第五章 茎尖培养与快速繁殖

1、第五章 茎尖培养与快速繁殖第一节 茎尖培养脱毒技术一、培育无病毒苗的意义植物病毒病：由病毒和类病毒、支原体等引起，已发现此类病害700多种，无性繁殖植物严重；无特效药，培育无毒种苗是主要防治措施。 获得无病毒种苗的途径：1）从现有种质中筛选无毒单株；2）已感染植株脱毒。二、植物脱毒的方法1. 热处理：病原物与植物耐热性不同，将植物在较高温度下处理一段时间，病原物钝化、失活或不能繁殖，而植物所受影响较小、生长较快，使病毒减少甚至消灭。方法：1) 温汤浸渍：50温水中浸10分钟数小时，简便易行，适用于休眠器官、接穗或种子。2) 热空气处理：在温热治疗室/箱内，3540，几十分钟数月。对茎尖效果较好

2、，热处理后取较大茎尖培养，可提高成活率与脱毒率。注意：易受伤，掌握温度与时间。2. 茎尖培养脱毒3. 其他途径脱毒3.1 愈伤组织培养脱毒：花器官、珠心胚等愈伤中存在无病毒细胞群，从再生植株可得到无病毒苗。3.2 茎尖微体嫁接脱毒：在无菌条件下，将切取的茎尖嫁接到培养的砧(zhen)木苗上。3.3 抗病毒剂的应用：抗病毒醚: 可抑制病毒复制和扩散，嘌呤和嘧啶类似物;抗菌素三、茎尖培养脱毒技术1、原理病毒在植物体内分布不均匀，茎尖等生长点因为无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞分裂和生长的速度，所以茎尖几乎不含病毒。茎尖培养脱毒效果好，后代稳定，目前广泛应用。2、脱毒技术2.1 操作取

3、无菌顶稍12 cm解剖镜(840倍)下剥去幼叶切取茎尖0.20.5 mm、带12个叶原基接种。注意：随切随接，防止变干；茎尖小较好，但太小不易成活，过大又不能保证完全脱毒。草莓：茎尖0.20.3mm，脱毒率100%；1mm，脱毒率50%。2.2 培养基基本培养基: MS、White、 B5等。碳源: 蔗糖效果好，可用白砂糖激素：2,4-D、IAA、NAA等，通常低浓度。2.3 继代培养 初代培养长成的新梢切成小段增殖培养基 1个月左右新梢又可扩繁 建立和维持茎尖无性系。继代培养常用MS培养基。2.4 生根与移栽 常用生根方法：用1/2、1/3、1/4MS或White培养基，附加NAA、IAA、

4、IBA等，最好加活性炭(0.3 )。 或者：将新梢基部浸入50100mg/L的IBA中4-8h，然后转入无激素培养基中生根。移栽：同前。3、脱毒苗的鉴定3.1 酶联免疫法 （ELISA）将抗原和抗体的免疫反应与酶的高效催化作用相结合，形成酶标记的免疫复合物；酶遇到底物后生色，用肉眼观察，或用比色法检测结果。灵敏度高，广泛应用。3.2 抗血清鉴定法用已知抗血清鉴定未知病毒的种类。3.3 指示植物法指示植物：对某种或某几种病毒/类病毒具有敏感反应，并表现明显症状的寄主植物，又称鉴别寄主。两类指示植物：一是产生系统性症状，病毒可扩展到非接种部位，常无局部病斑；二是只产生局部坏死、褪绿或环状斑。方法：

5、将脱毒苗汁液接种在指示植物上，根据病斑产生与否鉴别脱毒情况。只能鉴定靠汁液传染的病毒，草本接种较易，木本较难，用嫁接传染法。 3.4 分子生物学检测1）dsRNA分析2） 核酸分子杂交。3） PCR技术。3.5 电镜检查4、脱毒苗的保存与利用4.1 脱毒苗的保存脱毒植株可能很快被重新感染，应隔离繁殖与保存。原原种：经脱毒处理、检测无毒的植株；原种：由原原种在隔离条件下繁殖的种苗；由原种繁殖的脱毒苗供生产用。隔离措施：建立隔离带、防虫网室，土壤消毒。4.2 脱毒苗的利用尽量用染毒轻的生产场地，一旦感染，应重新采用无病毒苗。脱毒苗的繁育体系 流程 工作区域第一年 脱毒试管苗 无菌室 第二年 原原种

6、 无菌室第三年 原种 网室/温室第四年 良种 隔离区第五年 商品种 繁殖区 生产 生产大田 5. 中国组培脱毒苗生产现状已建立马铃薯（病毒病减产50%以上）、草莓、甘薯、苹果、葡萄、香蕉、菠萝、番木瓜、甘蔗等脱毒苗生产基地。脱毒苗通常增产2030%，草莓可达50%，且上等果比例高。第二节 茎段培养快速繁殖技术一、离体快繁的应用1、概念：将植物的器官和组织进行离体培养，使其快速成苗的技术，又叫微繁殖。应用：珍稀濒危植物名优特新品种脱毒苗转基因试管苗的快繁。林木、园艺、药用植物广泛应用，重点在无性繁殖植物。2、优缺点优点：1）繁殖系数高、速度快：扦插和嫁接每年几倍几十倍；离体快繁几万百万倍。2）繁

7、殖特殊材料：单倍体、三倍体，常规方法繁殖难。 3）可与脱毒技术相结合。4）生长一致，商品性好，可常年进行。缺点：操作复杂，设备昂贵，成本较高。二、离体快繁技术1.无菌培养物的建立常用带芽的茎段、茎尖或芽，某些植物用根、茎、叶或花器官等作外植体，接种培养，获得初代培养物。2. 茎芽的增殖以芽的增殖为主，可以不考虑根的生长。依外植体不同，初代培养获得茎芽有4种途径：1）顶芽/腋芽增殖：用茎尖或侧芽培养获得丛芽或芽苗，可加细胞分裂素促进之。草莓、香石竹、唐菖蒲、非洲菊、月季、苹果、葡萄、猕猴桃等。此途径较普遍。2）不定芽增殖：在根、茎、叶、愈伤等非芽固定生长位置产生的芽都叫不定芽。此途径较普遍。由愈

8、伤再生不定芽一般不可取（耗时、变异）。3）体胚增殖：有200多种植物可产生体胚，前景好，但目前很多物种还不成熟，成苗率低。4）原球茎增殖：兰科植物茎尖或侧芽培养形成球形块茎，一种特殊的繁殖体，本身可以增殖，转移到生根培养基上后长成小植株。 以兰花为例：兰花离体快繁：Morel提出了兰花离体无性繁殖方法。兰茎尖 原球茎 芽 根 （兰苗）原球茎: 类似于种子萌发时由胚形成的结构；将原球茎分割成小块后可快速产生新的原球茎，并可成苗。3. 壮苗、生根与移栽组培苗/嫩枝12cm高时进行。先壮苗后生根，即降低细胞分裂素浓度，增强光照等。问题：不易生根（延长时间、继代）；生根： 1/2或1/4 MS，减少或

9、去掉细胞分裂素，加适量NAA或IBA（吲哚丁酸）；减少蔗糖，增强光照。移栽：同前。4、存在问题1）外植体褐变原因：主要是外植体中的多酚氧化酶被激活，催化酚类生成醌类，醌经非酶促聚合，形成深色物质。危害：毒害细胞，影响外植体生长与分化，甚至死亡。影响因素：基因型、生理状态、外植体受伤程度、灭菌时间、培养基和培养条件。减轻褐变的措施：a. 外植体：选酚类含量低的基因型及幼龄材料剪取外植体液体预培养37d 取出用漂白粉等还原剂浸泡正式接种培养。 b. 培养基与培养条件：用低盐培养基，减少细胞分裂素，适当低温、弱光照，连续继代培养。c. 用褐变抑制剂和吸附剂：培养基中加Vc、聚乙烯吡硌烷酮（PVP，酚类专一吸附剂）、活性炭、半胱氨酸、柠檬酸、谷胱甘肽glu:t'aiun等抗氧化剂，或用SO2、亚硫酸盐、氯化钠等PPO (多酚氧化酶) 抑制剂。几种试剂混用效果可能更好。2）组培苗玻璃化症状：茎叶半透明或透明、水渍状，叶皱缩卷曲，植株矮小、失绿、含水多、脆弱易碎。原因：不清楚，基因型、培养基、细胞分裂素较高及弱光照、高温高湿、透气性差、继代次数过多等都有影响。降低玻璃化的措施：a. 增加琼脂或蔗糖，或加渗透剂，以提高培养基渗透压，使组培苗吸水困难；b. 降低细胞分裂素用量，加适量IAA、GA3、ABA；c. 减少NH4+、提高Ga2+含量；d. 增