保健食品安全性毒理学检验及评价

1、保健食品保健食品安全性毒理学安全性毒理学检验及评价检验及评价仲 伟 鉴上海市疾病预防控制中心2009.11第一部分第一部分中国保健食品简介中国保健食品简介保健食品定义保健食品定义 保健食品（保健食品（Functional FoodFunctional Food）系指具）系指具有调节人体生理功能、适宜特定人群食用、有调节人体生理功能、适宜特定人群食用、不以治疗为目的的一类食品。不以治疗为目的的一类食品。 特特 点点q 具有特定的保健功能；具有特定的保健功能；q 无毒副作用，食用安全；无毒副作用，食用安全；q 有别于食品和药品；有别于食品和药品；q 增强体质、预防疾病为主；增强体质、预防疾病为主；

2、q 适用于特定人群。适用于特定人群。特特 定定 功功 能能q 由国家管理部门指定由国家管理部门指定q 允许申报的功能目前有允许申报的功能目前有27种种q 27种以外的功能，生产企业在获得足够种以外的功能，生产企业在获得足够的技术资料后（包括评价方案，试验数据的技术资料后（包括评价方案，试验数据及结果）向有关管理部门提出受理申请，及结果）向有关管理部门提出受理申请，接受评审。接受评审。特特 定定 人人 群群q正常成人以外，包括婴幼儿、孕妇、乳正常成人以外，包括婴幼儿、孕妇、乳母、青少年、中老年、特殊工种的工作母、青少年、中老年、特殊工种的工作者以及常见病病人者以及常见病病人q对于营养保健有特殊的

3、需要对于营养保健有特殊的需要 膳食结构的不同膳食结构的不同 营养素需求的不同营养素需求的不同保健食品的发展历程保健食品的发展历程第一代保健食品第一代保健食品：在：在保健食品的管理方法保健食品的管理方法颁布颁布以前市场上已有的保健食品。以前市场上已有的保健食品。第二代保健食品第二代保健食品：经动物和人体实验证实具有某种：经动物和人体实验证实具有某种生理调节功能的食品。生理调节功能的食品。第三代保健食品第三代保健食品：不仅需要经人体及动物实验证实：不仅需要经人体及动物实验证实具有某种功能，而且需要研究提具有某种功能，而且需要研究提供该功能因子、含量及其作用机供该功能因子、含量及其作用机理。理。发发

4、 展展 趋趋 势势q根据新的疾病谱和健康问题，开发新的保健功能根据新的疾病谱和健康问题，开发新的保健功能q根据新的养生保健概念，开发新的保健功能根据新的养生保健概念，开发新的保健功能q根据现代营养科学理论，开发新的膳食有效成分根据现代营养科学理论，开发新的膳食有效成分q根据中医药理论，开发中药类有效成分根据中医药理论，开发中药类有效成分q根据生命科学理论，开发新的人体所需营养素根据生命科学理论，开发新的人体所需营养素保健食品开发中的注意点保健食品开发中的注意点q中草药中草药q新新资源资源q野生野生动植物及其产品动植物及其产品q核酸核酸类类q真菌真菌类类q益益生菌类生菌类q酶酶制剂、氨基酸螯合物

5、、金属硫蛋白以及直制剂、氨基酸螯合物、金属硫蛋白以及直接以微生物发酵的接以微生物发酵的中草药类中草药类q 中草药作为原料应注意中草药作为原料应注意：1.1.不能采用有明显毒副作用的中药材、不能采用有明显毒副作用的中药材、 获国家药政管理部门批准的中成药、获国家药政管理部门批准的中成药、 受国家中药保护的中药成方受国家中药保护的中药成方2.2.用量应控制在临床用量的用量应控制在临床用量的50%50%以下以下新资源类新资源类q 新资源作为原料时必须具备的有关资料新资源作为原料时必须具备的有关资料：1.1. 名称及国内外研究利用情况；名称及国内外研究利用情况；2.2. 名称、配方及生产工艺；名称、配

6、方及生产工艺；3.3. 产品成分（包括营养物质、有生物效应物质及有毒产品成分（包括营养物质、有生物效应物质及有毒有害物质等）的分析报告；有害物质等）的分析报告；4.4. 安全性毒理学评价报告或有关文献资料；安全性毒理学评价报告或有关文献资料；5.5. 个别地区有食用习惯的应提供有关食用历史的证明个别地区有食用习惯的应提供有关食用历史的证明资料；资料；6.6. 质量标准。质量标准。野生动植物及其产品野生动植物及其产品类类q 以野生动植物及其产品为原料的有关限制以野生动植物及其产品为原料的有关限制：1.1. 受保护的野生动物。受保护的野生动物。2.2. 禁止使用自然的、人工驯养繁殖或人工栽培的国家

7、禁止使用自然的、人工驯养繁殖或人工栽培的国家一级和自然的二级保护野生动植物及其产品。一级和自然的二级保护野生动植物及其产品。3.3. 人工驯养繁殖或人工栽培的国家二级保护野生动植人工驯养繁殖或人工栽培的国家二级保护野生动植物及其产品，国家保护的有益的或者有重要经济、物及其产品，国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物及其产品应提供省级科学研究价值的陆生野生动物及其产品应提供省级以上农业（渔业）、林业行政主管部门的批准文件。以上农业（渔业）、林业行政主管部门的批准文件。q 以野生动植物及其产品为原料的有关限制以野生动植物及其产品为原料的有关限制：4.4. 中华人民共和国林业植物

8、新品种保护名录中植物及中华人民共和国林业植物新品种保护名录中植物及其产品，如果该种植物已获其产品，如果该种植物已获“品种权品种权”，应提供该，应提供该种植物品种权所有人许可使用的证明；如该种植物种植物品种权所有人许可使用的证明；如该种植物尚未取得品种权，应提供国务院林业主管部门出具尚未取得品种权，应提供国务院林业主管部门出具的该种品种尚未取得品种权的证明。的该种品种尚未取得品种权的证明。5.5. 进口保健食品中使用进口保健食品中使用濒危野生动植物种国际贸易濒危野生动植物种国际贸易公约公约名录中动植物及其产品的，应提供国务院农名录中动植物及其产品的，应提供国务院农业（渔业）、林业行政主管部门批准

9、文件、进出口业（渔业）、林业行政主管部门批准文件、进出口许可证及海关的证明文件。许可证及海关的证明文件。野生动植物及其产品野生动植物及其产品类类核酸类核酸类q 核酸类保健食品申报时需提供的特殊资料核酸类保健食品申报时需提供的特殊资料：1.1. 具体成份名称、来源、含量；具体成份名称、来源、含量；2.2. 与所申报功能直接相关的科学文献依据；与所申报功能直接相关的科学文献依据；3.3. 企业标准中标出核酸各成份的含量、纯度和相应的企业标准中标出核酸各成份的含量、纯度和相应的定性、定量检测方法以及质量标准；定性、定量检测方法以及质量标准；4.4. 详细生产工艺（包括加工助剂名称、用量）；详细生产工

10、艺（包括加工助剂名称、用量）；5.5. 核酸原料纯度的检测报告。核酸原料纯度的检测报告。核酸类核酸类q 核酸类保健食品申报时的注意事项核酸类保健食品申报时的注意事项：1.1. 不得以单一的不得以单一的DNADNA或或RNARNA作为原料申报。作为原料申报。2.2. 单一原料纯度应大于单一原料纯度应大于8080。3.3. 功能申报范围暂限定为免疫调节功能。如申报其他功能，功能申报范围暂限定为免疫调节功能。如申报其他功能，需向卫生部提交申请并纳入审批范围后，方可申报。需向卫生部提交申请并纳入审批范围后，方可申报。4.4. 核酸成份的每日推荐食用量为核酸成份的每日推荐食用量为0.6g-1.2g0.6

11、g-1.2g。5.5. 不得以不得以“核酸核酸”命名。命名。6.6. 说明书及标签中的说明书及标签中的“不适宜人群不适宜人群”除按保健食品相关规除按保健食品相关规定标注外，应明确标注出定标注外，应明确标注出“痛风患者痛风患者”。真菌类真菌类q 真菌类保健食品的部分规定真菌类保健食品的部分规定 ：1.1. 生产企业应建立有关的档案资料。生产企业应建立有关的档案资料。2.2. 生产企业应具备相应的生产条件。生产企业应具备相应的生产条件。3.3. 对生产菌种及工艺变更的相应规定。对生产菌种及工艺变更的相应规定。4.4. 冠名规定。冠名规定。5.5. 发酵过程中，除培养基外，不得加入具有功效成分发酵过

12、程中，除培养基外，不得加入具有功效成分的动植物及其它物质。的动植物及其它物质。6.6. 不能使用经过基因修饰的菌种。不能使用经过基因修饰的菌种。益生菌类益生菌类q 益生菌类保健食品的部分规定益生菌类保健食品的部分规定：1.1. 生产用菌种应满足一定的条件。生产用菌种应满足一定的条件。2.2. 生产企业应具备的一定条件。生产企业应具备的一定条件。3.3. 菌种及生产工艺不得变更，否则产品必须重新申报。菌种及生产工艺不得变更，否则产品必须重新申报。4.4. 不提倡以液态形式生产活菌产品。不提倡以液态形式生产活菌产品。5.5. 在保存期内活菌数目不得少于在保存期内活菌数目不得少于 106cfu/mL

13、(g) 106cfu/mL(g) 。益生菌类益生菌类q 益生菌类保健食品的部分规定益生菌类保健食品的部分规定：6.6. 如需在特殊条件下保存，应在标签和说明书中标示如需在特殊条件下保存，应在标签和说明书中标示7.7. 所用菌种在其发酵过程中，除培养基外，不得加入所用菌种在其发酵过程中，除培养基外，不得加入具有功效成分的动植物及其物质具有功效成分的动植物及其物质8.8. 不能使用经过基因修饰的菌种不能使用经过基因修饰的菌种其他类别其他类别q 对酶制剂、氨基酸螯合物、金属硫蛋白以及对酶制剂、氨基酸螯合物、金属硫蛋白以及直接以微生物发酵为原料限制的部分规定直接以微生物发酵为原料限制的部分规定：1.1

14、. 未列入未列入食品添加剂使用卫生标准食品添加剂使用卫生标准或卫生部公告或卫生部公告名单中的食品添加剂新品种的酶制剂不得用于保健名单中的食品添加剂新品种的酶制剂不得用于保健食品的生产。食品的生产。2.2. 不再审批以金属硫蛋白为原料生产的保健食品。不再审批以金属硫蛋白为原料生产的保健食品。其他类别其他类别q 使用微生物发酵直接生产保健食品的，需提使用微生物发酵直接生产保健食品的，需提供的特殊资料供的特殊资料：1.1. 菌种来源及菌种检定报告菌种来源及菌种检定报告2.2. 菌种的毒力试验报告及安全性评价报告菌种的毒力试验报告及安全性评价报告 3.3. 国内外该菌种使用于食品生产的文献资料国内外该

15、菌种使用于食品生产的文献资料 4.4. 发酵终产物的质量标准（包括纯度、杂质成分及含发酵终产物的质量标准（包括纯度、杂质成分及含量）量） 其他类别其他类别q 使用氨基酸螯合物生产保健食品的，需提供使用氨基酸螯合物生产保健食品的，需提供的特殊资料的特殊资料：1.1. 提供明确的化学结构式、理化性质，配体与金属离提供明确的化学结构式、理化性质，配体与金属离子之比、游离元素和总元素之比。子之比、游离元素和总元素之比。 2.2. 提供定性、定量的检测方法及验证报告。提供定性、定量的检测方法及验证报告。3.3. 急性毒性试验加做停食急性毒性试验加做停食1616小时后空腹一次灌胃试验小时后空腹一次灌胃试验

16、和和3030天喂养试验的组织病理报告。天喂养试验的组织病理报告。4.4. 国内外使用于食品生产的文献资料。国内外使用于食品生产的文献资料。安全，无毒、副作用安全，无毒、副作用功能，保健功效功能，保健功效理化、微生物特性：理化、微生物特性： 有害成分物质和污染物有害成分物质和污染物毒理学特性：毒理学特性： 剂量反应（效应）关系剂量反应（效应）关系保健食品质量控制保健食品质量控制生物活性物质生物活性物质功效成分功效成分通过检验和评通过检验和评价，加以控制价，加以控制第二部分第二部分保健食品安全性毒理学保健食品安全性毒理学检验及评价检验及评价主主 要要 内内 容容q 检验评价依据检验评价依据q 审评

17、基本要求审评基本要求q 选择毒理学试验的基本原则选择毒理学试验的基本原则q 实验动物的选择实验动物的选择q 样品的预处理原则样品的预处理原则q 毒理学试验项目要点介绍毒理学试验项目要点介绍q毒理学安全性评价时应考虑的问题毒理学安全性评价时应考虑的问题q审评结论的判定审评结论的判定毒性及功能检验评价依据毒性及功能检验评价依据19961996年年3 3月卫生部月卫生部保健食品的管理方法保健食品的管理方法 保健食品的标准、功能评价、审批程序和监督管理办法保健食品的标准、功能评价、审批程序和监督管理办法19961996年年7 7月月GB15193GB15193食品安全性毒理学评价程序和方法食品安全性毒

18、理学评价程序和方法 卫生部卫生部保健食品功能学评价程序和检验方法保健食品功能学评价程序和检验方法 仅包含了仅包含了1212项功能检验及评价方法项功能检验及评价方法20012001年年7 7月月 卫生部卫生部保健食品功能学评价程序和检验方法保健食品功能学评价程序和检验方法 可受理和评价的功能调整到可受理和评价的功能调整到3131项项20032003年年2 2月卫生部月卫生部保健食品检验与评价技术规范保健食品检验与评价技术规范 将功能学、毒理学、功效成分及卫生指标检验评价方法三者合一将功能学、毒理学、功效成分及卫生指标检验评价方法三者合一审评的基本要求审评的基本要求1. 1. 配方配方 原（辅）料

19、、用量、理化性质原（辅）料、用量、理化性质2. 2. 剂量剂量 食用方法及用量食用方法及用量3. 3. 工艺工艺 规格化产品规格化产品 符合配方、工艺、质量标准符合配方、工艺、质量标准4. 4. 批号批号 注意批号是否一致注意批号是否一致, ,益生菌、奶制品等保质期短的除外益生菌、奶制品等保质期短的除外1. 1. 毒理学评价的四个阶段毒理学评价的四个阶段第一阶段：急性毒性试验第一阶段：急性毒性试验 经口急性毒性试验：经口急性毒性试验：LD50LD50，联合急性毒性，一次最大耐受量试验，联合急性毒性，一次最大耐受量试验第二阶段：遗传毒性试验，第二阶段：遗传毒性试验，3030天喂养试验，传统致畸试

20、验天喂养试验，传统致畸试验 遗传毒性试验：原核细胞和真核细胞，体内试验和体外试验相结合遗传毒性试验：原核细胞和真核细胞，体内试验和体外试验相结合AmesAmes或基因突变试验；微核试验或染色体畸变试验；精子畸变试验等或基因突变试验；微核试验或染色体畸变试验；精子畸变试验等第三阶段：亚慢性毒性试验第三阶段：亚慢性毒性试验 9090天喂养试验、繁殖试验、代谢试验天喂养试验、繁殖试验、代谢试验第四阶段：慢性毒性试验（包括致癌试验）第四阶段：慢性毒性试验（包括致癌试验）选择毒理学试验的基本原则选择毒理学试验的基本原则2.2.一般无需进行毒性试验的原料或成分一般无需进行毒性试验的原料或成分属于普通食品和

21、卫生部规定的药食同源的物质：属于普通食品和卫生部规定的药食同源的物质：q采用传统的工艺及食用方式采用传统的工艺及食用方式q水提取物，常规服用量，无不安全性报道水提取物，常规服用量，无不安全性报道q来源、工艺和质量符合国家要求的营养强化剂来源、工艺和质量符合国家要求的营养强化剂 或营养素补充剂或营养素补充剂选择毒理学试验的基本原则选择毒理学试验的基本原则3. 3. 需进行一阶段和三项致突变毒性试验的原料或成分需进行一阶段和三项致突变毒性试验的原料或成分 属于普通食品和卫生部规定的药食同源的物质且用水属于普通食品和卫生部规定的药食同源的物质且用水提以外的其它常用工艺生产的：提以外的其它常用工艺生产

22、的：（1 1）服用量与常规用量相同）服用量与常规用量相同 急性毒性、三项致突变试验急性毒性、三项致突变试验（2 2）服用量大于常规用量）服用量大于常规用量 还需加做还需加做3030天喂养试验，必要时进行传统致畸试天喂养试验，必要时进行传统致畸试验和第三阶段毒性试验验和第三阶段毒性试验选择毒理学试验的基本原则选择毒理学试验的基本原则4.4.需进行一、二阶段毒性试验的原料或成分需进行一、二阶段毒性试验的原料或成分q文献显示无危害，人群长期食用；文献显示无危害，人群长期食用；q具有国际性毒理学评价结果的已知的化学物质，产具有国际性毒理学评价结果的已知的化学物质，产 品质量规格与国外产品一致；品质量规

23、格与国外产品一致；q国外广泛食用且能提供安全性评价资料；国外广泛食用且能提供安全性评价资料；q卫生部规定允许使用的动植物及其提取物或微生物。卫生部规定允许使用的动植物及其提取物或微生物。选择毒理学试验的基本原则选择毒理学试验的基本原则5.5.需进行一至三阶段毒性试验的情况：需进行一至三阶段毒性试验的情况：q一、二阶段试验结果与国外产品不一致的一、二阶段试验结果与国外产品不一致的q国外少数国家或地区食用的原料或成分国外少数国家或地区食用的原料或成分q水提取物，大于常规服用量水提取物，大于常规服用量q用水提以外的其它常用工艺生产的，大于常规用量用水提以外的其它常用工艺生产的，大于常规用量选择毒理学

24、试验的基本原则选择毒理学试验的基本原则6.6.需进行一至四阶段毒性试验的原料和成分需进行一至四阶段毒性试验的原料和成分国内外均无食用先例国内外均无食用先例7.7.敏感指标及敏感试验的保健食品敏感指标及敏感试验的保健食品不同食用人群和（或）不同功能的保健食品不同食用人群和（或）不同功能的保健食品选择毒理学试验的基本原则选择毒理学试验的基本原则8.8.保健食品新原料保健食品新原料 保健食品新原料（以下简称新原料）是指不在保健食品新原料（以下简称新原料）是指不在国家食品药品监督管理局公布的可用于保健食品、国家食品药品监督管理局公布的可用于保健食品、卫生部公布或批准可以食用以及生产普通食品的范卫生部公

25、布或批准可以食用以及生产普通食品的范围内，拟用于保健食品的原料。围内，拟用于保健食品的原料。 国家食品药品监督管理局和国家有关部门规定国家食品药品监督管理局和国家有关部门规定的不可用于保健食品以及禁止使用的物品，不得作的不可用于保健食品以及禁止使用的物品，不得作为新原料。为新原料。选择毒理学试验的基本原则选择毒理学试验的基本原则 在已批准的保健食品中使用过，或卫生部已批准为在已批准的保健食品中使用过，或卫生部已批准为新资源食品的原料，符合以下情况的仍按新原料进行管新资源食品的原料，符合以下情况的仍按新原料进行管理：理：q未列入国家食品药品监督管理局公布的可用于保健食未列入国家食品药品监督管理局

26、公布的可用于保健食品的物品名单；品的物品名单；q尚未列入卫生部公布或批准的食品新资源或新资源食尚未列入卫生部公布或批准的食品新资源或新资源食品名单内；品名单内；q卫生部已批准为食品新资源或新资源食品，但保健食卫生部已批准为食品新资源或新资源食品，但保健食品注册申请人与食品新资源或新资源食品生产批件中载品注册申请人与食品新资源或新资源食品生产批件中载明的申报单位不一致。明的申报单位不一致。选择毒理学试验的基本原则选择毒理学试验的基本原则新原料安全性毒理学试验项目的选择新原料安全性毒理学试验项目的选择 无食用史无食用史 需做四阶段试验需做四阶段试验 局部地区有食用史局部地区有食用史 需做三阶段试验

27、需做三阶段试验 其中其中 ，100100倍倍 摄入量摄入量300300倍倍 需做第四阶段试验需做第四阶段试验 有食用史有食用史 需做二阶段试验需做二阶段试验 经评价后经评价后 下一阶段试验下一阶段试验 广泛食用的原料广泛食用的原料 二阶段试验二阶段试验 （食用史包括地区、年代、人群、食用量、频率等情况）（食用史包括地区、年代、人群、食用量、频率等情况）选择毒理学试验的基本原则选择毒理学试验的基本原则新原料安全性毒理学试验项目的选择新原料安全性毒理学试验项目的选择 已知化学物已知化学物: : -1 -1 可只做二阶段实验的包括可只做二阶段实验的包括 已有权威机构进行系统的毒理学安全性评价已有权威

28、机构进行系统的毒理学安全性评价 有资料证明所用原料与其一致有资料证明所用原料与其一致 -2 -2 如试验结果与权威机构进行的评价不一致，如试验结果与权威机构进行的评价不一致，需进入下阶段的试验需进入下阶段的试验 有新原料的保健食品有新原料的保健食品: : 根据试验结果综合分析。根据试验结果综合分析。选择毒理学试验的基本原则选择毒理学试验的基本原则对受试保健食品的要求对受试保健食品的要求q 单一已知化学成分，应提供物理和化学性质单一已知化学成分，应提供物理和化学性质q 多种原料的配方产品，应提供配方多种原料的配方产品，应提供配方q 配方产品，必要时还应提供各组分，功效成分的配方产品，必要时还应提

29、供各组分，功效成分的 q 物理和化学性质及其检测报告物理和化学性质及其检测报告q 提供原料来源、生产工艺、人的可能摄入量。使提供原料来源、生产工艺、人的可能摄入量。使q 用说明书等有关资料用说明书等有关资料q 受试物应符合既定配方和生产工艺的规格化产品受试物应符合既定配方和生产工艺的规格化产品实验动物的选择及给样量实验动物的选择及给样量1.1.根据各项实验的具体要求，合理选择实验动物根据各项实验的具体要求，合理选择实验动物 常用大鼠和小鼠，品系不限，推荐使用近交系。常用大鼠和小鼠，品系不限，推荐使用近交系。2.2.动物应符合动物应符合实验动物管理条例实验动物管理条例 清洁级或清洁级以上清洁级或

30、清洁级以上 动物合格证号及动物实验室合格证号动物合格证号及动物实验室合格证号3.3.灌胃量灌胃量 大鼠：大鼠：10 ml/kg10 ml/kgBWBW（若以水为溶剂，推荐（若以水为溶剂，推荐 20 ml/kg20 ml/kgBWBW） 小鼠：小鼠：20ml/kg20ml/kgBWBW样品的预处理原则样品的预处理原则1.1.介质的选择介质的选择 应选择适合于受试动物的溶剂、乳化剂、助悬剂，要求无毒、应选择适合于受试动物的溶剂、乳化剂、助悬剂，要求无毒、与受试物不发生反应、稳定性好。与受试物不发生反应、稳定性好。 常用的介质有：蒸馏水、食用植物油、淀粉、明胶及羧甲基常用的介质有：蒸馏水、食用植物油

31、、淀粉、明胶及羧甲基纤维素等。纤维素等。2.2.液体类液体类 受试物浓缩倍数应符合试验要求。受试物浓缩倍数应符合试验要求。 浓缩方法不应破坏其有效成份，常用的有浓缩方法不应破坏其有效成份，常用的有60607070减压或减压或常压蒸发、冷冻干燥。常压蒸发、冷冻干燥。 按工艺要求。按工艺要求。样品的预处理原则样品的预处理原则3.3.袋泡茶类袋泡茶类 处理方法与产品推荐饮用方法相同处理方法与产品推荐饮用方法相同 推荐用：推荐用：80-90 80-90 常压用水浸泡常压用水浸泡30min30min 水量为受试物的水量为受试物的1010倍，提取倍，提取2 2次，次，2 2次提取液合并浓缩至次提取液合并浓

32、缩至所需浓度所需浓度 标明该浓缩液与受试物的比例标明该浓缩液与受试物的比例样品的预处理原则样品的预处理原则4.4.含乙醇类含乙醇类（1 1）不需浓缩的受试物）不需浓缩的受试物 乙醇浓度乙醇浓度151515 乙醇浓度应调至乙醇浓度应调至1515（2 2）需浓缩的受试物）需浓缩的受试物 乙醇浓度乙醇浓度151515 浓缩后调至浓缩后调至1515乙醇浓度乙醇浓度 在进行乙醇浓度调整时必须用原酒基在进行乙醇浓度调整时必须用原酒基样品的预处理原则样品的预处理原则5.5.膨胀系数较高的受试物膨胀系数较高的受试物 选择可溶性介质选择可溶性介质 给受试物的方法：灌胃给受试物的方法：灌胃 其最高浓度最大灌胃量时

33、达不到人体推荐量的其最高浓度最大灌胃量时达不到人体推荐量的100100倍，倍，按实际达到的倍数按实际达到的倍数 标明受试物的膨胀系数标明受试物的膨胀系数样品的预处理原则样品的预处理原则6.6.益生菌等微生物类保健食品益生菌等微生物类保健食品 在进行在进行 AmesAmes试验或体外细胞试验时需将受试物灭活。试验或体外细胞试验时需将受试物灭活。 需浓缩的应采用低温干燥法或由企业提供所需浓度的受试物（附方需浓缩的应采用低温干燥法或由企业提供所需浓度的受试物（附方法、技术参数）。法、技术参数）。7.7.以食品为载体的受试物以食品为载体的受试物 （1 1）有营养价值：按设计量进行饲料的营养成份调整，提

34、供详细的说）有营养价值：按设计量进行饲料的营养成份调整，提供详细的说明。明。 （2 2）大豆蛋白、乳清蛋白）大豆蛋白、乳清蛋白 如质量、工艺等符合食品标准和安全要求，允许去除。如质量、工艺等符合食品标准和安全要求，允许去除。 如仅以该原料生产的，可申请免做毒理学试验。如仅以该原料生产的，可申请免做毒理学试验。毒理学试验项目要点介毒理学试验项目要点介绍绍q 急性经口毒性试验急性经口毒性试验q 鼠伤寒沙门氏菌（鼠伤寒沙门氏菌（AmesAmes）试验）试验q 骨髓细胞微核试验骨髓细胞微核试验q 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验q 小鼠精子畸形试验小鼠精子畸形试验q 小鼠睾

35、丸染色体畸变试验小鼠睾丸染色体畸变试验q 3030天喂养试验天喂养试验急性经口毒性试验急性经口毒性试验目的：目的：测定测定LDLD5050，毒性分级。了解毒性强度、性质和可能的靶，毒性分级。了解毒性强度、性质和可能的靶器官，为进一步的毒性试验提供剂量和观察指标的选择依据。器官，为进一步的毒性试验提供剂量和观察指标的选择依据。原理：原理：急性毒性：经口一次性、急性毒性：经口一次性、24h24h内多次给予，短时间内的毒性反内多次给予，短时间内的毒性反应。致死剂量通常用半数致死剂量应。致死剂量通常用半数致死剂量LDLD5050表示。表示。急性联合毒性：两种或两种以上的受试物，可能发生拮抗、相急性联合

36、毒性：两种或两种以上的受试物，可能发生拮抗、相加或协同的联合方式，可以根据一定的公式计算和判定标准来加或协同的联合方式，可以根据一定的公式计算和判定标准来确定这三种不同的作用。确定这三种不同的作用。急性经口毒性试验急性经口毒性试验时间周期时间周期：一般为：一般为3 3周周 3-53-5天，大、小鼠适应期天，大、小鼠适应期 7-147-14天，染毒及实验观察期天，染毒及实验观察期 发生动物死亡时，应进行大体解剖发生动物死亡时，应进行大体解剖观察和评价指标观察和评价指标：毒性反应症状：各器官系统的反常表现（中枢、自主神经、呼毒性反应症状：各器官系统的反常表现（中枢、自主神经、呼吸、心血管、胃肠、生

37、殖泌尿系统、皮毛、粘膜等）及体重变吸、心血管、胃肠、生殖泌尿系统、皮毛、粘膜等）及体重变化化死亡情况：死亡的时间、数量、性别、表现等。死亡情况：死亡的时间、数量、性别、表现等。大体尸检结果：如果发生死亡动物大体尸检结果：如果发生死亡动物急性毒性（急性毒性（LDLD5050）剂量分级表）剂量分级表级级 别别大鼠口服大鼠口服LD50， mg/kg相当于人的致死量相当于人的致死量mg/kgg/人人极毒极毒150005000002500急性经口毒性试验急性经口毒性试验试验结果的判定：试验结果的判定：1. LD501. LD50人可能摄入量的人可能摄入量的100100倍，放弃；反之继续下倍，放弃；反之继

38、续下一步试验。一步试验。2. LD502. LD5010g/kgbw10g/kgbw或按最大耐受量染毒而未出现动或按最大耐受量染毒而未出现动物死亡的，可继续下一步试验。物死亡的，可继续下一步试验。鼠伤寒沙门氏菌（鼠伤寒沙门氏菌（Ames）试验）试验目的：目的：检测受试物的诱变性，预测其遗传危害和潜在致癌作用的可检测受试物的诱变性，预测其遗传危害和潜在致癌作用的可能性。能性。 时间周期：时间周期：一般为一般为2 2周周 第一周，鼠伤寒沙门氏菌种、试剂、培养基准备第一周，鼠伤寒沙门氏菌种、试剂、培养基准备 第二周，染毒，培养第二周，染毒，培养48h48h，读平板，菌落计数，读平板，菌落计数剂量设计

39、：剂量设计：决定受试物最高剂量的因素是对细菌的毒性及其溶解度。决定受试物最高剂量的因素是对细菌的毒性及其溶解度。最低剂量为最低剂量为0.2ug/0.2ug/皿；最高剂量为皿；最高剂量为5mg/5mg/皿，或最大溶解剂量，最大皿，或最大溶解剂量，最大饱和剂量以及最小毒性剂量。可设五个剂量组，组间距不超过饱和剂量以及最小毒性剂量。可设五个剂量组，组间距不超过5 5倍。倍。同时设：阳性对照组，溶剂对照组和未处理对照组。同时设：阳性对照组，溶剂对照组和未处理对照组。鼠伤寒沙门氏菌（鼠伤寒沙门氏菌（Ames）试验）试验观察及评价指标：观察及评价指标： 各受试物组及三个对照组的四种菌株（各受试物组及三个对

40、照组的四种菌株（TA97aTA97a，TA98TA98，TA100TA100和和TA102TA102）分别在加和不加）分别在加和不加S9S9情况下的菌落计数。情况下的菌落计数。结果评价（掺入法）：结果评价（掺入法）： 受试物组回变菌落数增加一倍以上（即回变菌落数受试物组回变菌落数增加一倍以上（即回变菌落数22未处理对照组数），并有剂量反应关系或有可重复未处理对照组数），并有剂量反应关系或有可重复的阳性反应，即可判试验阳性。的阳性反应，即可判试验阳性。骨髓细胞微核试验骨髓细胞微核试验目的目的：检测整体动物体内骨髓嗜多染红细胞微核发生率，以评检测整体动物体内骨髓嗜多染红细胞微核发生率，以评价受试物

41、致突变的可能性。价受试物致突变的可能性。原理原理：微核是在细胞有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞微核是在细胞有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的色单体或染色体的形成细胞核时，仍然留在细胞质中的色单体或染色体的无着丝点断片无着丝点断片 。末期之后，单独形成一个或几个规则的。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞胞质内，因比主核小，故称为微核。次核，被包含在细胞胞质内，因比主核小，故称为微核。骨髓细胞微核试验骨髓细胞微核试验时间周期时间周期：一般为：一般为2 2周周 3-53-5天适应期天适应期 小鼠经口染毒，小鼠经口染毒，30h30h给受试物法给受

42、试物法 取胸骨或股骨，收集骨髓，涂片，染色，镜检取胸骨或股骨，收集骨髓，涂片，染色，镜检剂量设计剂量设计：至少设置：至少设置3 3个剂量，最高剂量组为动物出现严重中个剂量，最高剂量组为动物出现严重中毒表现和毒表现和/ /或个别动物出现死亡的剂量。低剂量组应不出现毒或个别动物出现死亡的剂量。低剂量组应不出现毒性反应。一般取性反应。一般取LD50LD50的的1/21/2、1/41/4、1/81/8作为三个剂量。当受试作为三个剂量。当受试物的物的LD5010g/kg.bwLD5010g/kg.bw时，最高剂量通常采用时，最高剂量通常采用10g/kg.bw10g/kg.bw。同。同时设阳性对照组和溶剂

43、对照组。时设阳性对照组和溶剂对照组。骨髓细胞微核试验骨髓细胞微核试验观察及评价指标观察及评价指标：每只动物计数每只动物计数10001000个嗜多染红细胞个嗜多染红细胞 ，记录含有微核的细，记录含有微核的细胞数，并计算微核千分率。观察嗜多染红细胞与成熟红胞数，并计算微核千分率。观察嗜多染红细胞与成熟红细胞的比例。细胞的比例。 结果评价结果评价：受试物组与对照组微核率相比，增高呈剂量反应关系并受试物组与对照组微核率相比，增高呈剂量反应关系并有统计学意义，试验结果为阳性。有统计学意义，试验结果为阳性。哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验目的目的：检测受试物对整体动物骨髓细胞染

44、色体畸变的致：检测受试物对整体动物骨髓细胞染色体畸变的致突变性，以评价其致突变的可能性。突变性，以评价其致突变的可能性。原理原理：当受试物作用于细胞周期：当受试物作用于细胞周期G1G1期和期和S S期时，可诱发期时，可诱发染色体型畸变，而作用于染色体型畸变，而作用于G2G2期时则诱发染色体单体型畸期时则诱发染色体单体型畸变。给动物腹腔注射秋水仙素，抑制细胞分裂时纺锤体变。给动物腹腔注射秋水仙素，抑制细胞分裂时纺锤体的形成，增加中期分裂相细胞的比例，并使染色体丝缩的形成，增加中期分裂相细胞的比例，并使染色体丝缩短、分散，轮廓清晰。在显微镜下便可观察染色体数目短、分散，轮廓清晰。在显微镜下便可观察

45、染色体数目和形态。和形态。哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验时间周期时间周期：一般为：一般为3 3周周 3-53-5天适应期天适应期 小鼠或大鼠经口染毒小鼠或大鼠经口染毒2-42-4次，每次间隔次，每次间隔24h24h，在，在末次染毒末次染毒18-24h18-24h进行取材（取材前进行取材（取材前2-4h2-4h，腹腔注射秋水，腹腔注射秋水仙素）。仙素）。 取股骨，收集骨髓，制片，染色，镜检取股骨，收集骨髓，制片，染色，镜检剂量设计剂量设计：同骨髓细胞微核试验：同骨髓细胞微核试验哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验观察及评价指标观察及评价指标：

46、每只动物分析每只动物分析100100个中期相细胞个中期相细胞 ，每个剂量组不少于，每个剂量组不少于10001000个。记录染色体数目及结构的改变。个。记录染色体数目及结构的改变。结果评价结果评价：受试物组与对照组染色体畸变率相比，增高呈剂量反应受试物组与对照组染色体畸变率相比，增高呈剂量反应关系并有统计学意义，试验结果为阳性。关系并有统计学意义，试验结果为阳性。小鼠精子畸形试验小鼠精子畸形试验目的目的：检测整体动物体内精子畸形发生率，以评价受试物对体检测整体动物体内精子畸形发生率，以评价受试物对体内生殖细胞的致突变作用。内生殖细胞的致突变作用。原理原理：小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遗传性，

47、许多常染小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遗传性，许多常染色体及色体及X X、Y Y性染色体基因决定精子形态。精子的畸形主性染色体基因决定精子形态。精子的畸形主要是指形态的异常，已知精子的畸形是决定精子形成的要是指形态的异常，已知精子的畸形是决定精子形成的基因发生突变的结果。因此形态的改变提示有关基因及基因发生突变的结果。因此形态的改变提示有关基因及其蛋白产物的改变。其蛋白产物的改变。小鼠精子畸形试验小鼠精子畸形试验时间周期时间周期：一般为：一般为7 7周周 3-53-5天适应期天适应期 小鼠经口连续染毒小鼠经口连续染毒5 5天，于首次给样后的天，于首次给样后的3535天处死动物天处死动物 取两

48、侧附睾，收集精子，滴片，染色，镜检取两侧附睾，收集精子，滴片，染色，镜检剂量设计剂量设计：同骨髓细胞微核试验：同骨髓细胞微核试验小鼠精子畸形试验小鼠精子畸形试验观察及评价指标观察及评价指标：每只动物检查每只动物检查10001000个精子个精子 ，记录精子畸形数目及，记录精子畸形数目及类型。类型。结果评价结果评价：受试物组与对照组精子畸变率相比，增高呈剂量反受试物组与对照组精子畸变率相比，增高呈剂量反应关系并有统计学意义，试验结果为阳性。应关系并有统计学意义，试验结果为阳性。小鼠睾丸染色体畸变试验小鼠睾丸染色体畸变试验目的目的：检测整体动物睾丸染色体畸变发生率，以评：检测整体动物睾丸染色体畸变发

49、生率，以评价受试物对整体哺乳动物睾丸生殖细胞的致突变性。价受试物对整体哺乳动物睾丸生殖细胞的致突变性。原理原理：不同周期的雄性生殖细胞对化学物质的敏感：不同周期的雄性生殖细胞对化学物质的敏感性不同，多数情况下化学诱变剂诱发染色体畸变必性不同，多数情况下化学诱变剂诱发染色体畸变必须经过须经过DNADNA复制期，故在前细线期处理。第复制期，故在前细线期处理。第121214d14d采样，以观察作用于前细线期引起的精母细胞染色采样，以观察作用于前细线期引起的精母细胞染色体畸变效应。体畸变效应。小鼠睾丸染色体畸变试验小鼠睾丸染色体畸变试验时间周期时间周期：一般为：一般为7 7周周 3-53-5天适应期天

50、适应期 小鼠经口连续染毒小鼠经口连续染毒5 5天，与首次给样后天，与首次给样后的的12-1412-14天处死动物取材，（取材前天处死动物取材，（取材前6h6h，腹腔注，腹腔注 射射秋水仙素）。取两侧睾丸，收集生殖细胞，滴片，秋水仙素）。取两侧睾丸，收集生殖细胞，滴片，染色，镜检染色，镜检剂量设计剂量设计：同骨髓细胞微核试验：同骨髓细胞微核试验小鼠睾丸染色体畸变试验小鼠睾丸染色体畸变试验观察及评价指标观察及评价指标：每只动物分析每只动物分析100100个中期相细胞个中期相细胞 ，记录染色体数目，记录染色体数目及结构的改变（包括断片、易位、畸变细胞率、常及结构的改变（包括断片、易位、畸变细胞率、常

51、染色体单价体、性染色体单价体等）。染色体单价体、性染色体单价体等）。结果评价结果评价：受试物组与对照组的断片、易位、畸变细胞率、常受试物组与对照组的断片、易位、畸变细胞率、常染色体单价体、性染色体单价体等差异有统计学意染色体单价体、性染色体单价体等差异有统计学意义，试验结果为阳性。义，试验结果为阳性。遗传毒性试验组合遗传毒性试验组合试验结果的判定试验结果的判定：如三项致突变试验（如三项致突变试验（AmesAmes试验，微核或骨髓细胞染试验，微核或骨髓细胞染色体畸变试验，精子畸形或睾丸染色体畸变试验）色体畸变试验，精子畸形或睾丸染色体畸变试验）中，体外或体内有一项或以上阳性，一般应放弃该中，体外

52、或体内有一项或以上阳性，一般应放弃该受试物用于保健食品。受试物用于保健食品。如三项试验均为阴性，则可继续进行下一步的毒性如三项试验均为阴性，则可继续进行下一步的毒性试验。试验。30天喂养试验天喂养试验目的目的：急性毒性试验的基础上，此试验可进一步了：急性毒性试验的基础上，此试验可进一步了解毒性作用，特别是观察对生长发育的影响，并可解毒性作用，特别是观察对生长发育的影响，并可初步估计最大观察到的无作用剂量，估计亚慢性摄初步估计最大观察到的无作用剂量，估计亚慢性摄入的危害性。入的危害性。原理原理： 以不同剂量受试物每日经口给予各组实验以不同剂量受试物每日经口给予各组实验动物，连续动物，连续3030

53、天。染毒期间每日密切观察动物的毒天。染毒期间每日密切观察动物的毒性反应，染毒结束后进行大体解剖、血生化及病理性反应，染毒结束后进行大体解剖、血生化及病理检查，以此观察重复喂食不同剂量的受试物对动物检查，以此观察重复喂食不同剂量的受试物对动物引起的有害作用。引起的有害作用。30天喂养试验天喂养试验时间周期时间周期：在获得了急性毒性数据后，一般为：在获得了急性毒性数据后，一般为2 2月月 3-53-5天，大鼠适应期天，大鼠适应期 3030天，染毒及实验观察期天，染毒及实验观察期 再进行大体解剖、血液、生化、器官病再进行大体解剖、血液、生化、器官病 理检查。理检查。30天喂养试验天喂养试验剂量设计剂

54、量设计：至少设三个剂量组和一个对照组。高剂量应：至少设三个剂量组和一个对照组。高剂量应能引起动物明显毒效应但不造成动物死亡。低剂量应不能引起动物明显毒效应但不造成动物死亡。低剂量应不出现任何毒作用，同时在这二剂量之间设几个中间剂量出现任何毒作用，同时在这二剂量之间设几个中间剂量组。组。 对于能获得对于能获得LD50LD50的受试物的受试物：最高剂量为：最高剂量为10102525的的LD50LD50，最低剂量组至少为人可能摄入量的，最低剂量组至少为人可能摄入量的3 3倍。倍。 对于不能获得对于不能获得LD50LD50的受试物的受试物：最高剂量为人可能摄：最高剂量为人可能摄入量的入量的100100

55、倍，或按最大灌胃剂量或在饲料中的最大掺倍，或按最大灌胃剂量或在饲料中的最大掺入量。入量。30天喂养试验天喂养试验观察及评价指标观察及评价指标：一般情况观察一般情况观察：每日的表现、行为、中毒和死亡情况。每周：每日的表现、行为、中毒和死亡情况。每周1 1次体重及次体重及2 2次食物摄入量，计算食物利用率。次食物摄入量，计算食物利用率。血液学指标血液学指标：喂养结束后测定血红蛋白、红和白细胞总数及：喂养结束后测定血红蛋白、红和白细胞总数及分类，必要时测定血小板或网织红细胞数等指标。分类，必要时测定血小板或网织红细胞数等指标。生化学指标生化学指标：喂养结束后测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿：喂养结束后

56、测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌肝、血糖、白蛋白、总蛋白、胆固醇和甘油三酯。素氮、肌肝、血糖、白蛋白、总蛋白、胆固醇和甘油三酯。病理检查病理检查：大体解剖、脏器称重、组织病理学检查。：大体解剖、脏器称重、组织病理学检查。30天喂养试验天喂养试验试验结果的判定试验结果的判定： 对于只要求进行一、二阶段试验者，最大未观察到有害对于只要求进行一、二阶段试验者，最大未观察到有害作用剂量作用剂量人可能摄入量的人可能摄入量的100100倍，综合其它试验结果可初倍，综合其它试验结果可初步做出安全性评价。步做出安全性评价。 最小观察到有害作用剂量最小观察到有害作用剂量人可能摄入量的人可能摄入量的1001

57、00倍，或倍，或观察到毒性反应的最小剂量组其受试物在饲料中比例观察到毒性反应的最小剂量组其受试物在饲料中比例1010，放弃。放弃。 在中低剂量组中个别指标与对照组相比有差异，应综合在中低剂量组中个别指标与对照组相比有差异，应综合分析，决定取舍或进行下一步毒理试验。分析，决定取舍或进行下一步毒理试验。其它试验结果判断其它试验结果判断q 传统致畸试验传统致畸试验： 需大于或等于人摄入量的需大于或等于人摄入量的100100倍。在倍。在5050倍至倍至100100倍之间需倍之间需进行安全性评价，小于进行安全性评价，小于5050倍需放弃。倍需放弃。q 9090天喂养试验、繁殖试验天喂养试验、繁殖试验：1

58、.1.仅在国外少数国家或国内局部地区有食用历史的原料或成仅在国外少数国家或国内局部地区有食用历史的原料或成分，需大于或等于人摄入量的分，需大于或等于人摄入量的100100倍。倍。2.2.国内外均无食用历史的原料或成分时，需大于或等于人摄国内外均无食用历史的原料或成分时，需大于或等于人摄入量的入量的300300倍。在倍。在100100倍至倍至300300倍之间需进行慢性毒性试验，倍之间需进行慢性毒性试验，小于小于100100倍需放弃。倍需放弃。其它试验结果判断其它试验结果判断q 慢性毒性试验慢性毒性试验： 以以LD50LD50或或3030天喂养试验的最大未观察到有害作用剂量设计受试天喂养试验的最

59、大未观察到有害作用剂量设计受试物各剂量组，未见有毒性作用。物各剂量组，未见有毒性作用。q 致癌试验阳性判定依据致癌试验阳性判定依据：肿瘤只发生在实验组动物，对照组中无肿瘤发生肿瘤只发生在实验组动物，对照组中无肿瘤发生。实验组和对照组均发生肿瘤，但实验组发生率高实验组和对照组均发生肿瘤，但实验组发生率高。实验组和对照组肿瘤发生率无明显差异，但实验组发生时间较早实验组和对照组肿瘤发生率无明显差异，但实验组发生时间较早。符合以上三项中的情况之一，并经统计学处理有统计学意义，可认符合以上三项中的情况之一，并经统计学处理有统计学意义，可认为致癌试验阳性为致癌试验阳性。安全性评价的科学性和艺术性安全性评价

60、的科学性和艺术性安全性评价的艺术性安全性评价的艺术性：1.1.动物实验结果外推到人必须考虑动物与人的种属差异；动物实验结果外推到人必须考虑动物与人的种属差异；2.2.安全性标准与社会经济基础、技术能力的相符性；安全性标准与社会经济基础、技术能力的相符性；3.3.安全性标准与社会和公众利益之间的平衡性。安全性标准与社会和公众利益之间的平衡性。结论结论：在对化学物质进行科学地安全性评价之后，应结合试：在对化学物质进行科学地安全性评价之后，应结合试验的局限性，社会经济状况，人们的生活习惯等因素，对评验的局限性，社会经济状况，人们的生活习惯等因素，对评价结果作出一个合理的分析，为卫生标准的制定提供具有