲线相交于横坐标 -1/Km-1/Km处，处，但

17、纵坐标的但纵坐标的截距，截距，因竞争性抑制存在变大，说明该抑因竞争性抑制存在变大，说明该抑制作用，并不影响酶促反应的制作用，并不影响酶促反应的KmKm值，而使值，而使VmaxVmax值变小，值变小，如下图所示：如下图所示：非竞争性抑制非竞争性抑制ViVmaxS( 1+ ) IKiKm+( )S1Vi （1+ ）IKi（ ）1VmaxKmVmax1S 第三节第三节 酶的组成、分类与命名酶的组成、分类与命名酶酶蛋白类酶蛋白类酶核酸类酶核酸类酶催化其他分子进行反应催化其他分子进行反应可催化酶分子本身，可催化酶分子本身，也可催化其他分子进行反应也可催化其他分子进行反应分子内催化分子内催化R酶酶分子间催

18、化分子间催化R酶酶氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶（连接酶）异构酶、合成酶（连接酶）自我剪切酶、自我剪接酶自我剪切酶、自我剪接酶RNA剪切酶、剪切酶、DNA剪切酶、多肽剪切酶、剪切酶、多肽剪切酶、多糖剪接酶、氨基酸酯剪接酶、多功能酶多糖剪接酶、氨基酸酯剪接酶、多功能酶1、分子组成、分子组成单纯蛋白酶单纯蛋白酶结合蛋白酶结合蛋白酶酶蛋白酶蛋白辅因子辅因子辅酶辅酶辅基辅基活性只取决于其蛋白质结构，活性只取决于其蛋白质结构，酶只由氨基酸组成，不含其酶只由氨基酸组成，不含其它成分。它成分。 除了蛋白质组分外，除了蛋白质组分外，还含对热稳定的非蛋还含

19、对热稳定的非蛋白小分子物质。白小分子物质。 酶蛋白和辅助因子结合后所形成的复合物称为全酶。酶蛋白和辅助因子结合后所形成的复合物称为全酶。全酶可以表示如下：全酶可以表示如下：全酶全酶= =酶蛋白酶蛋白 + + 辅助因子辅助因子 2 2、酶的命名、酶的命名 酶的命名通常有两种方法，即酶的命名通常有两种方法，即习惯命名法习惯命名法和和系统系统命名法。命名法。 （1 1）习惯命名法）习惯命名法 19611961年以前酶的命名都是采用习惯命名法，其依据的原则年以前酶的命名都是采用习惯命名法，其依据的原则主要有：主要有：a.a.根据酶所作用的底物命名。根据酶所作用的底物命名。 如催化水解淀粉的酶叫淀如催化

20、水解淀粉的酶叫淀粉酶，催化水解蛋白质的酶叫蛋白酶。粉酶，催化水解蛋白质的酶叫蛋白酶。b.b.根据催化反应的性质及类型命名。根据催化反应的性质及类型命名。 如氧化酶、转如氧化酶、转移酶、水解酶等。移酶、水解酶等。c.c.依酶的来源、作用条件等命名。依酶的来源、作用条件等命名。 如细菌淀粉酶、如细菌淀粉酶、胃蛋白酶酶等。胃蛋白酶酶等。 （2）国际系统命名法国际系统命名法明确标明酶的底物及催化反应的类型。明确标明酶的底物及催化反应的类型。例如例如乳酸脱氢酶的反应为乳酸脱氢酶的反应为：L-L-乳酸乳酸 + + NADNAD+ += =丙酮酸丙酮酸 + + NADH + HNADH + H+ + 这个反

21、应的底物是这个反应的底物是L-L-乳酸和乳酸和NADNAD+ +，类型是氧化还类型是氧化还原反应。因此这个酶的系统名称为：原反应。因此这个酶的系统名称为：L-L-乳酸：乳酸：NADNAD+ +氧氧化还原酶。化还原酶。 3 3、国际系统分类法及编号、国际系统分类法及编号 国际系统分类法中的分类原则是：国际系统分类法中的分类原则是： 根据酶所催化反应的性质，把酶分为六大类，分别用根据酶所催化反应的性质，把酶分为六大类，分别用1 1、2 2、3 3、4 4、5 5、6 6的编号来表示（如表的编号来表示（如表1-11-1）；）； 根据底物中被作用的基团或键的特点再将每一大类分为根据底物中被作用的基团或

22、键的特点再将每一大类分为若干亚类；若干亚类； 每一亚类中再分为若干小类；每一亚类中再分为若干小类； 每一小类中包含若干个具体的酶。每一小类中包含若干个具体的酶。系统编号由四个数字组成，数字之间系统编号由四个数字组成，数字之间用用“.”隔开隔开,编号之前往往加注编号之前往往加注EC。表表1-1 1-1 酶的国际分类酶的国际分类 如胰蛋白酶的系统编号为如胰蛋白酶的系统编号为EC3.4.21.4EC3.4.21.4，第一个数第一个数字字“3 3”表示该酶是表示该酶是水解酶水解酶（第三大类）；第二个数（第三大类）；第二个数字字“4 4”表示它是水解酶的表示它是水解酶的第四亚第四亚类，催化的反应类类，催

23、化的反应类型为型为水解肽键水解肽键；第三个数字；第三个数字“2121”表示该酶属于第四表示该酶属于第四亚类中的亚类中的第二十一小类第二十一小类，此小类为，此小类为丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶，在，在活性部位上有一至关重要的丝氨酸残基；第四个数字活性部位上有一至关重要的丝氨酸残基；第四个数字“4 4”表示该酶是这一小类中的表示该酶是这一小类中的特定序号特定序号。当酶的编。当酶的编号仅有前三个数字时，就已经清楚地表明了这个酶的号仅有前三个数字时，就已经清楚地表明了这个酶的特性：反应性质、底物性质、键的类型。特性：反应性质、底物性质、键的类型。 第四节第四节 酶的生产方法酶的生产方法酶的生产：酶的生产：

24、 通过人工操作而获得所需的酶的技术过程。通过人工操作而获得所需的酶的技术过程。u提取分离法提取分离法u生物合成法生物合成法u化学合成法化学合成法 1、提取分离法（、提取分离法（最早采用、沿用至今最早采用、沿用至今） 采用各种技术，直接从动植物或微生物的细采用各种技术，直接从动植物或微生物的细胞或组织中将酶提取出来，再进行分离纯化的过胞或组织中将酶提取出来，再进行分离纯化的过程。程。（1）提取法）提取法 酸溶液提取酸溶液提取碱溶液提取碱溶液提取盐溶液提取盐溶液提取有机溶剂提取有机溶剂提取相似相溶相似相溶（2）分离法）分离法离心分离离心分离过滤与膜分离过滤与膜分离萃取分离萃取分离沉淀分离沉淀分离层

25、析分离层析分离电泳分离电泳分离浓缩、结晶、干燥浓缩、结晶、干燥目标分子的特性、目标分子的特性、其他物理化学性质其他物理化学性质酶分子和杂质的主酶分子和杂质的主要性质差异要性质差异酶的使用目的和要酶的使用目的和要求求技术实施的难易度技术实施的难易度分离成本的高低分离成本的高低是否造成环境污染是否造成环境污染 2、生物合成法（主要方法）、生物合成法（主要方法） 利用动物中细胞或微生物细胞的生命活动获得所利用动物中细胞或微生物细胞的生命活动获得所需酶的过程。需酶的过程。液体深层培养发酵液体深层培养发酵固体培养发酵固体培养发酵固定化细胞发酵固定化细胞发酵固定化原生质体发酵固定化原生质体发酵普遍采用普遍

26、采用胞外酶和其他胞胞外酶和其他胞外产物外产物胞内酶和其他胞内产物胞内酶和其他胞内产物 3、化学合成法（实验室阶段）、化学合成法（实验室阶段） 化学合成法是化学合成法是20世纪世纪60年代末出现的一种生产年代末出现的一种生产酶的技术。酶的技术。1969年，美国科学家首次采用化学合年，美国科学家首次采用化学合成的方法获得了含有成的方法获得了含有124个氨基酸的核糖核酸酶。个氨基酸的核糖核酸酶。但是，化学合成法的成本比较高，并且只能合成但是，化学合成法的成本比较高，并且只能合成那些已知化学结构的酶。那些已知化学结构的酶。 第五节第五节 酶工程简介酶工程简介u酶工程酶工程(enzyme enginee

27、ring)是在是在1971年第一年第一届国际酶工程会议上才得到命名的一项新技术，是届国际酶工程会议上才得到命名的一项新技术，是酶制剂的大批量生产和应用的技术酶制剂的大批量生产和应用的技术。u酶工程是现代酶学理论与化工技术的交叉技术，酶工程是现代酶学理论与化工技术的交叉技术，主要研究主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造构的修饰和改造以及在以及在工农业、医药卫生和理论研工农业、医药卫生和理论研究究等方面的应用。等方面的应用。一、定义一、定义分类分类 一是一是化学酶工程化学酶工程 即通过对酶的化学修饰即通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的

28、性质以提高酶的或固定化处理，改善酶的性质以提高酶的效率和降低成本，甚至通过化学合成法制效率和降低成本，甚至通过化学合成法制造人工酶。造人工酶。； 二是二是生物酶工程生物酶工程 用基因重组技术生产酶用基因重组技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计新基因，从以及对酶基因进行修饰或设计新基因，从而生产性能稳定，具有新的生物活性及催而生产性能稳定，具有新的生物活性及催化效率更高的酶。化效率更高的酶。化学酶工程化学酶工程 天然酶天然酶（从生物材料中分离纯化得到酶）（从生物材料中分离纯化得到酶） 化学修饰酶化学修饰酶（对酶分子的化学修饰改善酶（对酶分子的化学修饰改善酶的性能）的性能） 固定化酶固定化酶（将水

29、溶性酶用物理或化学方法（将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态）活性的状态） 人工模拟酶人工模拟酶( (用化学方法合成了人工酶催化用化学方法合成了人工酶催化剂剂) )生物酶工程生物酶工程 生物酶工程是酶学和以生物酶工程是酶学和以DNADNA重组技术为主的重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。现代分子生物学技术相结合的产物。 用基因工程技术大量生产酶用基因工程技术大量生产酶( (克隆酶克隆酶) )； 对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶( (突变突变酶酶) )； 全新设计新酶基因或者通过体外

30、进化，合全新设计新酶基因或者通过体外进化，合成自然界不曾有的成自然界不曾有的新酶新酶。 二、酶工程的应用范围二、酶工程的应用范围（1）对生物宝库中存在天然酶的开发和生产；）对生物宝库中存在天然酶的开发和生产；（2）自然酶的分离纯化及鉴定技术；）自然酶的分离纯化及鉴定技术；（3）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）；）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）；（4）酶反应器的研制和应用；）酶反应器的研制和应用；（5）与其他生物技术领域的交叉和渗透。）与其他生物技术领域的交叉和渗透。其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上有了其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价值才酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价值才真正得以体现。真正得以体现。 三、三、 酶工程的发展