细胞分子生物学研究方法class

1、miRNA and RNAi regulation 一、一、miRNA 发现的背景发现的背景重点掌握： 1.miRNA的发生的发生 2.miRNA的调控的调控 3.miRNA的研究思路的研究思路1. 含有含有30亿对碱基的人类基因组仅含有亿对碱基的人类基因组仅含有23万万个蛋白质基因，是果蝇的两倍，啤酒酵母的个蛋白质基因，是果蝇的两倍，啤酒酵母的4倍。显而易见，倍。显而易见，。2. 人类基因组的蛋白质编码区的总和占总基因组人类基因组的蛋白质编码区的总和占总基因组长度为长度为12，那么其他，那么其他呢？当然，在这呢？当然，在这98的非蛋白质编码的非蛋白质编码基因组序列里，约基因组序列里，约24为

2、插入编码序列的内为插入编码序列的内含子序列；人类基因平均每个基因有含子序列；人类基因平均每个基因有7个内含个内含子。子。人类基因组草图带给科学家们的困惑人类基因组草图带给科学家们的困惑人类基因组绝大部分都被转录成人类基因组绝大部分都被转录成RNA，细胞内非编码，细胞内非编码RNA的的数量是编码数量是编码RNA的上百倍。这促使许多科学家认为生物体复的上百倍。这促使许多科学家认为生物体复杂性被隐藏在它们所输出的非编码杂性被隐藏在它们所输出的非编码RNA内，而非编码序列内。内，而非编码序列内。表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因

3、表达了可遗传的变化的一门遗传学分支学科。基因表达了可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传的现象已知的有表观遗传的现象已知的有DNADNA甲基化甲基化（DNA DNA methylationmethylation），），基因组印记基因组印记 ，miRNAmiRNA等。等。 表观遗传学是研究基因的表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发核苷酸序列不发生改变生改变的情况下，的情况下，基因表达了可遗传的变基因表达了可遗传的变化化的一门遗传学分支学科。的一门遗传学分支学科。 表观遗传的现象已知的有表观遗传的现象已知的有DNA甲基化甲基化（DNA methylation），），miRNA等。等。The d

4、iscovery of miRNAsGary RuvkunThe first discoered miRNA: lin-4Ruvkun G, Wightman B, Ha I. The 20 years it took to recognize the importance of tiny RNAs. Cell. 2004 Jan 23;116 (2 Suppl):S93-6.Lee R, Feinbaum R, Ambros V. A short history of a short RNA. Cell. 2004 Jan 23;116 (2 Suppl):S89-92Breakthroug

5、h with BlastN of the second miRNA (stRNA) let-7Pasquinelli AE, Reinhart BJ, Slack F, Martindale MQ, Kuroda MI, Maller B, Hayward DC, Ball EE, Degnan B, Muller P, Spring J, Srinivasan A, Fishman M, Finnerty J, Corbo J, Levine M, Leahy P,Davidson E, Ruvkun G. Conservation of the sequence and temporal

6、expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 2000 Nov 2;408(6808):86-9.microRNAs had been neglected for so many years because of their small size. . miRNAs have been found (The miRBase Sequence Database). These miRNAs are from primates, rodents, birds, fish, worms, flies, plants and vir

7、uses. The data are freely available to all through the web interface at http:/microrna.sanger.ac.uk/sequences/ and in flatfile form from ftp:/ftp.sanger.ac.uk/pub/mirbase/sequences/. There are about 500 miRNAs from human have been found and annotated. They are named as x.一、一、miRNA生成和调控生成和调控（一）（一）. M

8、icroRNA (miRNA) & its processing微小微小RNA及其加工及其加工Pri-miRNA(miRNA初级转初级转录产物录产物)pre-miRNA(miRNA前体前体) miRNAExportin 5 (Exp5) transports pre-miRNA to the cytoplasmPri-miRNAs bear the 5 cap and 3 poly(A) tails1. A typical metazoan consists of a stem of approximately 33 bp, with a terminal loop and flank

9、ing segments. 2. The terminal loop is unessential, whereas . 3. The cleavage site is determined mainly by the distance (approximately 11 bp) from the stem-ssRNA junction.Han et al., Cell 125, 887901, June 2, 2006（二）（二）. MicroRNA (miRNA) targets and regulation. 一个一个miRNA可以调控多个靶基因，一个靶可以调控多个靶基因，一个靶基因可由

10、多个基因可由多个miRNA进行调控进行调控 miRNA与与mRNA的的3UTR区结合，与区结合，与mRNA的的ORF区也可以结合。区也可以结合。（三）（三）MicroRNA在发育中的调控作用，在发育中的调控作用，及其他作用及其他作用Victor R. Ambros秀丽线虫秀丽线虫 C. elegans1. miRNA in C. elegans development control the developmental time of C. elegans. allows C. elegans to proceed to the late developmental stage2. miRNA

11、s in vertebrate development: There are a lot unknown because the the lack of efficient methods to uncover the targets of miRNAs.Figure 2. miR-124a is restrictedly expressed in the brain and the spinal cord in fish and mouse or to the ventral nerve cord in the fly. The expression of miR-1 is restrict

12、ed to the muscles and the heart in the mouse. 青鳉青鳉斑马鱼斑马鱼小鼠小鼠果蝇果蝇Learning the miRNA function from its expression pattern3. miRNA controls plant phenotypes (控制植物表型特征控制植物表型特征) Jaw-miRNA 控制拟南芥叶形变化(Nature, 2003)( Science 2004)3 3种种miRNAmiRNA控制造血干细胞向淋巴细胞的分化过程控制造血干细胞向淋巴细胞的分化过程4. miRNA controls the differen

13、tiation of the hematopoietic stem cell (调控造血调控造血干细胞的分化干细胞的分化)生物信息预测生物信息预测 PicTar (http:/pictar.mdcberlin) TargetScan () miRBase Targets ().二、研究思路二、研究思路 生物信息预测生物信息预测 Real time RT-PCR Western 双荧光报告系统验证双荧光报告系统验证 miRNA的表达上调的表达上调 miRNA的表达下调的表达下调 质粒转入细菌中成为质粒转入细

14、菌中成为“转化转化” 质粒转入真核细胞中则称为质粒转入真核细胞中则称为“转染转染”3. Real time RT-PCR （SYBR Green I） 嵌合荧光染料检测法嵌合荧光染料检测法 (SYBR Green I)SYBR (SYBR Green I)SYBR Green IGreen I是荧光定量是荧光定量PCRPCR最常用的最常用的DNADNA结合染料，能结合染料，能与与双链双链DNADNA非特异性非特异性结合，结合，结合后发出结合后发出荧光，可以荧光，可以通过检测反应体系中的通过检测反应体系中的SYBR Green I SYBR Green I 荧光强度，荧光强度，达到检测达到检测P

15、CRPCR产物扩增量的目的。产物扩增量的目的。4. 双标记荧光探针法双标记荧光探针法 双标记荧光探针法双标记荧光探针法:使用使用5端带有荧光物质（如：端带有荧光物质（如：FAM等等)，3端带有淬灭物质（如端带有淬灭物质（如:TAMRA等）的双标记荧光探针进等）的双标记荧光探针进行荧光检测的方法。当探针完整时，行荧光检测的方法。当探针完整时，5端的荧光物质受到端的荧光物质受到3端的淬灭物质的制约，不能发出荧光。而当双标记荧光端的淬灭物质的制约，不能发出荧光。而当双标记荧光探针被分解后，探针被分解后，5端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。 当当PCR反应液中加入

16、荧光探针后，在反应液中加入荧光探针后，在PCR反应的退火过反应的退火过程中，程中，荧光探针便会和模板杂交荧光探针便会和模板杂交。进一步在。进一步在PCR反应的延反应的延伸过程中，伸过程中，Taq DNA聚合酶的聚合酶的53Exonuclease（外切（外切核酸酶）核酸酶）活性活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度，可以达物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测到检测PCR产物扩增量的目的。产物扩增量的目的。Real time RT-PCR (TaqMan 探针）探针）猝灭剂猝灭剂 小沟粘结剂小沟

17、粘结剂During PCR, the TaqMan MGB probe anneals specifically to acomplementary sequence between the forward and reverse primer sitesWhen the probe is intact (Figures 3 and 4), the proximity of thereporter dye to the quencher dye results in suppression of the reporter fluorescenceThe DNA polymerase cleav

18、es only probes that are hybridized to thetarget. Cleavage separates the reporter dye from thequencher dye; the separation of the reporter dye from the quencherdye results in increased fluorescence by the reporter. The increase influorescence signal occurs only if the target sequence iscomplementary

19、to the probe and is amplified during PCR. Because ofthese requirements, nonspecific amplification is not detected.Polymerization of the strand continues, but because the 3 end of theprobe is blocked, there is no extension of the probe during PCR5. western blot抗体（也就是免疫球蛋白）的基本结构抗体（也就是免疫球蛋白）的基本结构免疫球蛋白，

20、包括免疫球蛋白，包括IgA, IgD, IgE, IgG 和和 IgMIgD, IgE, IgG是单体结构，是单体结构，IgA是二聚体结构，是二聚体结构，IgM是五聚体结构是五聚体结构 各种抗体共同的基本结构都包括各种抗体共同的基本结构都包括2条轻链和条轻链和2条重链，条重链，Fab和和Fc段段FabFc heavy chainlight chainantigen binding site 由一条完由一条完整的整的轻链轻链和重链的和重链的VH 和和CH1 结构结构域域组成组成 PVDF膜表面有膜表面有很多洞洞很多洞洞，通过电转，通过电转， 胶上的蛋白被转移到胶上的蛋白被转移到了膜上，蛋白以了膜

21、上，蛋白以机械填补（堆积）和吸附机械填补（堆积）和吸附的方式结合于表面。的方式结合于表面。 电转后的电转后的NC或或PVDF膜上，有很多空白区，这些洞洞并没有膜上，有很多空白区，这些洞洞并没有填进东西，而抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样填进东西，而抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样就会有很多非特异的信号。就会有很多非特异的信号。封闭液中的蛋白封闭液中的蛋白可以与表面上的空白位置结合，同样以机械可以与表面上的空白位置结合，同样以机械填补（堆积）和吸附覆盖的方式结合在膜上，以避免一抗的填补（堆积）和吸附覆盖的方式结合在膜上，以避免一抗的非特异结合，所以起非特异结合，所以起“封闭封闭”

22、的作用。这样抗体就不会被非的作用。这样抗体就不会被非特异性的吸附到膜上，而特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。只会跟特异性蛋白结合。封闭剂封闭剂应封闭所有的未结合位点而应封闭所有的未结合位点而不替换表面不替换表面上的靶蛋白、上的靶蛋白、不结合靶蛋白表位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应不结合靶蛋白表位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应封闭原理封闭原理底物化学发光底物化学发光ECL ,反应底物为过氧化物反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到鲁米诺，如遇到HRP，即发光，即发光，可使胶片曝光，可显影出条带。可使胶片曝光，可显影出条带。辣根过氧化物酶在催化过氧化氢的情况下，鲁米诺底物被氧化而产生的发

23、辣根过氧化物酶在催化过氧化氢的情况下，鲁米诺底物被氧化而产生的发光反应光反应 激光共聚焦扫描显微镜激光共聚焦扫描显微镜(confocal scanning fluorescence microscope )同样的成纤维细胞的三种细胞骨架成分同样的成纤维细胞的三种细胞骨架成分蓝色为细胞核，绿色为微管7. miRNA靶基因的验证研究思路靶基因的验证研究思路研究思路研究思路 生物信息预测生物信息预测 Real time RT-PCR Western 双荧光报告系统验证双荧光报告系统验证 miRNA的表达上调的表达上调 miRNA的表达下调的表达下调生物信息预测生物信息预测 PicTar (http:

24、/pictar.mdcberlin) TargetScan () miRBase Targets ().Example 1Example 2二、二、RNA干扰及其机制干扰及其机制1. RNAi的定义的定义双链双链RNA抑制抑制基因的表达基因的表达2006年的诺贝尔生理学奖获得者：年的诺贝尔生理学奖获得者：RNA干扰干扰(RNA interference，RNAi) RNARNA干扰是干扰是dsRNAdsRNA介导的特异性基因表达沉默现介导的特异性基因表达沉默现象，是生物界一种古老而且进化上高度保守的基因象

25、，是生物界一种古老而且进化上高度保守的基因表达调节机制。表达调节机制。 19981998年首次发现将年首次发现将dsRNAdsRNA注入线虫可特异性抑制注入线虫可特异性抑制基因表达，并将这种由基因表达，并将这种由dsRNAdsRNA引发的抑制特定基引发的抑制特定基因表达现象称为因表达现象称为RNAiRNAi。 是由双链是由双链RNARNA（dsRNAdsRNA）介导的、由特定酶参与）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象的特异性基因沉默现象, ,它在转录水平、转录后水它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。平和翻译水平上阻断基因的表达。 其实质是通过双链其实质是通过双链RNARNA使目的使目的mRNAmRNA降解，从而降解，从而特异性地抑制目的蛋白表达。特异性地抑制目的蛋白表达。 Fluorescence micrographs show progeny(子代）子代）of injected animals from .Young larva (幼虫幼虫)Adult (成虫成虫)Control dsRNAds-gfp RNA2. siRNA的调控机制的调控机制双链双链RNA产生的产生的小干扰小干扰RNA可以关闭可以关闭基因的表达基因的表达RNAi silencingExogenous