细胞培养入门

1、细胞培养总结新手首次培养细胞首先要让负责人（负责带你的那个人或细胞间管理者）带你操作数次，完全清楚操作流程及注意事项后方可自己独立操作。超净工作台常规配置1. 移液器1套（2.5l、10l、200l、1ml），酒精灯1台，负压吸液器1台，离心管架一1个，酒精棉球缸1个，酒精喷壶1个，废液缸缸1个，吸头一套（白黄蓝各一盒）。2. 常规耗材：培养瓶（50 cm2），培养皿（35、60、100 mm），6/24/48/96孔板，冻存管。3. 所需试剂：培养基（DMEM/F12 1:1、DMEM高糖、RPMI1640等），胎牛血清（FBS），双抗（青霉素+链霉素），DMSO胰酶，75%酒精实验前准备1

2、. 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内；2. 用酒精喷壶喷洒实验台面，打开超净台和细胞间紫外灯，照射30min。3. 配置所需培养基（培养基的配置：基础培养基+胎牛血清（FBS）+双抗，不同种类细胞所用基础培养基种类和血清比例可能不同，个别种类细胞需要添加EGF、TGF等细胞因子，培养基配制要根据需要量按照比例酌量配置，配完的置于37预热。首次传代前细胞的复苏1. 打开水浴锅预热到37，将装有细胞的冻存管从液氮中拿出，迅速置于37水浴锅，连续晃动，1 min内迅速融化。2. 开启超净台正常工作状态（开前窗，通风，开照明灯），用酒精消毒操作者的双手，戴上一次性橡胶手套，用酒精消毒。3. 将所

3、需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧。（若是一次性培养皿（瓶）就不需要此操作了）。4. 将融化的细胞液转入含有5mL培养基的15mL离心管，800 r/min, 离心5 min。5. 去掉上清，加入适量培养基吹打均匀，传入细胞培养皿（瓶），培养瓶需要旋开瓶口少许。6. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。7. 将培养皿置入37，5% CO2培养箱。12小时候查看细胞状态及密度。注意整个培养箱底托盘内一定要放高

4、压后的水，且定期更换确保无菌。在达到传代密度之前如果细胞培养基颜色由鲜红色变为红棕色或黄色，说明细胞代谢废物增多，需要更换培养基（注意，培养基颜色变黄也有可能是细胞被污染，要及时处理掉）。培养液的更换1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手，戴上一次性橡胶手套，用酒精消毒。2. 将所需的培养基（已预热）确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯。将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，瓶盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，3. 4用移液器悬空进入培养基瓶内吸取适量培养基再悬空移入

5、培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放。4. 5 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。5. 将培养瓶放于37,5% CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。每天观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度达到90%，即可进行细胞的传代。细胞传代1 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手，戴上一次性橡胶手套，用酒精消毒。2 将所需的培养基和胰酶（已预热）确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯。3. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-

6、3次，瓶盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，4用移液器悬空进入培养基瓶内吸取适量培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放。5 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。6. 将培养瓶放于37,5% CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代或保株（冻存）。细胞株的保存（细胞冻存）1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手，戴上一次性橡胶手

7、套，用酒精消毒。2. 将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯。3. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，竖直放好。用移液器吸取适量胰酶，悬空移入培养瓶内，使胰酶浸没整个瓶壁的细胞层，37孵育约1 min，晃动几下培养瓶，在显微镜下观察若细胞触角消失，细胞间出现间隙并有少量细胞脱落，这时为胰酶消化的最适时机，加入含血清培养基终止消化，用移液器反复轻轻吹打2-3遍即可将细胞悬浮。若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度，若看不到缝隙和细胞脱落，则需继续消化。4.

8、将细胞悬液移入离心管离心，去掉上清后加入适量冻存液，吹打均匀后分装到冻存管（不能装满）。5. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。6. 将保种管先放于4冰箱 30min后拿出放置-20冰箱过夜，次日再放于-80的冰箱内3-4天，最后存放于-196的液氮灌内长期保存。此过程也可简化：步骤5结束后将保种管用干脱脂棉包裹后直接放于-80冰箱内过夜，放于液氮灌保存（也可以放在装有异丙醇的冻存盒，-80过夜后转到液氮）。-80冰箱冻存可保存细胞株2-3月。若是要用药物处理细胞，则需要按照实验目的和要求将细胞以和适的密度传到细胞培养板（6/

9、12/24/96 wells），不同实验选用培养板不同，细胞密度也不同，处理时间长/抑制增殖类实验就稍稀一点,反之则密一点，在处理结束时细胞刚好长满最好。细胞计数（血球计数板法）计数原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。计数板基本构造：细胞计数常使用方法1（数四角四个大格中细胞数），细菌计数使用方法2（数中间大格中的五个中格中细胞数）。具体操作：1. 将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。2. 将细胞悬液（吹打均匀）吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能

10、让悬液流入旁边槽中。3. 计算板4角的4个大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：细胞密度=细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104×稀释倍数说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以104因为计数板中每一个大方格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3=10-4ml注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液细胞污染简述细胞培养中常见的生物污染类型有7种，分别是细菌污染、支原体污染、原虫污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒

11、污染以及非细胞污染。他们在细胞培养中污染的特点如下：1. 细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。2. 支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。3. 霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用

12、硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗清水擦洗75%精擦洗紫外灯照。预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。将环境彻底消毒，如果所有细胞

13、都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作4. 真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。5. 黑胶虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的

14、血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。6. 原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以搜索生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。7. 病毒：组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。 尽管病毒污染

15、的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题 8. 非同种细胞污染 ：即是细胞交叉污染，由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。培养器皿规格以及接种密度细胞培养瓶 细胞瓶面积容量 工作体积 长满后细胞数目6 12.5cm2 25ml 2ml5×10 525cm250ml 5ml 1×10 6835cm275ml 10ml2×10 6, . J75 cm2250ml15ml 4× 10 68 o9 _8 150cm2 700ml 40ml1.1×107补充：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在23mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量。若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加