实验五 粪标本的微生物学检验

1、实验六实验六粪便标本的微生物学检验粪便标本的微生物学检验 实验目的：实验目的： 掌握粪便标本的采集与处理、常见病原菌及一般微生物学检验程序。 掌握沙门氏菌和志贺氏菌的鉴定方法；熟悉它们的生物学性状。 粪便标本的采集与处理：粪便标本的采集与处理：自然排便采集法：自然排便采集法：自然排便后，挑取粪便23克于无菌的容器内送检。应尽可能取有脓血、粘液的标本。肛拭子法：肛拭子法：不易获得粪便的患者或作厌氧菌培养时，常采用此法。将无菌棉拭子用无菌生理盐水湿润后，插入肛门约45厘米（幼儿约23厘米）处，轻轻旋转，擦取直肠表面粘液后取出，置无菌试管内送检。除婴幼儿外，不推荐用棉拭子做常规病原菌培养。疑似痢疾患

2、者疑似痢疾患者应在发病初期、用药前采取标本；疑似伤寒患者疑似伤寒患者应在发病23周内采集粪便标本。若疑为霍乱患者若疑为霍乱患者，标本应置碱性蛋白胨水中。若疑有耶尔森菌或弯曲菌等若疑有耶尔森菌或弯曲菌等，标本应置卡布运送培养基送检。粪便标本如不能立即送检，粪便标本如不能立即送检，可将标本放入甘油盐水保存液中或保存于冰箱内（勿超过2h）种种 类类病病 原原 菌菌革兰阳性菌革兰阳性菌金黄色葡萄球、厌氧链球菌、肠球菌、结核分枝杆菌、产气荚膜梭菌、艰难芽胞梭菌、蜡样芽胞杆菌革兰阴性菌革兰阴性菌伤寒杆菌及其它沙门菌、志贺菌、弯曲菌、致病大肠埃希菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌 、气单胞菌、邻单胞菌、小肠结肠炎耶尔

3、森菌真菌真菌白假丝酵母菌病毒病毒轮状病毒粪便标本中常见的病原微生物粪便标本中常见的病原微生物粪便标本的检验程序粪便标本或肛拭子标本直接涂片革兰染色抗酸染色分离培养（SS、MaC、TCBS、碱性蛋白胨平板）增菌培养（ GN增菌、 亚硒酸盐增菌液、碱性蛋白胨水）351824h菌落形态、革兰染色氧化酶试验KIA、MIU及其他生化反应、血清学凝集、药敏试验报告结果注：注：GN增菌液、亚硒酸盐增菌液用于志贺菌、沙门菌的增菌。 直接涂片只适应于疑为霍乱、肠结核及伪膜炎肠炎患者。 GN增菌液：增菌液：本培养基含有胆盐、枸橼酸盐对革兰氏阳性菌有抑制作用，而对革兰氏阴性菌有增菌作用，接种标本6小时内，大肠杆菌、

4、变形杆菌及假单胞菌在此培养基中生长迟缓，而志贺菌、沙门氏菌生长较迅速。故常于接种粪便68小时，再自此增菌液内接种至SS平板、MaC平板中。 亚硒酸盐增菌液：亚硒酸盐增菌液： 本培养基中的04%亚硒酸钠可抑制革兰氏阳性菌的生长，对革兰氏阴性菌也有毒性，但磷酸钠有中和此毒性的作用，能使肠道致病菌迅速繁殖。磷酸氢二钠与磷酸二氢钠有缓冲作用，有利于肠道致病菌生长。 SS平板：平板：是专用志贺菌、沙门菌分离培养用的一种强选择性培养基。 胆盐胆盐能抑制革兰氏阳性菌生长，煌绿煌绿抑制大肠杆菌的生长。促进志贺菌、沙门菌生长（对胆盐和煌绿等染料有抵抗力）。 胆盐、枸橼酸钠及硫代硫酸钠在一定比例时发挥联合抑菌作用

5、。 硫代硫酸钠有缓和胆盐对志贺菌、沙门菌的有害作用并中和煌绿、中性红的毒性作用。 本培养基除抑制肠球菌、革兰氏阳性菌外，还可抑制大部分大肠艾希氏菌、产气肠杆菌等革兰氏阴性菌，对志贺菌、沙门菌也有轻度的抑制作用。 由于该培养基抑制杂菌的能力强，故可以增加粪便接种量而获得较高的阳性分离率。 实验器材：实验器材：1、标本：、标本：已增菌模拟粪便标本1#、2#、3#、4#、5#。2、培养基：、培养基：SS、MaC、 KIA、蛋白胨水、枸橼酸盐斜面、尿素、苯丙氨酸斜面、硝酸盐蛋白胨水、甘露醇半固体培养基。3、试剂：、试剂：革兰染液、氧化酶试剂、3%H2O2、靛基质试剂、甲基红试剂、10%FeCl3、硝酸

6、盐还原试剂甲液、硝酸盐还原试剂乙液。4、诊断血清：诊断血清：志贺菌属：志贺菌四种多价诊断血清、福氏志贺菌多价诊断血清、宋内氏志贺菌单价诊断血清。沙门菌属：AF群多价O血清、O因子血清（O2、O4 O9）、H因子血清（Ha Hb Hd）、Vi血清。 实验方法：实验方法：一、分离培养一、分离培养 用无菌方法将1#、2#、3#、4#、5#模拟粪便标本分别划线接种于SS、Mac上，置35培养1824小时。二、结果观察：二、结果观察：、菌落形态描述、菌落形态描述: 分别描述1#、2#、3#、4#、5#标本在SS、Mac上的菌落形态。（可疑菌落与正常菌群菌落分别描述）2、革兰染色：革兰染色：3、触酶试验：

7、触酶试验：4、氧化酶试验：氧化酶试验：5、细菌分纯：细菌分纯：挑取生长于SS平板、MaC平板中的可疑菌落35个分别接种35支KIA。37培养1824小时后，观察结果。 KIA菌名乳糖 / 葡萄糖H2S动力气体福氏志贺菌A / K宋内氏志贺菌A / K甲型副伤寒杆菌A / K / +乙型副伤寒杆菌A / K+伤寒杆菌A / K+ / +三、三、KIA结果观察结果观察分别描述1#、2#、3#、4#、5#标本的KIA结果。四、生化反应：四、生化反应： 根据KIA的结果进一步做生化反应。从KIA斜面上挑取1#、2#、3#、4#、5#标本细菌分别接种于蔗糖半固体发酵管、蛋白胨水、尿素、苯丙氨酸斜面、硝酸

8、盐蛋白胨水，37培养1824小时后，观察结果。五、血清学试验五、血清学试验:沙门菌属：如生化反应符合沙门氏菌属，则可按下述步骤进行血清学沙门菌属：如生化反应符合沙门氏菌属，则可按下述步骤进行血清学诊断：诊断：1、先用AF群O多价血清作玻片凝集试验（做生理盐水对照, 看有无自凝）2、AF群O多价血清凝集则用用O因子血清定群：因子血清定群： O抗原有许多组成成分，有的是一种菌所独有的，有的是几种菌共有的。将具有相同菌体抗原的沙门氏菌归属于同一组（群）。故O因子血清只能定群。3、AF群O多价血清不凝集，做Vi因子血清凝集因子血清凝集。如果凝集，需用生理盐水制成浓稠菌悬液后隔水煮沸1530分钟，再做凝

9、集试验。（新分离的伤寒及丙型副伤寒常带想此抗原。）4、按照确定的、按照确定的O群分别用群分别用H因子血清检因子血清检查查H抗原抗原。 志贺菌属志贺菌属：若生化反应结果相符，则作玻片凝集反应：1、做生理盐水对照, 看有无自凝。2、用志贺氏菌属4种多价血清反应，若有凝集，再用单价群诊断血清（福氏志贺菌多价诊断血清、宋内氏志贺菌单价诊断血清）行凝集反应定群。 血清学试验血清学试验结果结果判断判断： 血清凝集试验阳性：出现肉眼可见凝集颗粒 血清凝集试验阴性：液体呈乳状悬液 KIA标本号乳糖 / 葡萄糖H2S动力气体菌名A / K福氏志贺菌A / K宋内氏志贺菌A / K / +甲型副伤寒杆菌A / K+乙型副伤寒杆菌A / K+ / +伤寒杆菌 生化反应标本号蔗糖靛基质甘露醇脲酶苯丙氨酸脱氨酶动力气体+ +六、实验结果：六、实验结果：1、KIA 结果：2、生化反应结果：标本号AF群O多价血清O2O4O9Ha HbHd生理盐水对照菌名+甲型副伤寒杆菌+乙型副伤寒杆菌+伤寒杆菌标本号志4种多价血清福氏多价诊断血清宋内氏单价诊断血清生理盐水对照菌名+福氏志贺菌+宋内氏志贺菌血清学试验结果：血清学试验结果：沙门