原核基因表达调控

1、7 原核基因表达调控模式原核基因表达调控模式 7.1 7.1 原核基因表达调控总论原核基因表达调控总论 生物体内每个细胞都含有该物种的一整套基因，但是，这些基因并不是同时都表达。原核生物能够根据环境的变化，开启或关闭某些基因，以便迅速合成它所需要的蛋白质，停止合成它不需要的蛋白质。生物体内的基因之所以能够有序地表达，是因为细胞内存在着基因表达的调控机制，这种调控机制是生物体所不可缺少的。研究原核生物基因表达的调控，不仅对于掌握其生命活动的规律有重要意义，而且有助于在生产领域更有效的应用有关的原核生物，在医疗领域更好的预防和治疗疾病，还有助于更好的利用原核生物表达目的基因。 原核生物是单细胞生物

2、，细胞结构相对比较简单，与其周围环境直接接触，周围的营养状况和环境因素可能随时发生变化。通过进化的过程，原核生物形成了适应环境改变的能力，其途径之一就是改变其基因的表达，使基因表达的产物正好适合新的环境。原核生物基因表达调控的一个重要特点，是不断调整自身基因表达以适应周围环境。 原核生物能够通过诱导或阻遏合成一些相应的蛋白质，来调整与外环境之间的关系。由于原核生物转录与翻译的过程是同时发生的，而且所经历的时间很短，只需数分钟，同时由于大多数原核生物的mRNA在几分钟内就受到酶的影响而降解，因此消除了外环境突然变化后所造成的不必要的蛋白质的合成。因此，原核生物基因表达的一个特点是快速。 细菌的染

3、色体由环状的单分子DNA组成，约有95%的DNA为编码序列，只有约5%为基因间的DNA。有一部分基因间的DNA是有重要功能的，如复制原复制原点点(origin of replication)，另一些基因间区域可能涉及到和DNA包装蛋白的相互作用。根据基因表达产物的区别，可把基因分为两类：调节型基因调节型基因（regulated genes）的表达受细胞生长的环境影响，在不同的生长时期有不同的表达活性。组成型组成型基因基因（constitutive genes）也叫管家基因管家基因(housekeeping genes)，其特点是不论环境条件如何，这些基因呈现持续表达，其基因产物维持了细胞生长和

4、分裂的正常功能。由于在生长的细胞中这些基因总是处于活性状态，因此这些基因也叫做组成型基因。不论是调节型基因还是管家基因，表达都受到调控，只是调控方式不同。 n基因表达调控主要表现在以下几个方面：n1 转录水平上的调控n2 转录后水平的调控，包括n（1） mRNA加工成熟水平上的调控（2）翻译水平上的调控n原核生物中，营养状况和环境因素对基因表达起着举足轻重的影响。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平和发育阶段是基因表达调控的最主要手段，营养和环境因素的影响力大为下降。 7.1.1 原核基因调控分类n原核基因调控主要发生在转录水平上，根据调控机制不同可分为：n负转录调控n正转录调控 负转录调

5、控（负转录调控（negative transcription regulation) 负转录调控（negative trnscription regulation)调节基因的产物是阻遏蛋白，阻止基因的转录包括：1)阻遏蛋白可单独起作用抑制转录，当与诱导物结合时丧失抑制转录的作用。（负控诱导）2）阻遏蛋白自身不能抑制转录，只有与效应物结合时，才具有抑制转录的作用。（负控阻遏）正转录调控（正转录调控（positive transcription regulation)正转录调控（positive transcription regulation)调节基因的产物是激活蛋白包括：1）激活蛋白质只有在与

6、效应物结合时才处于活性状态，促使基因转录。（正控诱导）2）激活蛋白自身具有促进基因转录的能力，但当与效应物结合时，激活蛋白处于无活性状态，不能促进基因转录。（正控阻遏）因子对原核生物转录起始的调控因子对原核生物转录起始的调控n 在所有的调控方式中，基因表达关闭的越早，就越不会将能量浪费在合成不必要的mRNA和蛋白质上。因此，其表达开关的调控关键机制主要发生在转录的起始。 n 原核生物细胞仅有一种RNA聚合酶，核心酶参与转录延长，全酶控制转录起始。在转录起始阶段，因子识别特异启动序列。不同的因子决定特异编码基因的转录激活，也决定不同RNA（mRNA、rRNA和tRNA）基因的转录。 n 离体实验

7、表明，若仅用核心酶进行转录，则对模板链和起始点的选择都有很大的随意性，而且往往同一段DNA的两条链都被转录。可见，哪条DNA链被转录，转录方向与转录起点的选择都与亚基有关。亚基参与启动子的识别、结合以及转录起始复合物的异构化，因子的取代在细胞发育和对环境的应答反应中起主导作用。n 在E.coli中，主要的因子为70可与核心酶一同被纯化。但另外一些因子能够识别与主要启动子顺序不同的另类启动子，并促使核心酶起始转录。这些变异的因子通常能急剧改变细胞RNA的合成方式，使一组全新的基因得以表达。例如，热激反应是生物体对高温作出的保护性反应，其重要的反应是启动热休克蛋白热休克蛋白HSP的表达。基因htp

8、RhtpR（heat shock regulatory gene）是E.coli转到热休克反应所必需的。htpR的产物是一个32KD的变异的因子，称为32，32很不稳定，能引导核心酶在热休克基因的启动子处起始转录。n E. coli的60是在氮饥饿时起作用的，正常时E. coli细胞中仅有少量60，但当介质中氨缺乏时，60即大量增多，以开启某些可利用其它氮源的基因，即60能引导核心酶识别具有特殊共同序列的另类启动子。 n 从一组基因表达变换为另一组基因表达往往需要更换因子，这在噬菌体生命周期的裂解期和溶源期的转换中表现最为明显。枯草杆菌的正常因子(相当于E. coli中的70)为43，它能识别

9、70所识别的共同顺序。在噬菌体SP01感染B. subtilis（枯草杆菌）时即会出现新的因子。SP01的感染周期一般可分为三期：感染初期，早期基因被转录；45分钟后早期基因转录停止，中期基因开始转录；812分钟后中期基因的转录又被晚期基因所取代。早期基因由宿主菌的全酶转录，故仍用43，而中期及晚期基因转录则需要新的28和34因子来取代原来的43。 7.2 7.2 乳糖操纵子与负控诱导系统乳糖操纵子与负控诱导系统n 原核生物绝大多数基因按功能相关性成簇地串联、密集于染色体上，共同组成一个转录单位即操纵子操纵子（operon），如乳糖（lac）操纵子、阿拉伯糖（ara）操纵子及色氨酸（trp）操

10、纵子等。一个操纵子只含一个启动序列及数个可转录的编码基因(通常为26个，有的多达20个以上)，在同一启动序列控制下，操纵子可转录出多顺反子mRNA。操纵子在原核基因组中普遍存在，原核基因的协调表达就是通过调控单个启动基因的活性完成的。 n 法国科学家Francois Jacob和Jacques Monod于1962年最早发现了乳糖操纵子，人们随后发现其它原核生物的基因调控也使用类似的方式，这就是操纵子的调控模型。他们的学说使我们能够从分子生物学水平认识基因表达的调控，他们两人也因此获得了1965年的Nobel生理学或医学奖。7.2 乳糖操纵子与负控诱导系统操纵子的基本结构操纵子的基本结构 操纵

11、子通常由 2个以上的结构序列与启动序列、操纵序列以及其它调节序列在基因组中成簇串联组成的一个转录单位。 启动子启动子n 启动子启动子（promoter）就是连接在基因5-端上游的DNA序列，其长度从100 bp到200 bp不等，是转录起始时RNA聚合酶识别、结合的特定部位，但其本身并不被转录。启动子（或启动序列）会影响其与RNA聚合酶的亲和力，从而影响转录起始。 结构基因结构基因n 操纵子中编码蛋白质的基因称结构基因结构基因（structural gene），是决定某一种蛋白质氨基酸序列的一段DNA。结构基因的功能是把携带的遗传信息转录成mRNA，再以mRNA为模板合成具有特定氨基酸序列的蛋

12、白质。一个操纵子中常含有两个以上的结构基因，每个结构基因首尾相连构成一个基因簇，并转录成含有多个开放阅读框的多顺反子mRNA。翻译时，核糖体在合成好第一个结构基因编码的多肽链后，不脱离mRNA，继续翻译合成下一个基因编码的多肽链，直至完成对多个结构基因的翻译。 操纵基因操纵基因n 操纵基因操纵基因（operator gene）指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列，位于启动子和结构基因之间，常与启动子邻近或与启动子序列重叠，当调控蛋白结合在操纵基因上，会影响其下游基因转录的强弱。当操纵基因“启动”时，由它所控制的结构基因就开始转录和翻译。当“关闭”时，结构基因就停止转录与翻译。操纵基因中常具

13、有二重对称的回文结构，这可能与其结合的调节蛋白是二聚体有关。 当调节基因的产物阻遏蛋白和操纵基因相结合时，RNA聚合酶就不能通过操纵基因，mRNA的转录受阻。诱导物可以和阻遏蛋白结合而使它失去活性，不再和操纵基因相结合，这样酶的合成便又开始。在阻遏系统中，当代谢最终产物不足时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合。当代谢最终产物合成过多时，就会和相应的阻遏蛋白相结合，有活性的阻遏蛋白能和操纵基因结合，阻止结构基因的转录。操纵基因的特点就是能与调节蛋白特异性结合，影响下游结构基因的转录。 调节基因调节基因 n 调节基因调节基因（regulatory gene）是一段有效的DNA片段，它通过转录、翻译而产生

14、调节蛋白，该蛋白质与操纵基因相互作用，从而对操纵子的活动进行控制。调节蛋白上有两个位点：一个与操纵基因结合；一个与小分子的效应物结合。它在细胞中的作用犹如自动控制系统，能使结构基因在需要某种酶时就合成某种酶，不需要时则停止合成，它对不同染色体上的结构基因有调节作用。调节基因编码的调节蛋白和操纵基因结合后，如果抑制其所调控的基因的转录，则称阻遏蛋白，其介导的方式为负调控；如果激活或者增强其所调控的基因转录，则称激活蛋白，其介导的方式为正调控。 n 原核生物的操纵子通过调节蛋白与小分子物质相互作用达到诱导或者阻遏状态，这些小分子物质称为效应物效应物（effector）。与调节蛋白结合，抑制其与操纵

15、基因的结合，促进转录进行的称为诱导物诱导物（Inducer），如作用于乳糖操纵子的乳糖。与调节蛋白结合，促进其与操纵基因的结合，抑制转录进行称为辅阻遏物，如作用于色氨酸操纵子的色氨酸。有些阻遏蛋白在自然状态下一般结合在操纵基因上，阻止RNA聚合酶进入启动子区域，结构基因不能转录，诱导物可以和阻遏蛋白结合，促使其构象发生改变，从操纵基因上解离下来，RNA聚合酶能够启动结构基因的转录。另有一些阻遏蛋白本身没有结合操纵基因的活性，结构基因能够表达，若阻遏蛋白与辅阻遏物结合，提高了阻遏蛋白与操纵基因的亲和性，使操纵子关闭，结构基因不能够被转录。 大肠杆菌乳糖操纵子大肠杆菌乳糖操纵子 乳糖操纵子的结构乳

16、糖操纵子的结构n 乳糖操纵子（lac operon）的功能是调节乳糖代谢，包括启动基因（P）、操纵基因（O）、-半乳糖苷酶基因（lacZ）、-半乳糖通透酶基因（lacY）和硫代半乳糖苷转乙酰基酶基因（lacA），及一个调节基因I，是可诱导的调控系统。lacZ、Y、A的产物可催化乳糖的分解，产生葡萄糖和半乳糖。lacZ基因长3510bp，编码-半乳糖苷酶，此酶由500kD的四聚体构成，它可以切断乳糖的半乳糖苷键，而产生半乳糖和葡萄糖。lacY基因长780bp，编码260个氨基酸的-半乳糖苷透性酶，这种酶是一种30kD的膜结合蛋白，它构成转运系统，将半乳糖苷运入到细胞中。lacA基因长825bp，

17、编码275个氨基酸、大小为32kD的-半乳糖苷乙酰转移酶，其功能是将乙酰-辅酶A上的乙酰基转移到-半乳糖苷上。 大肠杆菌乳糖操纵子大肠杆菌乳糖操纵子Z: -Galactosidase (-半乳糖苷酶)；Y: Permease (-半乳糖苷透过酶);A: Tranacetylase (-半乳糖苷乙酰转移酶)。lacI: Repressor gene I; P: promoter; O: operator(操纵基因) 调节基因（I）位于启动子附近，有自身的启动子和终止子，编码一个游离的，可扩散的，由347个氨基酸组成的阻遏蛋白，该蛋白是4个多肽链单体组成的四聚体，是一种酸性蛋白。阻遏蛋白结合到操纵

18、基因上，阻止RNA多聚酶与启动基因的结合，使转录不能进行，是负调控因子。操纵基因（O）是阻遏蛋白的结合部位，与调节基因共同决定产酶的方式。启动基因处于操纵基因的上游，与操纵基因部分重叠，含有RNA多聚酶识别序列、结合序列和激活序列。乳糖操纵子的调控既有负调控系统，又有正调控系统。 n 乳糖操纵子的正调控因素是降解物基因活化降解物基因活化蛋白蛋白（catabolite activator protein，CAP）。在启动子P上游还有一个40bp的CAP结合位点。CAP（Mr 44000）是二聚体，它可以和cAMP结合形成CAP-cAMP复合物，然后再结合到启动基因的CAP结合部位，以提高相邻操纵

19、子的转录速度。乳糖操纵子转录时，RNA聚合酶首先与启动子结合，通过操纵基因O向右，按照ZYA的方向进行转录，每次转录出的都是一个含有这三个基因的多顺反子mRNA。 IPOZYAnZ编码-半乳糖苷酶；Y编码-半乳糖苷透过酶；A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶。-半乳糖苷酶是一种-半乳糖苷键的专一性酶，除能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，还能水解其他-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。-半乳糖苷透过酶的作用是使外界的-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。-半乳糖苷乙酰基转移酶的作用是把乙酰辅酶A上的乙酰基转到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。n在不含乳糖及-半乳糖苷的培养基中，lac+基因型

20、大肠杆菌细胞内-半乳糖苷酶和-半乳糖苷透过酶大约只有1-2个酶分子。如果在培养基中加入乳糖，酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的6%或7%，每个细胞中可有超过105个酶分子。 7.2.1 7.2.1 酶的诱导酶的诱导- -laclac体系受调控的证据体系受调控的证据n科学家把大肠杆菌细胞放在加有放射性35S标记的氨基酸但没有任何半乳糖诱导物的培养基中繁殖几代，然后再将这些带有放射活性的细菌转移到不含35S、无放射性的培养基中，随着培养基中诱导物的加入，-半乳糖苷酶便开始合成。分离-半乳糖苷酶，发现这种酶无35S标记。说明酶的合成不是由前体转化而来的，而是加入诱导物后新合成的。7.2.2 乳糖操纵子调

21、控模型乳糖操纵子调控模型 Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码。 这个mRNA分子的启动子紧接着O区，而位于I与O之间的启动子区（P），不能单独起动合成-半乳糖苷酶和透过酶的生理过程。 操纵基因是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点。当阻遏物与操纵基因结合时，lacmRNA的转录起始受到抑制。诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发lacmRNA的合成。当有诱导物存在时，操纵基因区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。 乳糖操纵子的负调控乳糖操纵子的负调控 n 当环境中没有乳糖时，E. coli的lac

22、操纵子处于阻遏状态。此时的调控机理是：lacI基因在自身的启动子控制下，合成阻遏蛋白，阻遏蛋白以四聚体的形式和lacO特异性的紧密结合，阻碍RNA聚合酶II与P序列结合，抑制lacZ、lacY、lacA三个结构基因的转录（图11-4a）。 当在培养基中只有乳糖时，由于乳糖是lac操纵子的诱导物，可以结合在阻遏蛋白的变构位点上，使其构象发生改变，不能与操纵基因结合，于是RNA聚合酶结合于启动子，并顺利地通过操纵基因，进行结构基因的转录，产生大量分解乳糖的酶（图11-4b）。加入诱导剂后，微生物能同时或几乎同时诱导几种酶的合成。-半乳糖苷酶、-半乳糖通透酶和硫代半乳糖苷转乙酰基酶共用一个mRNA模

23、板，从5-端依次开始翻译，这三种结构基因作为一个整体受协同调控而表达。 后来发现，真正的诱导剂为乳糖进入细胞，经-半乳糖苷酶催化生成的别乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，导致阻遏蛋白与O序列解离。异丙基异丙基-D-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷（isopropylthiogalactoside，IPTGIPTG）与自然的-半乳糖苷相似，其半乳糖苷键中用硫代替了氧，不被-半乳糖苷酶水解，因而十分稳定，IPTG是lac基因簇十分有效的诱导物，被实验室广泛应用。这类诱导物能诱导酶的合成，但又不被酶分解，称为安慰诱导物安慰诱导物（gratuitous inducer）。 阻遏物具有双重性，它既能

24、阻止转录，又能识别小分子诱导物。当诱导物在相应位点结合时，改变了阻遏蛋白的构象，干扰了另一位点的活性，这种类型的调控叫变构调控变构调控（allosteric control）。 可诱导的操纵子一般编码一些糖和氨基酸代谢的酶，这些物质平时含量很少，细菌总是利用最容易利用的能源，所以这些操纵子常常是关闭的。当生存条件改变，必须利用这些物质作为能源时，这些基因则被诱导开放。可见，原核生物的代谢活动是十分经济有效的。 当细胞内无诱导物（inducer)存在时，阻遏蛋白能够与操纵基因结合。由于操纵基因与启动子有一定程度的重叠 ，从而抑制lac Z Y A结构基因的转录，但乳糖操纵子存在着本底水平的表达。

25、 当细胞内有诱导物存在时，诱导物与阻遏蛋白结合，从而改变阻遏蛋白构象，使之迅速地从操纵基因上解离下来。这样RNA聚合酶就能与启动子牢固结合并形成开放性启动子复合物，从而开始大量转录lac Z Y A结构基因。乳糖操纵子的负调控乳糖操纵子的负调控IOO诱导剂诱导剂乳糖操纵子的负调控乳糖操纵子的负调控图图15-4mRNA阻遏蛋白阻遏蛋白IDNAZYAOPpol没有乳糖存在时没有乳糖存在时阻遏蛋白的负性调节阻遏基因阻遏基因mRNA阻遏蛋白阻遏蛋白有乳糖存在时有乳糖存在时IDNAZYAOPpol启动转录启动转录mRNA乳糖乳糖半乳糖半乳糖-半乳糖苷酶半乳糖苷酶诱导表达诱导表达1. Lac操纵子的本底水

26、平表达操纵子的本底水平表达n因为诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而运转诱导物需要透过酶。在非诱导状态下有少量（1-5个mRNA分子）lac mRNA合成-本底水平永久型合成。 2 阻遏物阻遏物laclac I I基因产物及功能基因产物及功能nLac操纵子阻遏物mRNA是在弱启动子控制下永久型合成的，该阻遏蛋白有4个相同的亚基，每个亚基均含有347个氨基酸残基，并能与1分子IPTG结合。3. 葡萄糖对葡萄糖对lac操纵子的影响操纵子的影响-代谢物阻遏效应代谢物阻遏效应 研究表明，葡萄糖对lac操纵子表达的抑制作用是间接的，因为存在一种大肠杆菌突变株，它正常的糖酵解过程受阻，葡萄糖-6-磷酸

27、不能转化为下一步代谢中间物，该菌株能在有葡萄糖存在的情况下被诱导合成lac mRNA。所以，不是葡萄糖而是它的某些降解产物抑制lac mRNA 的合成，把这种效应称为代谢物代谢物阻遏效应阻遏效应。 当葡萄糖和乳糖同时存在于培养基中时，lac 启动子表达受阻，没有-半乳糖苷酶活性；当葡萄糖消耗完以后，细胞内cAMP浓度增加， -半乳糖苷酶活性增加。4. cAMP与代谢物激活蛋白与代谢物激活蛋白 n当葡萄糖和乳糖同时存在于培养基中时，lac启动子表达受阻，没有-半乳糖苷酶活性；当葡萄糖消耗完以后（图中箭头处），细胞内cAMP浓度增加，-半乳糖苷酶活性被诱导，一度停止生长的细胞又恢复分裂。如果将细菌

28、放在缺乏碳源的培养基中，细胞内cAMP浓度就很高；若在含葡萄糖的培养基中培养，细菌中的cAMP浓度就会很低；如果将细菌置于甘油或乳糖等不进行糖酵解的碳源培养基中，细菌中cAMP的浓度也会很高。n 研究证实，葡萄糖所引起的代谢物抑制(Catabolite repression)现象的实质是该代谢物降低了细胞中cAMP的含量.事实上，cAMP-CRP复合物是lac体系的正调控，它们不能代替lacI和lacO的功能(negative regulator)。ncAMP-CRP不但能与DNA相结合，造成双螺旋弯曲，易于形成三元转录起始复合物，它还能直接影响RNA聚合酶的活性。 乳糖操纵子的正调控乳糖操纵

29、子的正调控 当E. coli以乳糖为唯一碳源时，lac操纵子可被乳糖诱导而表达，可是在培养基中同时加入葡萄糖时，细菌则优先利用葡萄糖，只有当葡萄糖耗尽时，乳糖才能诱导基因的表达，这种现象称为分解物阻遏分解物阻遏。 1965年B Magasonik发现大肠杆菌处于碳源饥饿条件下，cAMP水平显著提高。反之，在细胞生长的培养基中含有大量葡萄糖时，cAMP水平明显降低。乳糖操纵子也有类似的情况，只有当以乳糖为唯一碳源时，-半乳糖苷酶的合成才增加。但是在以乳糖和葡萄糖为碳源时，如果加入cAMP，-半乳糖苷酶的合成速率也会大大提高，可达到只用乳糖为碳源时的水平。说明该菌株内cAMP的浓度能影响到-半乳糖

30、苷酶的合成速率，进一步的分析发现，这一过程还与一种诱导蛋白有关。 在lac操纵子的调控中，有降解物基因活化蛋白（CAP）发挥调控作用。CAP 又称cAMP受体蛋白(cAMP receptor protiein，CRP) ，是一种同二聚体蛋白质，每个亚基含209个氨基酸残基，在其分子内有DNA结合区及cAMP结合位点，可起转录起始因子的作用。在有cAMP时，能形成CRP-cAMP复合物，使操纵子有效地进行转录。 CRP结合位点呈对称结构，位于启动子附近（图11-5）。当CRP-cAMP复合物特异地结合在启动子上时，能促进RNA聚合酶与启动子结合，可使RNA的转录活性提高50倍。由于CAP的结合能

31、促进转录，这种调控方式称为乳糖操纵子的正调控。 另外，乳糖操纵子的启动子和一般启动子的一级结构稍有不同（图11-6）：一般启动子在35区域是TTGACA，在10的区域是TATAAT，但乳糖操纵子的启动子35区域是TTTACA，在10的区域是TATGTT。这种结构的差异说明乳糖操纵子的启动子与RNA聚合酶II的结合是比较弱的，只有在CRP-cAMP复合物的激活下，才能与RNA聚合酶结合。 CAP必须首先与cAMP形成复合物，才能与启动子相结合。葡萄糖的降解产物能降低细胞内cAMP的含量，造成cAMP浓度降低，CAP便不能结合在启动子上。此时即使有乳糖存在，虽已解除了对操纵基因的阻遏，RNA聚合酶

32、不能与启动子结合，也不能进行转录，所以仍不能利用乳糖（图11-7）。 由此可见，对乳糖操纵子来说 CAP是正性调节因素，乳糖阻遏蛋白是负性调节因素。两种调节机制根据存在的碳源性质及水平协调调节乳糖操纵子的表达。倘若有葡萄糖存在时，细菌优先选择葡萄糖供应能量。葡萄糖通过降低 cAMP浓度，阻碍cAMP与CAP结合而抑制乳糖操纵子转录，使细菌只能利用葡萄糖。在没有葡萄糖而只有乳糖的条件下，阻遏蛋白与O序列解聚，CAP结合cAMP后与乳糖操纵子的CRP位点结合，激活转录，使得细菌利用乳糖作为能量来源。 乳糖操纵子的正调控乳糖操纵子的正调控 E.coli lac 启动子有85个核苷酸。整个启动子分为两

33、部分，上游部分是cAMP-CRP结合位点，下游部分是RNA聚合酶进入位点。 cAMP - CRP结合位点包括位点I和位点II。RNA聚合酶进入位点包括识别位点和结合位点。Cyclic AMP Receptor Protein (CRP or CAP) 细胞内缺少葡萄糖时，腺苷酸环化酶将ATP转变成cAMP，cAMP与其受体蛋白CRP（cyclic AMP receptor protein）结合成复合物，这个复合物再与启动子上的CAP位点结合。这样，启动子上的进入位点才能与RNA聚合酶结合。相反，当有葡萄糖存在时，cAMP不能形成，CRP也就不能与启动子上的CAP位点相结合，启动子上的RNA聚合

34、酶进入位点就不能结合RNA聚合酶。 乳糖启动子有两个CAP结合位点，一个在-70-50（位点I;）;另一个是在-50-40（位点II）。负调控与正调控协调合作：n阻遏蛋白封闭转录时，cAMP-CRP不发挥作用n如没有cAMP-CRP加强转录，即使阻遏蛋白从Operator上解聚仍无转录活性.葡萄糖可降低cAMP浓度，阻碍其与CRP结合从而抑制转录.葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌优先利用葡萄糖.结论：lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖.协调调节协调调节(coordinate regulation)7.2.3 lac操纵子操纵子DNA的调控区域的调控区域-P.O.区区 lac P（启动

35、子区）从I基因结束到mRNA转录起始位点止，共长82bp（-82+1）;O区就是阻遏物结合区，位于P区后半部分和转录起始区（-7+28），该区序列有对称性，其对称中心点在+11位。P区的cAMP-CRP结合区（-67-52）也有对称性，其对称位点在-60-59之间。7.2.4 lac操纵子中的其他问题n1、A基因及其生理功能nA基因编码存在于lac操纵子中， 编码-半乳糖苷乙酰基转移酶。该酶能将乙酰基从供体上转移到半乳糖苷分子上。乙酰化的半乳糖苷不能被-半乳糖苷酶分解，其代谢产物也不会在细胞内积累，在生物进化中是有意义的。2. 2. LacLac基因产物数量上的比较基因产物数量上的比较 在一个

36、完全被诱导的细胞中，-半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶的拷贝数比例为1:0.5:0.2，这个比例在一定程度上反映了以-半乳糖苷作为唯一碳源时细胞的需要。不同的酶在数量上的差异是由于在翻译水平上受到调节所致。 lac mRNA可能与翻译过程中的核糖体相脱离，从而终止蛋白质链的翻译。这种现象发生的频率取决于每一个后续的AUG密码子再度起始翻译的概率。 在lac mRNA分子内部，A基因比Z基因更易受内切酶作用发生降解，因此，在任何时候Z基因的完整拷贝数要比A基因多。3.3.操纵子的融合与基因工程操纵子的融合与基因工程nLac操纵子与pur操纵子的偶联。npur操纵子负责嘌呤的合成，位于Lac操纵子

37、下游，如果Lac基因缺失及pur操纵子缺失操纵基因和启动子的一部分，当转录作用从Lac启动子开始后，就合成出由一部分Z基因编码区和整个pur基因转录生成的mRNA分子。 Pur操纵子被嫁接到Lac启动子上，形成融合基因。7.3 色氨酸操纵子与负控阻遏系统色氨酸操纵子与负控阻遏系统n 色氨酸操纵子(tryptophane operon)负责色氨酸的生物合成，当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，trp基因表达，色氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用。由于trp体系参与生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CRP的调控。n 色氨

38、酸的合成分5步完成。每个环节需要一种酶，编码这5种酶的基因紧密连锁在一起，被转录在一条多顺反子mRNA上，分别以trpE、trpD、trpC、trpB、trpA代表，编码了邻氨基苯甲酸合成酶、邻氨基苯甲酸焦磷酸转移酶、邻氨基苯甲酸异构酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油-3-磷酶合成酶。色氨酸操纵子色氨酸操纵子有5个结构基因trpE-D-C-B-A，在trpE的上游有三个区段trpP-O-L， trpL是一段162bp序列，称为前导区，转录到mRNA中成为前导序列，对操纵子的转录起调控作用。 trpR基因编码阻遏蛋白亚基，阻遏蛋白（四聚体）结合到trpO位点。 trpP与一般原核基因启动子一样，具有正常

39、的-10序列和-35序列。-10序列完全位于trpO之内。由于这种结构，使RNA聚合酶对启动子结合受到阻遏蛋白的排斥。色氨酸操纵子的结构色氨酸操纵子的结构ntrpE基因是第一个被翻译的基因，前导区和弱化子区分别定名为trpL和trpa（不是trpA）。trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp基因簇很远，后者在大肠杆菌染色体图上25min处，而前者则位于90min处。在位于65min处还有一个trpS（色氨酸tRNA合成酶），它和携带有trp的tRNAtrp也参与trp操纵子的调控作用。 n L区编码了前导肽，当有高浓度Trp存在时，由于弱化子a的作用，转录迅速减弱停止，生成14

40、0核苷酸的前导RNA；当Trp浓度较低时，弱化子不起作用，转录得以正常进行，生成长约7kb的mRNA，操纵子中第一个结构基因的起始密码子AUG在+162处。 基因trpE、trpD、trpC、trpB、trpA紧密连锁在一起，编码色氨酸合成所需的5种酶，即邻氨基苯甲酸合成酶、邻氨基苯甲酸焦磷酸转移酶、邻氨基苯甲酸异构酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油-3-磷酶合成酶， 与trpE基因相邻的是启动基因和操纵基因。前导区和衰减区分别名为trpL和trpa(不是trpA)，产生阻遏物的基因trpR距trp基因簇较远。此外，色氨酸tRNA合成酶(trpS)，及trp-tRNATrp也参与trp操纵子的调控作用

41、(图11-9)。 Trp操纵子的调控模式包括阻遏机制和衰减机制，阻遏蛋白对结构基因转录的负调控起到粗调的作用，而弱化子起到细调的作用。7.3.1trp操纵子的阻遏系统操纵子的阻遏系统n n 调控基因trpR的位置远离P-O-结构基因群，在其自身的启动子作用下，以组成性（Constitutive）方式低水平表达调控蛋白R，R相对分子质量为47000，没有与O结合的活性。当环境能提供足够浓度的色氨酸时，R与色氨酸结合形成复合物后，构象变化而活化，就能够与O特异性紧密结合，阻遏结构基因的转录。当无色氨酸存在时，缺少色氨酸的Trp阻遏物以一种非活性形式存在，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，对转录无抑制作用

42、。在这样的条件下，trp操纵子被RNA聚合酶转录，同时色氨酸生物合成途径被激活。因此这是属于一种负性调控的、可阻遏的操纵子，即这操纵子通常是开放转录的，效应物色氨酸作为辅阻遏物作用时则阻遏关闭转录（图 11-10）。 色氨酸是效应物。色氨酸丰富时，色氨酸分子与阻遏蛋白TrpR结合，使阻遏蛋白活化，从而结合到调控区的trpO位点，阻止操纵子的转录。色氨酸缺乏时，TrpR呈游离状态，不能与trpO位点结合，色氨酸操纵子的mRNA可以被转录合成。色氨酸操纵子的负调控色氨酸操纵子的负调控衰减机制衰减机制n 当色氨酸达到一定浓度，但还没有高到能够活化R使其起阻遏作用的程度时，产生色氨酸合成酶类的量已经明

43、显降低，而且产生的酶量与色氨酸浓度呈负相关。这种现象与trp操纵子另一种称衰减作用衰减作用（attenuation）的转录调控机制有关，衰减作用是一种将翻译与转录联系在一起的转录调控形式。 在trp mRNA 5-端Ptrp-O与第一个结构基因trpE的起始密码之间有一个长162 bp的DNA序列称为前导序列前导序列（leading sequence，L），其中第123150位核苷酸如果缺失，trp基因的表达水平可提高6倍。研究发现，当mRNA开始合成后，除非培养基中完全不含色氨酸，否则转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录。这个区域被称为衰减子衰减

44、子(Attenuator) 或弱化子。衰减子转录物中具有4段特殊的序列，能配对形成发夹结构，并含有两个相邻的色氨酸密码子，这是衰减调控机制的基础。 色氨酸操纵子的结构基因受到两种方式调控，一种是阻遏蛋白阻遏蛋白TrpR的负调控的负调控，这是粗调节。另一种方式是在转录水平上，通过核糖体对mRNA前导序列的结合，对转录终止进行调控，即通过弱化子进行调控弱化子进行调控，这是细调节。 阻遏-操纵机制对色氨酸来说是一个一级开关，主管转录是否启动，相当于粗调开关。trp操纵子中对应于色氨酸生物合成的还有另一个系统进行细调控，指示已经启动的转录是否继续下去。这个细微调控是通过转录达到第一个结构基因之前的过早

45、终止来实现的，由色氨酸色氨酸的浓度的浓度来调节这种过早终止的频率。衰减机制衰减机制7.3.2弱化子与前导肽弱化子与前导肽n1 弱化子弱化子 n 在trp mRNA 5端trpE基因的起始密码前有一个长162bp的mRNA片段被称为前导区，研究发现，当mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在123150这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录。因为转录终止发生在这一区域，并且这种终止是被调节的，这个区域就被称为弱化子弱化子。该区mRNA通过自我配对可以形成茎-环结构，有典型的终止子特点。n 能够形成转录终止结构,通过转录终止作用来阻遏操纵子基因

46、表达的那一段核苷酸被称为弱化子或弱化子或衰减子衰减子(attenuator)。前导区中的某些区段富含GC，GC区段之间容易形成茎环二级结构，接着有8个U的区段构成一个不依赖于因子的终止信号，能使mRNA合成提前终止，只产生139个核苷酸长度的前导RNA。2.2.前导肽前导肽n分析前导肽序列，发现它包括起始密码子AUG和终止密码子UGA，编码了一个14个氨基酸的多肽。该多肽有一个特征，其第10位和11位有相邻的两个色氨酸密码子。正是这两个相连的色氨酸密码子（组氨酸、苯丙氨酸操纵子中都有这种现象）调控了蛋白质的合成。前导区中含有并列的二个色氨酸密码子二个色氨酸密码子。在其它氨基酸生物合成有关酶类的

47、操纵子中也有类似情况。亮氨酸操纵子前导序列中有4个相邻的亮氨酸密码子，组氨酸中有7个。3.mRNA3.mRNA前导区序列分析前导区序列分析A. 当(3)区和(4)区构成转录终止信号的发夹结构时，（1）区和（2）区序列构成另一个发夹结构。B.（3）区也可以与（2）区互补形成发夹结构，从而阻碍（3）与（4）区之间形成发夹结构，即不形成转录终止信号。4.4.转录的弱化作用转录的弱化作用n 当培养基中色氨酸的浓度很低时，负载有色氨酸的tRNAtrp也就少，这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp密码子处），这时的前导区结构是2-3

48、配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到将trp操纵子中的结构基因全部转录。n 当培养基中色氨酸浓度较高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前就到达2区，使2-3区不能配对，3-4区自由配对形成茎环终止子结构，转录被终止，trp操纵子被关闭。 因为在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，当培养基中色氨酸的浓度很低时，生成的tRNATrp-色氨酸量就少，翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢，赶不上RNA聚合酶沿DNA移动转录的速度，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp密码子处），这时前导区的片段1和2之间不能形成发夹结构，

49、2-3配对，不形成3-4配对的转录终止信号，所以转录可继续进行，直到将trp操纵子中的结构基因全部转录（图11-11b）。 当培养基中色氨酸浓度高时，tRNATrp浓度随之升高，核糖体沿mRNA翻译移动的速度加快，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可以自由配对形成茎-环状终止子结构，转录停止（图11-11c）。所以，弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。 细菌其他氨基酸合成系统的许多操纵子（如组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等操纵子）中也有类似的衰减子。衰减机制不仅能够把几种水平如DNA和

50、RNA的构象变化、mRNA上内部终止(衰减)子的重建以及核糖体上tRNA对终止密码的识别等统一起来，严格控制表达，是一种应答灵敏、调节灵活的多重调控方式。 细菌演化出衰减子调控系统的生物学意义可能是： 活性阻遏物和非活性阻遏物的转变可能较慢，而tRNA荷载与否可能更为灵敏。 氨基酸的主要用途是合成蛋白质，因而以tRNA荷载情况为标准来进行控制可能更为恰当。 为什么大多数操纵子又同时需要阻遏蛋白呢？因为衰减子系统需要先转录出前导肽mRNA，然后根据前导肽的翻译情况来决定mRNA是否继续转录，而当氨基酸含量丰富时，则无需转录而关闭mRNA的转录活性。也就是说，需要一个决定基础水平的控制系统。当细胞

51、内氨基酸高于某一水平时，可通过阻遏蛋白，而只有低于这一水平时，才需要用衰减子进行精细调节。 n 色氨酸操纵子的阻遏作用与衰减机制一起协同控制其基因表达，显然比单一的阻遏负调控系统更为有效。一方面，当有活性的阻遏物向无活性阻遏物的转变速度极低时，衰减系统能更迅速地作出反应，使色氨酸从较高浓度快速下降到中等浓度。另一方面，若外源色氨酸浓度实在太低，细菌本身又没有其他的内源性色氨酸合成体系，以致细菌难以支持自身的生长时，就需要有衰减体系加以调节，通过不终止mRNA的合成来增加Trp酶的合成，从而提高内源色氨酸的浓度。可见，衰减机制在控制基因产物的量和产物种类的配比上起着快速灵敏的调节作用，使操纵基因

52、表达更为精密、高效。如果色氨酸开始增多，即使不足以诱导阻遏蛋白结合操控元件，却足以使大量的mRNA提前终止。反之，当色氨酸减少时，即使失去了诱导阻遏蛋白的阻遏作用，但只要还可以维持前导肽的合成，仍继续阻止转录。这样可以保证色氨酸的合成维持在满足需要的水平，防止色氨酸堆积和过多的消耗能量。同时，使细菌能够优先将环境中的色氨酸消耗完，然后开始自身合成。 n 一般来说，可诱导的操纵子基因是一些编码糖分解的基因，这些糖平时含量很少，因此，E.coli总是利用更一般的能源物质葡萄糖来提供能量，所以这些操纵子常常是关闭的。但当生存条件发生变化，如葡萄糖缺乏而必须利用另一种糖作为能源时，就要打开这些基因。可

53、阻遏操纵子基因情况恰好相反，它们是一些合成各种细胞代谢过程中所必需的物质（如色氨酸）的基因，由于这些物质在生命过程中的重要地位，这些基因总是打开着的，当这些物质如色氨酸在细菌生活环境中含量较高时，操纵子关闭这些基因。 7.3.3trp操纵子弱化机制的实验依据操纵子弱化机制的实验依据n trpS5是温度敏感型突变株，它所编码的Trp-tRNAtrp合成酶只在30时有活性，42时无酶活性。比较野生型和突变型在42和30时，突变体的Trp操纵子与野生型一样受色氨酸浓度的调控。42时，突变体中Trp操纵子的表达不受色氨酸浓度的调控。n 另有一个缺失前导区及D基因的突变体（trpLD102），该细菌在有

54、色氨酸的培养基中仍有很高的色氨酸合成酶活性。 TrpED53中L不缺失（弱化子存在），trpLD102中L缺失（弱化子不存在），缺失前导区后的表达比有前导区的表达要高得多，充分说明trp操纵子的表达调控除阻遏作用外，还受到前导区的影响，失去了这个因素就失去了一个调控机制。 n细菌中为什么要有弱化子系统呢？ 一种可能是阻遏物从有活性向无活性的转变速度极低，需要有一个能更快地做出反应的系统，以保持培养基中适当的色氨酸水平。或者，弱化子系统主要是对外源色氨酸浓度做出反应。外源色氨酸浓度很低的信号虽然足以引起trp操纵子的去阻遏作用，但是这个信号还不足以很快引发内源色氨酸的合成。在这种环境下，弱化子就

55、通过抗终止的方法来增加trp基因表达，从而提高内源色氨酸浓度。n 那么为什么还要有阻遏体系呢？目前认为阻遏物的作用是当有大量外源色氨酸存在时，阻止非必需的先导mRNA的合成，它使这个合成系统更加经济7.4 7.4 其他操纵子的调控机制其他操纵子的调控机制7.4.1 半乳糖操纵子半乳糖操纵子n大肠杆菌半乳糖操纵子(galactose operon)包括3个结构基因： 异构酶异构酶(UDP-galactose-4epimerase,galE)， 半乳糖半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galactose transferase, galT)， 半乳糖激酶半乳糖激酶(galactos

56、e kinase, galk)。这3个酶的作用是使半乳糖变成葡萄糖-1-磷酸。GalR与galE、T、K及操纵区O等离得很远，而galR产物对galO的作用与lacI-lacO的作用相同。 gal操纵子的特点操纵子的特点： 它有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点开始转录； 它有两个O区，一个在P区上游-67-53，另一个在结构基因galE内部。n 因为半乳糖的利用效率比葡萄糖低，人们猜想葡萄糖存在时半乳糖操纵子不被诱导，但实际上有葡萄糖存在时，gal操纵子仍可被诱导。现已分离到一些突变株，其中一类突变株能在不含葡萄糖的培养基中高水平合成半乳糖代谢酶类（gal结构基因高效表达）；而另一类

57、突变株中gal基因的表达完全依赖于葡萄糖，培养基中如无葡萄糖存在，这些细菌的gal基因不表达，不合成半乳糖代谢酶类。 n分析gal操纵子P-O区的DNA序列发现，该操纵子确实存在两个相距仅5bp的启动子，可以分别起始mRNA的合成。每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点S1和S2。n 从S1起始的转录只有在培养基中无葡萄糖时，才能顺利进行，RNA聚合酶与S1的结合需要半乳糖、CAP和较高浓度的cAMP。从S2起始的转录则完全依赖于葡萄糖，高水平的cAMP-CRP能抑制由这个启动子起始的转录。当有cAMP-CRP时，转录从S1开始，当无cAMP-CRP时，转录从S2开始。n为什么为什么gal操

58、纵子需要两个转录起始位点？操纵子需要两个转录起始位点？n 半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的物质-尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大肠杆菌细胞壁合成的前体。在没有外源半乳糖的情况下，UDP-gal是通过半乳糖差向异构酶的作用由UDP-葡萄糖合成的，该酶是galE基因的产物。生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶。现在设想只有S1一个启动子，那么由于这个启动子的活性依赖于cAMP-CRP，当培养基中有葡萄糖存在时就不能合成异构酶。假如唯一的启动子是S2，那么，即使在葡萄糖存在的情况下，半乳糖也将使操纵子处于充分诱导状态，这无疑是一种浪费。无论从必要性或经济性考虑，都

59、需要一个不依赖于cAMP-CRP的启动子（S1）对高水平合成进行调节。7.4.2 7.4.2 阿拉伯糖操纵子阿拉伯糖操纵子n 细菌通过阿拉伯糖（arabinose，Ara）操纵子的调控，在葡萄糖缺乏时，能利用阿拉伯糖作为能源。阿拉伯糖操纵子含有araA、araB和araD三个结构基因，分别编码阿拉伯糖异构酶、核酮糖激酶和5-磷酸核酮糖差向异构酶，使阿拉伯糖转变为磷酸戊糖代谢的中间产物5-磷酸-木酮糖。阿拉伯糖操纵子还包括调节基因araC、操纵基因araO1、araO2以及启动子araP。AraC的结合位点叫araI (induction，I)。araC基因就在这个操纵基因的附近，并且使用自己的

60、启动子Pc (靠近araO1)以相反于结构基因araA、B、D的方向转录合成C蛋白。 C蛋白在ara操纵子中的3个不同部位结合，控制araO1、araO2和araI，与阿拉伯糖结合时是激活物，不与阿拉伯糖结合时是阻遏物（图11-8a）。与lac操纵子一样， ara操纵子的转录也受到CAP-cAMP调节，CAP蛋白的结合位点紧挨着ara操纵子的启动子。 阿拉伯糖araC基因编码的调控蛋白具有两种调控作用：与阿拉伯糖结合时被激活，结合到操纵基因上促进转录；不与阿拉伯糖结合时也结合到操纵基因上，但阻遏转录。这和乳糖操纵子不同，乳糖操纵子调节蛋白不与别乳糖结合时阻遏转录，但是一旦与之结合，并不像阿拉伯