课题一微生物的实验室培养

1、专题专题2 :2 :微生物的培养与应用微生物的培养与应用课题课题1 1：微生物的实验室培养：微生物的实验室培养一、基础知识一、基础知识（一）、培养基（一）、培养基 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养基质称培养基供其生长繁殖的营养基质称培养基 碳源：碳源：凡是作为微生物细胞结构或代谢产物中碳架凡是作为微生物细胞结构或代谢产物中碳架来源的营养物质，称为碳源。常见的碳源有：糖类等来源的营养物质，称为碳源。常见的碳源有：糖类等含碳有机物、二氧化碳等。其中有机碳为微生物提供含碳有机物、二氧化碳等。其中有机碳为微生物提供能量。能量。 氮源

2、：氮源：凡是构成微生物细胞的物质或代谢产物中氮凡是构成微生物细胞的物质或代谢产物中氮元素来源的营养物质。常见的碳源有：蛋白胨、牛肉元素来源的营养物质。常见的碳源有：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米浆膏、酵母膏、玉米浆 ，有的微生物能利用无机氮，有的微生物能利用无机氮 。1、培养基的基本成分、培养基的基本成分 无机盐：无机盐：无机盐也是微生物生长所不无机盐也是微生物生长所不可缺少的营养物质。其主要功能是：可缺少的营养物质。其主要功能是： 构成细胞的组成成分；构成细胞的组成成分； 作为酶的组成作为酶的组成成分；成分； 维持酶的活性；维持酶的活性； 调节细胞的调节细胞的渗透压、氢离子浓度和氧化还原电位。

3、渗透压、氢离子浓度和氧化还原电位。 常见的无机盐有：磷、硫、钾、钠、钙、常见的无机盐有：磷、硫、钾、钠、钙、镁、铁、锰、铜、钴、锌、钼镁、铁、锰、铜、钴、锌、钼 水：水：水是微生物的重要组成部分水是微生物的重要组成部分 生长因子：生长因子：对微生物有显著影响的微对微生物有显著影响的微量有机物。常见的有氨基酸、维生素、嘌量有机物。常见的有氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶及其衍生物呤、嘧啶及其衍生物 液体培养基：液体培养基：主要在生产中应用。主要在生产中应用。 固体培养基：固体培养基：用于菌种的鉴定和选择（可在用于菌种的鉴定和选择（可在 液体培养基的基础上再添加琼脂）液体培养基的基础上再添加琼脂） 半固

4、体培养基：半固体培养基：介于液体培养基与固体培养介于液体培养基与固体培养 基之间。基之间。 2 2、培养基的种类、培养基的种类（1 1）、按物理状态分）、按物理状态分（2 2）、按用途分）、按用途分选择培养基选择培养基：加入某种化学物质，从众多微：加入某种化学物质，从众多微生物中分离出所需微生物。生物中分离出所需微生物。鉴别培养基鉴别培养基：加入某种试剂，鉴别不同种类的：加入某种试剂，鉴别不同种类的微生物（伊红与美蓝使大肠杆菌显深紫色）微生物（伊红与美蓝使大肠杆菌显深紫色）加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基: :不加有机氮源的无氮培养基不加有机氮源的无氮培养基: : 不加含碳有机物的无碳培养

5、基不加含碳有机物的无碳培养基: : 几种选择培养基举例：几种选择培养基举例：分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌分离固氮菌分离固氮菌 分离自养型微生物分离自养型微生物唯一碳源为纤维素的培养基唯一碳源为纤维素的培养基分解纤维素的细菌分解纤维素的细菌（3 3）按培养基的成分来分）按培养基的成分来分 天然培养基：天然培养基：由天然物质制成的培养基。如：由天然物质制成的培养基。如：煮熟的马铃薯、腐乳制作豆腐。煮熟的马铃薯、腐乳制作豆腐。 半合成培养基：半合成培养基：在天然有机物的基础上适当在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类加入已知成分的无机盐类 。如：泡菜制作。如：泡菜制作。 合成

6、培养基：合成培养基：培养基的各种成分完全是已知培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。如：高氏一号合成培养基的各种化学物质。如：高氏一号合成培养基 物质物质牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨NaClNaCl琼脂琼脂水水重量重量5g5g10g10g5g5g20g20g定溶至定溶至1000mL1000mL二、无菌技术二、无菌技术 1 1、无菌技术：指在培养微生物的操作中，、无菌技术：指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法技术。所有防止杂菌污染的方法技术。 2 2、无菌技术的种类、无菌技术的种类 （1 1）消毒：使用较为温和的方法（酒精、）消毒：使用较为温和的方法（酒精、紫外线）来杀死物体表面和内部

7、的微生物。紫外线）来杀死物体表面和内部的微生物。 （2 2）灭菌：使用较为强烈的理化因素杀死）灭菌：使用较为强烈的理化因素杀死物体内外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。物体内外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。3 3、在微生物培养中需要进行无菌操作的环境、在微生物培养中需要进行无菌操作的环境与物品与物品对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁消毒；洁消毒；将培养皿、接种用具和培养基等进行灭菌；将培养皿、接种用具和培养基等进行灭菌；接种的过程要在酒精灯火焰附近进行灭菌。接种的过程要在酒精灯火焰附近进行灭菌。4 4、常用的消毒与灭菌的方法、常用的消毒与灭菌的方

8、法(1)(1)消毒的方法消毒的方法煮沸消毒法：煮沸消毒法：100100沸水煮沸水煮5-6min5-6min。巴氏消毒法：巴氏消毒法：70-75 70-75 煮煮30min30min；8080 煮煮15min15min化学试剂消毒法化学试剂消毒法: :酒精消毒、高锰酸钾溶液酒精消毒、高锰酸钾溶液消毒，甲醛消毒等消毒，甲醛消毒等紫外线消毒法：紫外线消毒法：紫外线消毒紫外线消毒30min30min，臭氧消，臭氧消毒。毒。 灼烧灭菌：灼烧灭菌：接种用具和接种过程中的试管口接种用具和接种过程中的试管口或瓶口放在酒精灯火焰的充分燃烧层中进行灼或瓶口放在酒精灯火焰的充分燃烧层中进行灼烧灭菌。烧灭菌。（2 2

9、）灭菌的方法）灭菌的方法 干热灭菌：干热灭菌：将玻璃器皿、金属用具等能耐将玻璃器皿、金属用具等能耐高温并需要保持干燥的物品放到干热灭菌箱高温并需要保持干燥的物品放到干热灭菌箱内，在内，在160160170170O OC C中加热中加热1 12h2h即可。即可。 高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌：将需灭菌的物品放到盛有水将需灭菌的物品放到盛有水的高压灭菌锅内煮沸，待冷空气排尽后，密闭的高压灭菌锅内煮沸，待冷空气排尽后，密闭继续加热至锅内压力到继续加热至锅内压力到100kPa100kPa，温度到，温度到121121O OC C后，后，维持维持151530min30min即可。即可。（一）制备牛肉膏蛋白胨

10、固体培养基（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.1.计算计算（按培养基的营养成分表计算配制（按培养基的营养成分表计算配制100mL100mL培养基）培养基）物质物质牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨NaClNaCl琼脂琼脂水水重量重量5g5g10g10g5g5g20g20g定溶至定溶至1000mL1000mL2.2.称量称量 准确称取各种成分，注意事项：牛肉膏要放在称量准确称取各种成分，注意事项：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。迅速，称后及时盖上瓶盖。三、实验操作三、实验操作 3.3.溶化：溶化：先将牛肉膏

11、连同称量纸一起放入烧杯，加少先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加自来水定溶至溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加自来水定溶至100mL100mL。 4.4.灭菌：灭菌：将配制好的培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉将配制好的培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），连同培养皿（塞，包上牛皮纸），连同培养皿（3 35 5套，用几层报纸套，用几层报纸包好）一起放到高压锅内灭菌

12、。包好）一起放到高压锅内灭菌。 5.5.倒平板：倒平板：待培养基冷却到待培养基冷却到5050O OC C左右时倒平板。左右时倒平板。倒平板操作的讨论倒平板操作的讨论 1.1.培养基灭菌后要冷却到培养基灭菌后要冷却到5050O OC C时倒平板。用时倒平板。用什么办法来估计培养基的温度？什么办法来估计培养基的温度？ 用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手时即可开始倒平板。时即可开始倒平板。 2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 3.3.平板

13、冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？用来培养微生物吗？为什么？ 空气中的微生物

14、可能在皿盖与皿底之间的空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。微生物。（二）纯化大肠杆菌（二）纯化大肠杆菌 微生物接种方法常见的有微生物接种方法常见的有平板划线法平板划线法和和稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。1.1.平板划线法平板划线法 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。表面。 在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称来

15、的肉眼可见的子细胞群体称菌落菌落。平板划线法获取的微生物经恒温培养后的生长情况平板划线法获取的微生物经恒温培养后的生长情况 （1 1）、为什么在操作的第一步以及划线之前）、为什么在操作的第一步以及划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环？要灼烧接种环？ 第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上

16、的菌种直接来源于上次划线的末次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后仍然要灼数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后仍然要灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。菌污染环境和感染操作者。平板划线法的讨论平板划线法的讨论 2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？再进行划线？ 以免接种环温度太高，杀死菌种。以免接种环温度太高，杀死菌种。

17、3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 2.2.稀释涂布平板法稀释涂布平板法 将菌液将菌液进行一系列的梯度进行一系列的梯度稀释稀释，然后，然后将不将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培

18、养基的同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面表面进行培养。进行培养。 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。面形成单个的菌落。 稀释涂布平板法操作过程分稀释涂布平板法操作过程分两个步骤两个步骤，即，即系列稀释操作系列稀释操作和和涂布平板操作涂布平板操作。系列稀释操作系列稀释操作101102103104105106 (1)(1)将分别盛有将分别盛有9mL9mL水的试管灭菌并编号。水的试管灭菌并编号。(2)(2)用移液管吸取用移液管吸取1mL1mL培养的菌液，注

19、入第二支试培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。(3)(3)从从10101 1倍稀释的试管中吸取倍稀释的试管中吸取1mL1mL稀释液，注入第稀释液，注入第三支试管中，重复步骤三支试管中，重复步骤2 2，直至到第六支试管。，直至到第六支试管。涂布平板操作涂布平板操作(1)(1)将涂布器浸在盛有将涂布器浸在盛有7070的酒精的烧杯中。的酒精的烧杯中。(2)(2)取少量菌液（不超取少量菌液（不超0.1mL0.1mL），滴加到培养基表面。），滴加到培养基表面。(3)(3)将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷将沾有酒精的涂布器在火焰上

20、引燃，火熄后冷却却8 810s10s。(4)(4)用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。稀释涂布平板法获取的大肠杆菌菌落稀释涂布平板法获取的大肠杆菌菌落 1.1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？果有菌落生长，说明了什么？ 未接种的培养基在恒温箱中保温未接种的培养基在恒温箱中保温1 12 d2 d后无后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。需要重新制备。 2.2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似吗？独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似吗？ 如果接种成功的话，在培养基的表面可观察如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。到大小、形状、颜色相似的菌